有氧運動對高脂膳食小鼠心肌損傷中Nrf2/GPX4/Ferroptosis通路的作用*

王海濤， 楊雯茜， 劉玉倩△

(1. 嶺南師范學院運動與健康研究所， 廣東 湛江 524048； 2. 嶺南師范學院體育科學學院， 廣東 湛江 524048；3. 華南師范大學體育科學學院， 廣東 廣州 510631)

鐵在氧的轉(zhuǎn)運和儲存及線粒體有氧氧化中發(fā)揮重要作用，機體鐵代謝和氧穩(wěn)態(tài)相互關(guān)聯(lián)。心臟是機體耗氧量較大的器官，線粒體大約占心肌細胞體積的30%。因此，維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能正常和機體鐵的動態(tài)平衡是保持心功能正常的基礎(chǔ)。最近研究表明過量鐵引發(fā)的鐵死亡(ferroptosis)與心臟功能障礙密切相關(guān)。Ferroptosis是一種鐵依賴性的新型細胞死亡方式，通過細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷殺傷細胞[1]。游離鐵在線粒體中積累，通過Fenton反應，導致活性氧(ROS)的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化損傷。而通過線粒體靶向抗氧化劑可改善心肌病癥狀，進一步表明過量鐵引發(fā)的線粒體氧化損傷是心臟病的主要機制，有效預防心肌細胞ferroptosis是防治心臟疾病的重要靶點[2]。Ferroptosis導致心功能障礙、線粒體結(jié)構(gòu)異常和線粒體動力學受損，其調(diào)控機制有待深入研究[3]。谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)可有效抑制ferroptosis，保護線粒體和心肌細胞免受過氧化損傷[4，5]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)可轉(zhuǎn)位入核激活GPX4表達[6]。前期實驗證明運動可促進Nrf2表達[7]。在臨床實踐中充分證實通過有氧運動可改善心肌功能[8]。但運動對Nrf2/GPX4/Ferroptosis的影響尚缺少相關(guān)研究。由于糖尿病性心臟病發(fā)病率高，且是糖尿病患者致死的主要原因之一[9]。實驗通過高脂喂養(yǎng)小鼠造成2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)動物模型，在高脂膳食同時進行有氧運動，探討運動在改善高脂膳食誘發(fā)的心臟過氧化損傷中Nrf2/GPX4/Ferroptosis通路的作用機制，為運動在預防心肌損傷的臨床應用提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

40只5周齡SPF 級C57BL/6雄性小鼠 (廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2018-0002)，體重(18±2)g，SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng)和運動干預。自然光照，自由飲水，飼養(yǎng)溫度20℃～25℃，濕度50%～70%?；A(chǔ)飼料購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。隨機分為安靜對照組(normal control group，NC，每日基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)AIN-93G，不運動)、跑臺運動組(normal treadmill exercise, NE，基礎(chǔ)飼料AIN-93G，)、安靜高脂組(high-fat diet control group, HC, 60% Kcal SPF級高脂模型飼料，南通特洛菲，自由進食)和高脂+跑臺運動組(high-fat diet and received the increasing load running on the treadmill, HE，高脂與跑臺運動同時開始)，每組10只。小鼠跑臺(廣州飛迪生物科技有限公司)進行跑臺運動干預。適應期1周，每周3 d，10～20 min/d，坡度為0，10～13 m/min。正式運動訓練為期14周，采用中等強度(75%左右最大攝氧量)跑臺運動干預。每周5 d，60 min/d，坡度為0，第1～2周速度為13 m/min，每兩周速度遞增1 m/min，第13～14周19 m/min[10]。所有動物運動干預前均無跑臺運動史。末次運動后12 h取材，摘眼球取血，取左心室心肌，投入0.4% 多聚甲醛以備組織學觀察。其余心臟部分用0.9% NaCl清洗后濾紙吸去水分，投入液氮， -80℃儲存。

1.2 試劑盒和抗體

試劑盒：小鼠血清胰島素ELISA試劑盒(insulin，F(xiàn)INS，CUSABIO)，心肌線粒體分離試劑盒(Beyotime)，漿蛋白和核蛋白提取試劑盒(Beyotime)，8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG)和4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)ELISA試劑盒(上海生工)，組織鐵試劑盒(南京建成)。

抗體及來源：GPX4(Abcam，ab125066)、鐵蛋白重鏈(ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1，ABclonal, A1144)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1( glucose transporter 1，GLUT1，Abcam，ab115730)、Nrf2(Abcam，ab137550)、膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Ferroportin1，F(xiàn)PN1，ABclonal，A14884)、 羊抗兔IgG/HRP(二抗，YJ0189藝佳生物)、羊抗小鼠IgG/HRP(二抗，YJ0188藝佳生物)、GAPDH 兔多克隆抗體(內(nèi)參，YJ0200藝佳生物)。

1.3 儀器

羅氏血糖計，高速離心機(Eppendorf)，超聲細胞破碎儀(寧波唯誠超聲波設(shè)備科技有限公司，USAC-1200)，Synergy H4多功能酶標儀(Thermo scientific)，Leica切片機(RM 2135)，電泳和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-rad)，Olympus顯微鏡。

1.4 血液糖代謝指標測定

純化的小鼠抗-胰島素抗體包被微孔板，將取材的血清點到96孔板中，將胰島素標準品稀釋成梯度，依次加入反應藥品，Synergy H4多功能酶標儀450 nm讀取OD值，根據(jù)標準品，做標準曲線和計算公式，計算胰島素含量。胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)=ln[1/(FBG×FINS)]。

1.5 心肌線粒體提取和細胞核蛋白分離

采用差速離心法分離心肌線粒體。心肌勻漿后，600 g離心5 min。取上清液11 000 g 離心 10 min。沉淀即為分離的線粒體[11]。采用漿蛋白和核蛋白提取試劑盒提取細胞核蛋白：分別加入細胞漿蛋白抽提試劑A和B并劇烈震蕩后，12 000 g離心5 min，取上清為漿蛋白。沉淀加入細胞核蛋白抽提試劑，劇烈震蕩后，12 000 g離心10 min，得到核蛋白，分裝待測。

1.6 心肌鐵含量和氧化損傷標志物測試方法

取約80～100 mg心肌組織，加入9倍冷NaCl，通過機械均漿(每次10 s，4次)和冰水浴超聲粉碎(400 A，每次5 s，6次)制作10%心肌勻漿，離心取上清，分裝于離心管。按組織鐵試劑盒操作，測OD值。心肌線粒體8-OhdG和4-HNE采用ELISA，6個的標準孔依次點入不同濃度的標準品，加樣后37℃，孵育60 min，加終止液后，波長450 nm讀取OD值

1.7 心肌組織切片HE染色

蘇木精-伊紅(HE)染色檢測心肌組織病理改變：左心室心肌取約0.3 cm×0.5 cm×0.5 cm，投入4%多聚甲醛固定48 h。 經(jīng)過梯度酒精脫水后用石蠟包埋，切至0.6 μm，復水后分別放入蘇木素染5 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗。用伊紅染細胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色2 min，梯度酒精脫水后封片，Olympus顯微鏡采集圖像。

1.8 心肌蛋白免疫印跡

心組織勻漿后BCA法測定蛋白濃度。Western blot檢測心肌相關(guān)蛋白表達。上樣后轉(zhuǎn)膜350 mA，1 h，5%的脫脂奶粉，加入一抗，GPX4、FTH1、GLUT1、Nrf2和FPN1抗體稀釋度：1∶500，GAPDH稀釋度為1∶1 500，孵育2 h。加入HRP標記的二抗，稀釋度為1∶2 500，用ECL發(fā)光液孵育膜 5 min。富士感光膠片，壓片2 min后顯影 3 min，定影10 min。使用Image J軟件分析各個條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 有氧運動和高脂膳食對小鼠糖代謝狀態(tài)的影響

與對照組相比，高脂組血液中FBG和FINS顯著增加，ISI顯著下降(P<0.01)。高脂運動組FBG和FINS顯著低于高脂組(P<0.01)，ISI顯著升高(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Effects of aerobic exercise and high-fat diet on the carbohydrate metabolism in mice n=10)

2.2 有氧運動和高脂膳食對小鼠心肌氧化應激的影響

與對照組相比，高脂組心肌抗氧化酶活性下降，T-AOC、T-SOD、Mn-SOD、GSH和 GSH/GSSG均顯著低于對照組(P<0.01)。運動可顯著增強氧化應激相關(guān)酶的活性，T-AOC、T-SOD和GSH均顯著高于對照組(P<0.01)。與高脂組相比，高脂運動組T-AOC、T-SOD、GSH均顯著增加(P<0.01)，Mn-SOD和GSH/GSSG與高脂組相比有所增加(P<0.05，表2)。

Tab. 2 Effects of aerobic exercise and high-fat diet on the activities of anti-oxidative enzymes of myocardium in mice n=10)

高脂組心肌線粒體8-OHdG，心肌MDA、4-HNE顯著高于對照組(P<0.01)。高脂組心肌非血紅素鐵含量顯著高于對照組(P<0.01)。高脂運動組心肌線粒體8-OHdG，心肌MDA、4-HNE和心肌鐵含量顯著低于高脂組(P<0.01，表3)。

Tab. 3 Effects of aerobic exercise and high-fat diet on the oxidative sress indexes and non-heme iron of myocardium in mice n=10)

2.3 有氧運動和高脂膳食對小鼠心肌GPX4/ ferroptosis通路相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組相比，高脂組小鼠心肌GPX4明顯下降，鐵釋放蛋白FPN1和鐵儲存蛋白FTH1表達明顯減少，細胞核內(nèi)Nrf2減少(P<0.01)，胞質(zhì)內(nèi)Nrf2顯著升高(P<0.01)。與高脂組相比，高脂運動組FPN1、FTH1、GPX4、GLUT1和細胞核內(nèi)Nrf2顯著增加(P<0.01)。高脂運動組FPN1和細胞核內(nèi)Nrf2顯著低于運動組(P<0.01，圖1、表4)。

Fig. 1 Effects of aerobic exercise and high-fat diet on the expressions of proteins involved in ferroptosis of myocardium in mice (n=10)

Tab. 4 Effects of aerobic exercise and high-fat diet on the expressions of proteins involved in ferroptosis of myocardium in mice n=10)

2.4 有氧運動和高脂膳食對小鼠心肌組織形態(tài)學的影響

HE染色結(jié)果顯示，高脂組心肌細胞間隙增加，心肌纖維間隙有較多脂質(zhì)集聚(如箭頭所示)，心肌細胞肥大。而高脂運動組脂質(zhì)集聚較少。

3 討論

組織學檢測發(fā)現(xiàn)高脂組心肌細胞間隙有較多的脂質(zhì)集聚，偶見毛細血管基底膜增厚，心肌細胞明顯肥大，有心肌纖維化。這些組織學變化可影響心肌的順應性，容易造成心肌功能障礙，其原因可能是過量鐵引發(fā)的ferroptosis所致。而運動對心肌組織形態(tài)學有明顯的改善作用。在高脂組心肌細胞出現(xiàn)了明顯的過氧損傷，表現(xiàn)為MDA、4-HNE含量明顯增加。4-HNE來源于組織中的不飽和脂肪酸過氧化，并通過線粒體參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。4-HNE累積引起器官損傷，導致糖尿病并發(fā)癥，4-HNE可以作為糖尿病終末器官損害(如糖尿病心臟并發(fā)癥)的生物標志物[12]。高脂組線粒體DNA損傷加劇，表現(xiàn)為高脂組線粒體8-OHdG極顯著高于其他各組。在細胞核和線粒體DNA中，8-OHdG是ROS損傷的主要產(chǎn)物之一，通常被用作氧化應激的生物標志物。線粒體氧化損傷是鐵超載引起心肌損傷的主要機制。在細胞過氧化損傷嚴重的前提下，高脂組的抗氧化酶未發(fā)揮應有的作用，導致心肌損傷加劇。而高脂運動組則通過提高機體抗氧化酶系統(tǒng)的活性，如T-AOC、T-SOD和GSH，減少機體的過氧化損傷，降低4-HNE、8-OHdG含量。心肌蛋白質(zhì)組差異表達的結(jié)果表明有氧運動能增強大鼠心肌的抗氧化能力，這與本研究結(jié)果是一致的[13]。有氧運動組心肌細胞中GLUT1表達增加，促進了心肌細胞對血液中葡萄糖的攝取，有助于維持心肌正常能量供給。高脂膳食運動組小鼠的GLUT1明顯增加，甚至高于對照組，說明運動引起機體對高脂膳食的適應，積極增加心肌細胞對血液葡萄糖的攝取，既滿足運動中心肌對能量的需求，又在一定程度上降低血糖，增加胰島素的敏感性。但由于高脂膳食時間較長，這種適應也是有限的，高脂運動組小鼠的血糖依然高于對照組。

