李靜,陳井生,郭永霞,3,周園園,3,曹尚
(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),大慶 163319;2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心;3.黑龍江省作物有害生物互作生物學(xué)及生態(tài)防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4.重慶三峽學(xué)院)
大豆胞囊線蟲(chóng)(Soybean cyst nematode,SCN)病,是危害世界大豆生產(chǎn)的最主要病害之一。研究發(fā)現(xiàn),大豆胞囊線蟲(chóng)的二齡幼蟲(chóng)侵入植物的根系后,會(huì)引起根系組織的機(jī)械損傷和代謝紊亂,感病的大豆會(huì)表現(xiàn)出根系短粗,植株矮化、萎黃和不易結(jié)實(shí)等癥狀[1]。大豆胞囊線蟲(chóng)是一種典型的定居性?xún)?nèi)寄生線蟲(chóng),對(duì)大豆等重要油料作物危害嚴(yán)重。由于線蟲(chóng)分布廣泛,生存能力強(qiáng),危害性大等特點(diǎn),防治相對(duì)困難。大豆胞囊線蟲(chóng)除了對(duì)大豆造成危害外,還可以在其它500多個(gè)作物種類(lèi)上寄生。主要為害的作物是豆科,如:菜豆、兵豆、箭舌豌豆、香豌豆、豌豆等[2]。
紅小豆(Vigna angularis),學(xué)名赤豆,因種皮呈紅色,又名赤小豆、朱豆,是豆科一年生、直立或纏繞草本植物。我國(guó)的紅小豆種植面積和總產(chǎn)量均居世界首位[3]。紅小豆?fàn)I養(yǎng)豐富,富含淀粉、蛋白質(zhì)、鐵、鈣、磷、鉀等礦物質(zhì)元素,脂肪含量低。同時(shí)現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),紅小豆對(duì)人體有顯著的抗氧化、護(hù)肝護(hù)腎、抗癌、降血壓降膽固醇、抗菌抗病毒等多種作用。由于紅小豆是醫(yī)食同源作物,且紅小豆的價(jià)格比主要糧食作物高、投入少,對(duì)農(nóng)民來(lái)說(shuō),紅小豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物,也是欠發(fā)達(dá)地區(qū)脫貧攻堅(jiān)的主要收入來(lái)源。因此,保證紅小豆的產(chǎn)量對(duì)于農(nóng)民來(lái)說(shuō)是非常重要的。近些年,關(guān)于紅小豆的研究開(kāi)始逐漸增多[4]。然而,紅小豆上的病害逐年增加,每年因病害引起的減產(chǎn)問(wèn)題十分嚴(yán)重。紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)病也嚴(yán)重影響了小豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。然而,農(nóng)民對(duì)該病缺乏了解,導(dǎo)致未能及時(shí)有效地預(yù)防該病,造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失?,F(xiàn)階段,關(guān)于大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)紅小豆的致病性不明確,在紅小豆根內(nèi)的發(fā)育狀況尚無(wú)報(bào)道,大豆和紅小豆胞囊線蟲(chóng)的侵染差異也尚不清楚。
大豆胞囊線蟲(chóng)(Heterodera glycines Ichinohe)是一種土傳內(nèi)寄生線蟲(chóng)[5],是危害全球大豆生產(chǎn)的主要病害之一,由俄羅斯植物病理學(xué)家Jaczevski 在中國(guó)東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)[6]。大豆胞囊線蟲(chóng)由卵孵化,一齡幼蟲(chóng)(J1)在卵內(nèi)發(fā)育,二齡幼蟲(chóng)(J2)在15~30 ℃開(kāi)始發(fā)育[7],幼蟲(chóng)侵染大豆根并在根內(nèi)寄生生活[8],定殖后蟲(chóng)體開(kāi)始膨大,經(jīng)過(guò)蛻皮,三齡、四齡幼蟲(chóng)出現(xiàn)。雌蟲(chóng)與雄蟲(chóng)交配最后一次蛻皮后,蟲(chóng)體發(fā)育為成蟲(chóng),完成一個(gè)世代的發(fā)育循環(huán)[9]。該病害可使通常會(huì)使中國(guó)東北大豆產(chǎn)量減少5%~100%[10]。隨著大豆種植面積的逐年增加,大豆胞囊線蟲(chóng)病每年給全球造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)16.2 億美元[11]。大豆胞囊線蟲(chóng)的世代受溫度和季節(jié)的影響,如果溫度條件適宜,它完成一個(gè)世代大約需要25~30 d 的時(shí)間。由于溫度的影響,在北方地區(qū),如東北,大豆胞囊線蟲(chóng)一年可發(fā)生3~4 代,第一代歷時(shí)55 d[12],在南方一年可發(fā)生4~5 代。但是,在不同植物中,其發(fā)育周期略有不同。
研究以大豆和紅小豆為試驗(yàn)材料,在根部接種二齡幼蟲(chóng)。取樣后,用次氯酸鈉-酸性品紅染色法對(duì)根組織中的線蟲(chóng)進(jìn)行染色,并在體視顯微鏡下對(duì)各齡期的根部線蟲(chóng)數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù),明確大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)于紅小豆的侵染情況,大豆胞囊線蟲(chóng)在大豆和紅小豆根部的發(fā)育動(dòng)態(tài)揭示了大豆胞囊線蟲(chóng)在紅小豆根部的發(fā)育過(guò)程和完成一個(gè)生活史所需的大致時(shí)間,為大豆胞囊線蟲(chóng)在紅小豆上的有效防治提供了科學(xué)的理論依據(jù)。
1.1.1 供試品種
試驗(yàn)所用的大豆品種為合豐50,由黑龍江省農(nóng)科院大慶分院提供;
試驗(yàn)所用的紅小豆種質(zhì)資源為北7,由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物育種研究室提供。
1.1.2 供試線蟲(chóng)
試驗(yàn)所用到的胞囊為黑龍江省農(nóng)科院大慶分院胞囊線蟲(chóng)發(fā)病土壤分離獲得。胞囊置于自制孵化池中孵化。
大豆胞囊線蟲(chóng)胞囊和J2 的獲得如下:
土壤樣品采集自黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實(shí)驗(yàn)基地,采用改良淘洗-過(guò)篩法[13]進(jìn)行胞囊分離。具體方法是:用2 000 mL 燒杯取適量的大豆根際病土,置于淘洗桶中。加入適量水?dāng)嚢杈鶆?。靜置10~20 s 后,依次通過(guò)堆疊的20 目、40 目、60 目、80 目金屬篩,用強(qiáng)水流將金屬篩上的雜物從20 目洗至40 目。再將80 目篩上的殘留物反復(fù)沖洗至水流清為止。于體式顯微鏡下挑取飽滿的胞囊。挑好的胞囊用0.5%NaClO 溶液消毒3~4 min,無(wú)菌水沖洗3 次。干燥后,將胞囊儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中,備用。
大豆胞囊線蟲(chóng)懸液的制備:將胞囊放入自制的滅菌孵化池,將孵化池置于滅菌的培養(yǎng)皿中,向培養(yǎng)皿中加入適量無(wú)菌水,于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵化,期間更換無(wú)菌水,及時(shí)收集孵化出的二齡幼蟲(chóng)(J2),置于4 ℃冰箱內(nèi)備用。
1.2.1 大豆胞囊線蟲(chóng)感染紅小豆田間驗(yàn)證
試驗(yàn)選紅小豆種質(zhì)資源為北7,播種于黑龍江省農(nóng)科院大慶分院實(shí)驗(yàn)基地田間自然發(fā)病圃,于胞囊顯嚢期,將植株連根挖出,保持根系完整,調(diào)查根上胞囊數(shù)量。
1.2.2 大豆胞囊線蟲(chóng)接種
采用盆栽試驗(yàn),用0.5% NaClO 對(duì)供試大豆和小豆種子進(jìn)行表面滅菌3 min,并用無(wú)菌水沖洗。將供試大豆種子和紅小豆種子用濕潤(rùn)的醫(yī)用紗布包裹,置于培養(yǎng)皿中,30 ℃條件下催芽,期間及時(shí)換水。待種子芽長(zhǎng)2~3 cm 左右時(shí),將種子播種于裝有經(jīng)過(guò)高溫滅菌砂土(體積比1∶2)的黑色塑料缽中。待植株長(zhǎng)至兩葉期,分別在幼苗根部接種J2 懸浮液約(600 條·mL-1)1 mL。接種后每3 d 取一次樣,每次取5 株,進(jìn)行根組織染色并計(jì)數(shù)。
1.2.3 植物根組織中線蟲(chóng)的染色并計(jì)數(shù)
