黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮炎的干預(yù)作用及其機制*

陳若璽， 鄭 勝， 郭春燕， 張 強

(福建醫(yī)科大學附屬龍巖第一醫(yī)院皮膚科， 龍巖 364000)

銀屑病是一種炎性表皮過度增生性皮膚病，影響全球約2%～3%的人口，復(fù)發(fā)率高[1]。臨床上，其特征是表皮角質(zhì)細胞增生、角化不全和大量白細胞的皮膚浸潤，表現(xiàn)為皮膚表面有紅斑和鱗狀斑塊[2]。大量研究表明，細胞因子在銀屑病進程中具有重要作用，白細胞介素(IL)-17、IL-22、IL-23和腫瘤壞死因子(TNF-α)的表達水平升高，誘導(dǎo)皮膚角質(zhì)形成細胞的過度增殖[3, 4]。

咪喹莫特(imiquimod，IMQ)，屬咪唑喹啉類化合物，是一種小分子免疫調(diào)節(jié)劑。咪喹莫特可作為Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)激動劑激活宿主的免疫反應(yīng)，引起免疫調(diào)節(jié)相關(guān)細胞因子的轉(zhuǎn)錄，被發(fā)現(xiàn)可以通過IL-23/IL-17炎性反映軸、IL-27誘導(dǎo)自然殺傷細胞分泌Ⅱ型干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、TNF-α、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)粘附分子、趨化因子等多條途徑參與銀屑病樣皮炎的發(fā)生過程[5, 6]。由于其致病過程較為直接，發(fā)病速度快，故目前也有利用咪喹莫特造模小鼠銀屑病樣皮炎模型的實驗應(yīng)用。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)黃芪中含多糖、皂甙、黃酮、氨基酸等多種有效成分，這些活性成分均有促進抗體生成和免疫反應(yīng)的作用，其中以對黃芪多糖(astragalus polysacharin，AP)的研究報道為多[7-9]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，已有研究表明，黃芪多糖具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫功能的作用，本文旨在探討黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎的干預(yù)作用及其機制，為黃芪多糖在臨床上用于治療銀屑病樣皮炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康C57BL/6小鼠40只，雌性，6～8周齡，由南京大學模型動物研究中心提供。將小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，小鼠在保持12 h的明暗循環(huán)，給予正常小鼠飼料與滅菌水適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

1.2 主要試劑及儀器

黃芪多糖(批號：20170916，合肥中龍神力動物藥業(yè)有限公司)；麗科杰咪喹莫特乳膏(湖北科益藥業(yè)股份有限公司，貨號：120710)；醫(yī)用白凡士林(南京特納斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號：20180130)；小鼠TNF-α(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-M0049c)ELISA檢測試劑盒；小鼠IL-1β(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-M0037c)ELISA檢測試劑盒；小鼠IL-6(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號：E-EL-M0044c)ELISA檢測試劑盒。

微型高速離心機(美國Labnet，型號C2500-R-230V)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本ASONE，型號ICV-450)，全自動酶標儀(美國Thermo Scientific，型號Multiskan MK3)，全自動全封閉組織脫水機(型號：Leica ASP200S)；石蠟包埋機(型號：Leica EG1150H)；半自動輪轉(zhuǎn)式切片機(型號：Leica RM2245)；全自動染色機(型號：Leica Autostainer XL)；全自動玻片封片機(型號：Leica CV5030)。

1.3 小鼠銀屑病模型的建立及分組設(shè)計

40只雌性C57BL/6小鼠隨機分為空白對照組、模型組、黃芪多糖高劑量組(200 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)和低劑量組(50 mg/kg)，共5組，每組8只。從小鼠背上刮去2 cm×2 cm面積的皮毛，除空白對照組外，用玻璃棒將5%咪哇莫特乳膏涂抹于其他各組小鼠背部，涂抹劑量為62.5 mg，1次/日，連續(xù)6 d。在建模的同時對各組實驗小鼠進行分別給藥，給藥的方式為灌胃。空白對照組、模型組小鼠灌胃等體積的0.9%生理鹽水；黃芪多糖高、中、低劑量組分別給予黃芪多糖(200 mg/kg)、黃芪多糖(100 mg/kg)、黃芪多糖(50 mg/kg)。給藥的容積均為 10 ml/kg 體質(zhì)量，1次/日，連續(xù)給藥6 d。于實驗第7日，小鼠麻醉后剪取背部皮膚，摘眼球取血，分離血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 小鼠皮損 PASI 評分

小鼠銀屑病模型評分標準根據(jù)臨床銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(PASI)進行客觀評分系統(tǒng)。將紅疹分為0 - 4級，0為無；1為輕微；2為中等；3為嚴重；4為非常嚴重[10]。每天記錄體重和得分。

1.5 ELISA檢測

用ELISA試劑盒檢測血清樣品中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。具體方法嚴格按照試劑盒操作說明。