Fig. 2 Effects of aerobic exercise and high-fat diet on the myocardial histomorphology in mice (HE ×100)

鐵廣泛參與機體的許多生物過程，如氧的轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成、細胞呼吸和DNA合成。鐵參與維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)與功能[14]，從而維持心肌生理機能。而鐵代謝紊亂引發(fā)的ferroptosis參與多種疾病的病理過程，包括T2DM、肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展，對心肌缺血/再灌注損傷、心肌梗死、心力衰竭、糖尿病心臟病的發(fā)病起到重要作用[15]。因此維持機體鐵穩(wěn)態(tài)對于保護心功能起到重要作用。FPN1是哺乳動物細胞膜上唯一的鐵釋放蛋白，負責將過多的鐵釋放進入血液循環(huán)系統(tǒng)。鐵蛋白(ferritin)通過儲存多余的細胞鐵而在維持機體鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著核心作用，心臟中分離的鐵蛋白主要是H亞基，相對分子質(zhì)量21KDa，也稱為鐵蛋白重鏈(FTH1)，具有亞鐵氧化酶活性。敲除FTH1小鼠心肌細胞氧化應激增加，高鐵飲食后導致嚴重的心臟損傷和肥厚性心肌病，這說明FTH1在預防心臟ferroptosis和心力衰竭中發(fā)揮重要作用[16]。高脂運動組通過增加心肌FPN1表達，促進儲存鐵的釋放，通過FTH1表達增強，減少心肌中的游離鐵，起到保護作用。FPN1和FTH1的表達受到細胞核內(nèi)Nrf2的調(diào)控，Nrf2可能作為連接鐵代謝和氧化還原改變的中心[17]。有氧運動組和高脂運動組心肌細胞核的Nrf2表達均明顯增加，說明運動對Nrf2轉(zhuǎn)位入核起到重要的調(diào)控作用。增加的Nrf2促進FPN1和FTH1表達，減少心肌非血紅素鐵的含量，減輕高脂導致的心肌過氧化損傷。

Ferroptosis參與脂多糖(LPS)誘導的心臟損傷，并與心臟肥厚，糖尿病心肌病和阿霉素誘導的心臟毒性密切相關(guān)。通過ferroptosis的抑制劑：Ferrostatin-1可顯著改善糖尿病心肌缺血/再灌注過程中心肌細胞的損傷，減少心肌梗死面積，這是通過激活抗氧化酶系統(tǒng)及GPX4實現(xiàn)的[18]。GPX4主要通過GSH依賴的方式特異性催化脂質(zhì)過氧化物使其失去氧化活性，進而保護細胞免受ferroptosis威脅。高脂運動組心肌GPX4表達量顯著高于高脂組，同時心肌GSH含量提高，為GPX4反應提供充足的底物，降低機體脂質(zhì)過氧化反應。對心肌細胞選擇性地增加GSH水平，可有效預防心臟ferroptosis[19]。該實驗結(jié)果與本研究是一致的。而對缺血性心臟病和心肌細胞(H9c2)降低GPX4表達，則可增強ferroptosis[20]。高脂組心肌GPX4顯著低于其他各組，線粒體8-OHdG顯著增加，也說明高脂膳食引發(fā)心肌細胞ferroptosis。以ferroptosis為目標可作為預防心肌病的一種心臟保護策略。

綜上所述，有氧運動可減輕小鼠心肌線粒體的DNA損傷，有助于減輕高脂膳食引發(fā)的心功能受損，增強小鼠心肌細胞質(zhì)中Nrf2轉(zhuǎn)位入細胞核，促進其下游的GPX4表達增強，抑制心肌細胞發(fā)生ferroptosis；同時，Nrf2還可促進FPN1釋放鐵和FTH1儲存部分鐵，降低心肌中游離鐵含量，進一步保護心肌免于ferroptosis；通過運動抑制ferroptosis有望成為新的心臟保護靶點。