參照劉維志[14]方法,采用NaClO-酸性品紅對(duì)侵入根組織內(nèi)的線蟲(chóng)進(jìn)行染色,將洗凈的植株根系置于1.5%NaClO 溶液中浸泡5 min 后,用清水沖洗30 s以便去除根系表面殘留的NaClO,于蒸餾水中浸泡15 min。將根系轉(zhuǎn)入盛有酸性品紅的100 mL 的燒杯中,煮沸1~5 min,冷卻后用自來(lái)水沖洗根系表面的殘留的品紅,然后轉(zhuǎn)移到盛有100 mL 酸性甘油(甘油中加幾滴5 mol·L-1HCl)的燒杯中加熱褪色1~5 min,于體視解剖鏡下鏡檢大豆和紅小豆根內(nèi)線蟲(chóng)的數(shù)量及發(fā)育動(dòng)態(tài)。
1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
分別計(jì)算每顆大豆根組織和紅小豆根組織中的各蟲(chóng)態(tài)數(shù)量,即群體密度;統(tǒng)計(jì)各取樣時(shí)期各蟲(chóng)態(tài)的平均群體密度,并利用origin 2018 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
大豆胞囊線蟲(chóng)侵染紅小豆后紅小豆的整株癥狀和地下部癥狀見(jiàn)圖1,可以看到大豆胞囊線蟲(chóng)侵染紅小豆后,紅小豆地上部葉片缺綠,植株矮小,根系發(fā)育不良,主根長(zhǎng)勢(shì)弱,根部著生大量白色胞囊。
圖1 大豆胞囊線蟲(chóng)危害紅小豆植株的癥狀Fig.1 Symptoms of soybean cyst nematode endangering adzuki bean plants
圖2 是紅小豆根內(nèi)不同齡期線蟲(chóng),圖A 為接種后5 d 時(shí)紅小豆根內(nèi)的二齡幼蟲(chóng)(J2),蟲(chóng)體細(xì)長(zhǎng)線條狀,寄生在紅小豆根內(nèi)維管束中;圖B 為接種后10 d時(shí)紅小豆根內(nèi)的三齡幼蟲(chóng)(J3),蟲(chóng)體逐漸膨脹呈臘腸狀;圖C 為接種后20 d 時(shí)紅小豆根內(nèi)的四齡幼蟲(chóng)(J4),蟲(chóng)體繼續(xù)膨大,呈豆莢狀;圖D 和E 接種后28 d 時(shí)紅小豆根內(nèi)的雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng),雌雄蟲(chóng)形態(tài)不同,雌蟲(chóng)呈檸檬形或近圓形,雄蟲(chóng)呈細(xì)長(zhǎng)蠕蟲(chóng)狀,彎曲盤(pán)繞在紅小豆根組織內(nèi)。
圖2 不同齡期線蟲(chóng)在紅小豆根內(nèi)發(fā)育情況Fig.2 The development of nematodes at different ages in the roots of Adzuki bean
大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)J2、J3、J4的群體密度變化見(jiàn)圖3。由圖3(a)可知,在3 d 時(shí),在大豆和紅小豆根組織中均已出現(xiàn)二齡幼蟲(chóng),根內(nèi)侵染的線蟲(chóng)數(shù)量分別為25.8 條·株-1和20.0 條·株-1。在大豆的根組織內(nèi),J2 群體密度在第9 天時(shí)出現(xiàn)高峰,為55.4 條·株-1,此后J2 數(shù)量開(kāi)始減少,18 d 時(shí)最少。而在紅小豆根組織中,J2 群體密度在第12 天時(shí)最大,為87.6 條·株-1,此后數(shù)量逐漸減少,18 d 時(shí)數(shù)量最少。
由圖3(b)可知,J3 在大豆和紅小豆根組織中都最早出現(xiàn)在第6 天,侵染數(shù)量分別為0.2 條·株-1和1.4 條·株-1。在大豆根組織中,J3 群體密度在第12 天時(shí)達(dá)到高峰,侵染數(shù)量為60.4 條·株-1;此后J3 數(shù)量減少,持續(xù)到第27 天。在紅小豆根組織中,J3 群體密度在第18 天時(shí)出現(xiàn)高峰,數(shù)量為49.8 條·株-1,此后J3 數(shù)量減少,持續(xù)到第27 天。
由圖3(c)可知,大豆和紅小豆根組織中的J4 都出現(xiàn)在18 d,侵染數(shù)量分別為2.4 條·株-1和5.4 條·株-1。在大豆的根組織中,J4 群體密度在第24 天時(shí)出現(xiàn)高峰,為35 條·株-1;此后J4 數(shù)量開(kāi)始減少,至30 d 為8.2 條·株-1。在紅小豆根組織內(nèi),J4 群體密度在第24 天出現(xiàn)高峰,為32 條·株-1;此后數(shù)量開(kāi)始減少,至30 d為2.4 條·株-1。
圖3 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的群體動(dòng)態(tài)Fig.3 Population dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue
大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)J2、J3、J4的發(fā)育動(dòng)態(tài)變化見(jiàn)圖4。大豆和紅小豆根內(nèi)線蟲(chóng)在接種3 d 后開(kāi)始侵入,均為J2 幼蟲(chóng)。接種6 d 后,大豆和紅小豆根內(nèi)開(kāi)始出現(xiàn)J3,但仍以J2 幼蟲(chóng)為主。接種9 d 后,大豆根內(nèi)J2 的數(shù)量達(dá)到了峰值,為55.4 條·株-1。接種12 d 后,紅小豆根內(nèi)J2 幼蟲(chóng)最多,為87.6 條·株-1,大豆根內(nèi)的J2 幼蟲(chóng)開(kāi)始減少,J3 幼蟲(chóng)數(shù)量增加并且達(dá)到高峰,數(shù)量為60.4 條·株-1。
從圖4 可以看到,9 d 后大豆根內(nèi)和紅小豆根內(nèi)J2 的數(shù)量開(kāi)始減少,并且都是在接種后第6 d 檢測(cè)到J3,18 d 檢測(cè)到J4,說(shuō)明從J3 發(fā)育到J4 約9 d。但是在大豆根組織內(nèi)J3 在第12 d 達(dá)到發(fā)育高峰,J4 在24 d 時(shí)達(dá)到高峰,在大豆根組織中J3 發(fā)育高峰到J4 發(fā)育高峰歷經(jīng)12 d;在紅小豆根內(nèi)J3 在第18 d時(shí)達(dá)到高峰;J4 的發(fā)育高峰在24 d,在紅小豆根組織中J3 發(fā)育高峰到J4 發(fā)育高峰歷經(jīng)6 d??梢钥闯黾t小豆根組織中J3 到J4 的發(fā)育時(shí)間較短,大豆根內(nèi)大豆胞囊線蟲(chóng)的發(fā)育進(jìn)程要長(zhǎng)于紅小豆根內(nèi)的大豆胞囊線蟲(chóng)。
圖4 大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的發(fā)育動(dòng)態(tài)Fig.4 The developmental dynamics of soybean cell cystic worms in soybean and Adzuki bean root tissue
由圖3(d)可知,大豆在接種后21,24,27,30 d檢測(cè)到成熟雌蟲(chóng),且在30 d 是部分大豆根組織內(nèi)還有未發(fā)育完成的雌蟲(chóng)。紅小豆在接種后21,24,27 d檢測(cè)到成熟雌蟲(chóng),在第30 天時(shí)部分紅小豆根組織內(nèi)已無(wú)成熟雌蟲(chóng)。說(shuō)明在研究中,在大豆根組織內(nèi),大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成熟雌蟲(chóng)大約需要21~30 d 以上的時(shí)間,而在紅小豆根組織內(nèi),大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成熟雌蟲(chóng)大約需要21~27 d 的時(shí)間。但這只代表部分發(fā)育較快線蟲(chóng)完成其生活史所需要的時(shí)間,不能代表線蟲(chóng)的一個(gè)發(fā)生世代。
大豆胞囊線蟲(chóng)病是危害大豆產(chǎn)量的一個(gè)重要因素,大豆胞囊線蟲(chóng)侵染大豆根系引起病害,導(dǎo)致大豆植株矮化發(fā)黃,影響產(chǎn)量[15]。研究表明,大豆胞囊線蟲(chóng)寄主范圍廣,能侵染大部分豆科植物以及一些豆區(qū)不常見(jiàn)植物[11],研究通過(guò)對(duì)大豆和紅小豆上大豆胞囊線蟲(chóng)侵染情況進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)的群體動(dòng)態(tài)不同,紅小豆上J2的群體密度高峰大于大豆上的J2 的群體密度,且在紅小豆根系中大豆胞囊線蟲(chóng)各蟲(chóng)態(tài)發(fā)生量均明顯較高,因此,在條件適宜的情況下,大豆胞囊線蟲(chóng)在紅小豆上的發(fā)病程度不次于大豆。紅小豆種植面積不斷加大,線蟲(chóng)病害發(fā)生日趨嚴(yán)重,但該病害發(fā)生于植株根部,常常被人們忽視,因此,對(duì)該病害的有效防治也越來(lái)越重要。
在中國(guó),大豆胞囊線蟲(chóng)在大豆上1 年發(fā)生3~4或6 代。在美國(guó)明尼蘇達(dá)州南部大豆上大豆胞囊線蟲(chóng)能夠完成3~4 代[16]。在研究中,從大豆和紅小豆根組織中大豆胞囊線蟲(chóng)J2、J3、J4 的發(fā)育動(dòng)態(tài)變化可以看到,J2、J3 在紅小豆中的出現(xiàn)高峰都比大豆要晚,而J4 出現(xiàn)的高峰要早??芍t小豆中J3 到J4 的發(fā)育時(shí)間較短。究其原因,大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)不同寄主的適合性和致病性存在差異[17],研究中,大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)紅小豆侵染這方面的探討未見(jiàn)報(bào)道,大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)大豆和紅小豆的侵染存在一定的差異,適宜條件下,紅小豆內(nèi)的大豆胞囊線蟲(chóng)發(fā)育更快,更快的出現(xiàn)雌蟲(chóng),并進(jìn)入下一個(gè)侵染循環(huán)。
在22~23 ℃下,SCN 完成1 個(gè)世代需要21~27 d[18],Niblack 等[19]指出,理論上大豆胞囊線蟲(chóng)在1 個(gè)大豆生長(zhǎng)季可以完成6 代,具體代數(shù)主要取決于寄主適合性、播種時(shí)間、雜草寄主狀況和土壤溫度等條件。試驗(yàn)對(duì)大豆和紅小豆根組織中線蟲(chóng)染色,鏡檢各齡期線蟲(chóng)數(shù)量發(fā)現(xiàn),大豆內(nèi)的大豆胞囊線蟲(chóng)完成第一個(gè)生活史大概需要21~30 d。這與已報(bào)道的大豆胞囊線蟲(chóng)完成一個(gè)世代為21~27 d 的結(jié)論一致[20]。研究表明,在接種J2 后21、24、27 d,在紅小豆中檢測(cè)到成熟雌蟲(chóng),而在紅小豆根組織內(nèi),大豆胞囊線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)發(fā)育為成熟雌蟲(chóng)大約需要21~27 d 的時(shí)間。因此,適宜條件下,紅小豆內(nèi)的部分發(fā)育較快的大豆胞囊。
國(guó)內(nèi)外對(duì)于大豆上大豆胞囊線蟲(chóng)的侵染、發(fā)育動(dòng)態(tài)、發(fā)生世代的報(bào)道有很多,人們知道大豆胞囊線蟲(chóng)是如何侵染大豆、線蟲(chóng)的發(fā)生世代以及對(duì)于大豆上大豆胞囊線蟲(chóng)的防治方法[21]。但是對(duì)于紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)的侵染、發(fā)育動(dòng)態(tài)的研究未見(jiàn)報(bào)道。研究明確了大豆胞囊線蟲(chóng)對(duì)于紅小豆的侵染情況,并根據(jù)大豆胞囊線蟲(chóng)在大豆和紅小豆根內(nèi)的發(fā)育動(dòng)態(tài),明確了紅小豆根內(nèi)線蟲(chóng)的發(fā)育進(jìn)程,為有效防治紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)病提供了理論依據(jù)。
紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)的研究國(guó)內(nèi)一直未見(jiàn)報(bào)道,說(shuō)明農(nóng)民對(duì)于紅小豆上大豆胞囊線蟲(chóng)的危害并不清楚,研究證明了大豆胞囊線蟲(chóng)會(huì)造成紅小豆地上部葉片缺綠,植株矮小,根系發(fā)育不良,主根長(zhǎng)勢(shì)弱。因此,對(duì)于紅小豆上大豆胞囊線蟲(chóng)病的防治不可忽視。藥劑防治大豆胞囊線蟲(chóng)時(shí),要結(jié)合線蟲(chóng)各齡期的發(fā)育情況。掌握好使用藥劑的時(shí)間,才能達(dá)到理想的防治效果[20]。控制大豆胞囊線蟲(chóng)蟲(chóng)口密度的關(guān)鍵時(shí)期是在線蟲(chóng)侵染第一個(gè)高峰期出現(xiàn)時(shí)[22],根據(jù)研究數(shù)據(jù)表明,線蟲(chóng)侵染紅小豆的第12 d 是J2 數(shù)量的高峰,由于試驗(yàn)接種的是已經(jīng)孵化出的二齡幼蟲(chóng)。因此,田間防治紅小豆上的大豆胞囊線蟲(chóng)病時(shí),應(yīng)在紅小豆出苗后及時(shí)調(diào)查,加強(qiáng)防治,以保證防治達(dá)到理想效果。