1.6 實時定量PCR實驗

每組樣品加入1 ml Trizol，待細胞充分裂解，每組加入250 μl氯仿，常溫靜置5 min 后離心20 min。離心結(jié)束后，每組樣品加入相同體積的異丙醇，常溫靜置 5 min后離心30 min。離心結(jié)束后，除去上清，用75 %乙醇洗滌沉淀2次，常溫通風處晾干，即得到RNA樣品。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)說明書配置PCR反應(yīng)體系，使用熒光定量PCR儀進行Real-Time PCR，反應(yīng)程序為：預(yù)變性，50℃ 2 min；解鏈，95℃ 10 min；PCR反應(yīng)，95℃ 15 s，45個循環(huán)；60℃ 1 min。收集熒光實時定量 PCR數(shù)據(jù)，并分析結(jié)果。引物序列如下：TNF-α forward: 5’-CTGAACTTCGGGGTGATCGG-3’；TNF-α reverse: 5’-GGCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3’；IL-1β forward: 5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’；IL-1β reverse: 5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；IL-6 forward: 5’-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3’；IL-6 reverse: 5’-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3’；β-actin forward: 5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；β-actin reverse: 5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.7 流式細胞術(shù)

分離小鼠腋窩淋巴結(jié)，制備單細胞懸液。使用FACS緩沖液中的表面抗原抗體進行表面染色，然后用適當?shù)目贵w在冰上染色30 min。使用活性染料消除死亡細胞。細胞內(nèi)細胞因子染色用細胞固定液/細胞外膜液，固定細胞并滲透，加入FITC標記的CD11b抗體進行染色。利用BD公司FACS Calibur流式細胞儀檢測CD11b陽性細胞比例。

1.8 Western blot

用PBS漂洗細胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解，離心10 000 r/min，20 min，提取蛋白質(zhì)。用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，用8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。采用的是半干法轉(zhuǎn)移蛋白到硝酸纖維素膜。用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。后用PBS洗去BSA，一抗用PBST稀釋至工作液濃度，4℃孵育過夜。24 h后，用PBST清洗3次，每次5 min。用PBST稀釋二抗至工作液濃度，避光37℃恒溫搖床反應(yīng)1 h。后用PBST清洗。用ImageJ Setup軟件掃描蛋白條帶的灰度值。檢測GSDMD和Caspase-11蛋白水平，內(nèi)參蛋白為β-actin，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值之比表示蛋白表達的相對水平。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病樣皮膚炎癥的影響

與對照組相比，模型組小鼠皮膚表現(xiàn)為出鱗屑及紅斑，皮膚組織皮質(zhì)顯著增厚(P<0.01)，PASI 評分顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠銀屑病樣皮損癥狀及皮膚組織皮質(zhì)增厚顯著減輕，且呈濃度依賴性(P<0.05，表1)， PASI 評分顯著減少，且呈濃度依賴性(P<0.01，表1)。與對照組相比，實驗第6日模型組小鼠體重顯著降低(P<0.01)，黃芪多糖高、中劑量組小鼠的體重下降被緩解(P<0.05，表2)。此外，與對照組相比，模型組小鼠脾臟重量顯著增加(P<0.01)，而與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠的脾臟重量顯著減少(P<0.05，表2)。以上結(jié)果表明，黃芪多糖能顯著改善咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮炎的癥狀。

Tab. 1 The epidermal thickness and clinical score of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=8)

Tab. 2 The body weight and spleen weight of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=8)

2.2 黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠炎癥因子表達的影響

ELISA檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌減少，且高劑量組效果最顯著(P<0.05，表3)。實時定量PCR檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠皮膚組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達顯著減少，且高劑量組效果最顯著(P<0.05，表4)。上述結(jié)果表明，黃芪多糖可改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠炎癥因子的表達。

Tab. 3 The serum levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice(pg/ml, n=5)

Tab. 4 The mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

2.3 黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞浸潤的影響

利用流式細胞術(shù)研究黃芪多糖對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型中免疫細胞浸潤的影響。實驗結(jié)果顯示，對照組小鼠CD11b+巨噬細胞比例為 3.51%±0.53%，模型組小鼠CD11b+巨噬細胞比例為22.29%±2.84%，黃芪多糖高劑量組小鼠CD11b+巨噬細胞比例為12.40%±1.56%。與對照組相比，模型組小鼠CD11b+巨噬細胞在淋巴結(jié)的浸潤顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高劑量組小鼠CD11b+巨噬細胞在淋巴結(jié)的浸潤顯著減少(P<0.05)。進一步檢測皮膚組織中與巨噬細胞相關(guān)的趨化因子mRNA表達水平的結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠皮膚組織中Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA表達水平顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高劑量組小鼠皮膚組織中Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA水平顯著減少(P<0.05，表5)。

Fig. 1 The CD11b+ cell infiltration in lymph nodes of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice

Tab. 5 The mRNA levels of Ccl2, Cx3cl1 and Cxcl10 in imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

2.4 黃芪多糖對巨噬細胞焦亡的影響

檢測細胞焦亡相關(guān)蛋白表達的結(jié)果表明，與對照組相比，模型組小鼠巨噬細胞中GSDMD-N和Cleaved-caspase-11蛋白的表達顯著升高(P<0.01)，GSDMD和Pro-caspase-11蛋白的表達沒有顯著差異(P>0.05)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠巨噬細胞中GSDMD-N和Cleaved-caspase-11蛋白的表達顯著降低，且高劑量組效果最顯著(P< 0.05，表6)。進一步檢測血清中LDH的結(jié)果表明，對照組小鼠血清中LDH水平為(1488.33±274.75)U/L，模型組小鼠血清中LDH水平為(7024.00±336.35)U/L，黃芪多糖高、中、低劑量組小鼠血清中LDH水平為(3042.41±453.64)U/L、(5207.29±451.25)U/L、(6015.31±771.26)U/L。與對照組相比，模型組小鼠血清中LDH的釋放顯著增加(P< 0.01)。與模型組相比，黃芪多糖高、中劑量組小鼠血清中LDH的釋放減少(P<0.05)。

Fig. 2 The protein expressions of GSDMD-N, GSDMD, cleaved-caspase-11 and pro-caspase-11 in macrophages of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis mice

Tab. 6 The protein levels of GSDMD-N, GSDMD, cleaved-caspase-11 and pro-caspase-11 in macrophages of imiquimod-induced psoriasiform dermatitis n=5)

3 討論

銀屑病樣皮炎是一種常見的、慢性、炎癥性皮膚病，以皮膚紅斑、丘疹、鱗屑為主要特征，目前臨床尚無有效的治療方法[11]。組織病理學特點是，銀屑病樣皮炎組織中存在大量炎癥細胞[12]，具體為角質(zhì)形成細胞的過度增殖和分化異常、表皮大量中性粒細胞浸潤和真皮淺層血管周圍被以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤[13]。目前，許多研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病與炎癥密切相關(guān)[14]。據(jù)報道，經(jīng)典的促炎細胞因子 TNF-α在銀屑病樣皮膚炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，導(dǎo)致體內(nèi)強烈炎癥的誘導(dǎo)炎性因子如 iNOS、COX-2、IL-6和 IL-1β的釋放[15]。因此，抗炎治療能緩解銀屑病樣皮膚炎癥。

據(jù)報道，巨噬細胞在銀屑病樣皮膚炎癥中發(fā)揮重要作用[16]。巨噬細胞主要由TLR 7、8 和 9表達，咪喹莫特的主要生物學效應(yīng)是通過對TLR 7和8的激動介導(dǎo)的[17]。銀屑病是一種細胞因子和趨化因子驅(qū)動的疾病，其病變是由于免疫細胞浸潤和角質(zhì)形成細胞過度增殖所致[18]。巨噬細胞通過激活TLR可以誘導(dǎo)多種炎性因子的產(chǎn)生[19]。除此之外，細胞焦亡也是巨噬細胞釋放促炎細胞因子的重要因素。細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，是一種程序性細胞死亡。在微生物感染時會導(dǎo)致巨噬細胞Caspase-11的激活，進而引發(fā)GSDMD被切割，形成的N端GSDMD寡聚化在細胞膜上形成孔道，最終造成細胞焦亡[20]。細胞焦亡的發(fā)生導(dǎo)致細胞膜破裂，引起細胞內(nèi)容物釋放進而激活強烈的炎癥反應(yīng)。鑒于巨噬細胞活化和細胞焦亡在促炎因子釋放過程中發(fā)揮的重要作用，抑制巨噬細胞在皮膚組織中的浸潤和活化是治療銀屑病的可行策略。

有關(guān)黃芪多糖具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫作用的研究已有多方面報道[21]，但目前就黃芪多糖對銀屑病樣皮炎的作用尚未有報道。本研究結(jié)果表明，黃芪多糖可以改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病，且高劑量組效果最明顯。已有研究證實，TNF-α、IL-1β和IL-6信號傳導(dǎo)在銀屑病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[22]，黃芪多糖治療可明顯抑制血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌以及皮損組織中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA 表達。在銀屑病中，巨噬細胞的浸潤是該疾病進展的關(guān)鍵因素。而黃芪多糖減少皮損組織中巨噬細胞的浸潤，并降低Ccl2、Cx3cl1和Cxcl10的mRNA表達。細胞焦亡對于巨噬細胞活化至關(guān)重要。本研究結(jié)果提示，黃芪多糖能抑制Caspase-11和GSDMD的活化并降低LDH的釋放，說明黃芪多糖能抑制巨噬細胞焦亡。綜合以上研究結(jié)果表明，黃芪多糖能通過抑制巨噬細胞焦亡減少促炎因子釋放，改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥。