黃連素對PCOS模型大鼠LPS /NF-κB、MAPK信號通路的影響*

趙粉琴， 趙 艷， 劉潔穎， 茍雅姣， 楊永琴

(甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院， 蘭州 730000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)以月經(jīng)紊亂、不孕、高雄激素，或(和)肥胖[1]，50%～70%胰島素抵抗(IR)[2]，慢性炎性狀態(tài)[3]為特征的女性內(nèi)分泌疾病。早期以生殖紊亂為主，后期則以糖脂代謝紊亂[2]和血栓栓塞以及動脈粥樣硬化疾病[4]高發(fā)為主。胰島素抵抗是PCOS 代謝異常程度的重要決定因素[2]，研究其發(fā)病機制以尋求長期管理的方法以及中藥治療成為目前研究關(guān)注點。

絲裂原活化蛋白激酶( mitogen-activated protein kinase，MAPK) 家族是介導細胞反應(yīng)的重要信號通路，其中p38-MAPK和c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun nterminal kinase，JNK)是主要兩個亞型，可以被炎性因子、游離脂肪酸、高糖和氧化應(yīng)激等炎癥細胞因子激活并參與調(diào)節(jié)胰腺β細胞的胰島素分泌，引起的胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和慢性炎性變化[5]，參與調(diào)控PCOS的發(fā)病[6]。而脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性細菌外膜的組成成分，通過激活p38-MAPK和c-Jun 末端激酶(JNK)途徑激活核因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)，與慢性低度炎性綜合征，如糖尿病、肥胖、PCOS 等疾病的關(guān)系密切[7]。

達英-35是治療PCOS經(jīng)典藥物，雌孕激素聯(lián)合應(yīng)用調(diào)整月經(jīng)周期，同時通過抑制PCOS卵泡膜細胞合成雄激素，有降低血清雄激素作用。但在青春期使用存在促進肥胖和胰島素抵抗，育齡期應(yīng)用調(diào)整月經(jīng)周期保護子宮內(nèi)膜作用，但是用藥起效慢(3～6個月)，尤其是存在導致血栓高發(fā)風險，限制其在臨床長期應(yīng)用。二甲雙胍是胰島素增敏劑，通過改善脂代謝紊亂的作用維持胰島素的功能和形態(tài)[8]，可以糾正PCOS導致的IR有關(guān)的某些代謝性紊亂綜合征[9]，但對雄激素水平?jīng)]有改善作用。尋求一種長期管理PCOS的安全用藥成為關(guān)注的焦點。

研究表明黃連素可有效抑制LPS誘導NF-κB信號通路中關(guān)鍵通路蛋白的表達，并能抑制細胞的MAPK信號通路中p38-MAPK和c-Jun蛋白的表達而用于治療腸道炎癥[10]，也可以改善IR[11-13]。但是對于黃連素單獨用于治療PCOS作用機制研究較少。本研究從核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路入手探索黃連素是否通過影響卵巢組織p38-MAPK/c-Jun/NF-κB信號通路蛋白的表達，達到協(xié)調(diào)PCOS血清性激素分泌以及改善糖脂代謝異常的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SPF級SD大鼠6周齡50只(200±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(甘)2015-0005。室溫20～25℃，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，3 d后用于實驗研究。

1.2 藥品和試劑

來曲唑(每片2.5 mg，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，H19991001)，黃連素(每片0.1 g)，北京中新制藥廠，H11020962)，鹽酸二甲雙胍片(每片0.5 g，中美上海施貴寶制藥有限公司，H20023370)，達英-35(炔雌醇環(huán)丙孕酮片，每片含2 mg醋酸環(huán)丙孕酮和 0.035 mg炔雌醇，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，J20140114)，羧甲基纖維素鈉(CMC)(國藥集團化學試劑有限公司，國藥準字H20181203)，血脂和胰島素試劑盒購自江蘇麥莎，總膽固醇(TC，MS3486-B)，甘油三酯(TG，MS3485-B)，胰島素(INS，MS3462-B)，性激素和炎性因子試劑酶聯(lián)免疫試劑盒購自江蘇菲亞生物科技有限公司(促黃體生成素(LH，MM-0624R1)，促卵泡生成素(FSH，MM-0566R1)，雌二醇(E2，MM-0575R1)，睪酮(T，MM-0624R2)，孕酮(P，MM-0551R1)性激素結(jié)合球蛋白(SHBG，MM-0483R2)，脂多糖(LPS，MM-0647R2))；PVDF膜(廠家：Millipore公司，批號：IRVH00010)；ECL發(fā)光液(廠家：MILIIPORE，批號：P36599)，Glycine(批號：G8200)、Tris(批號：T8060)、SDS(批號：S8010)，RIPA裂解液(批號：R0010)，Tween-20(批號：20150702)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號：P1200)，BCA蛋白定量試劑盒(批號：PC0020)，p38 MAPK抗體 [N1C3-2]、NFkB p65抗體和c-Jun抗體(廠家：GeneTex，批號：GTX110720、GTX107678和 GTX11914)。

1.3 實驗分組、造模以及藥物干預(yù)

隨機分出10只為空白組，其余進行造模。動物造模方法：用來曲唑1 mg/(kg·d)，連續(xù)灌胃3 周，以陰道脫落細胞顯示動物處于動情間期為造模成功；然后隨機分成四組，每組10只，分別是模型組、達英組、二甲雙胍組和黃連素組。達英-35組給藥劑量(0.18 mg/(kg·d)(70 kg人的劑量按照醋酸環(huán)丙孕酮2 mg/d))，二甲雙胍組給藥劑量(0.135 g/(kg·d)(70 kg人的劑量1.5 g/d))；黃連素組給藥劑量(0.216 g/(kg·d)(換算成大鼠劑量0.108 g/(kg·d)(70 kg人的劑量1.2 g/d))相當于人的劑量的2倍)結(jié)合參考文獻[14]，為最佳劑量；每只大鼠灌胃2 ml，空白組和模型組用生理鹽水灌胃，連續(xù)用藥28 d。

1.4 大鼠體重、卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)檢測

給藥結(jié)束后禁食12 h，稱重，頸椎脫位處死動物，取子宮、卵巢，精密稱得各臟器的質(zhì)量，一側(cè)卵巢組織，4% 多聚甲醛溶液固定做HE 染色，一側(cè)卵巢用液氮凍存。并計算單側(cè)卵巢指數(shù)(單側(cè)卵巢重量mg/大鼠體重g)，子宮指數(shù)(子宮重量mg/大鼠體重g)。

1.5 經(jīng)蘇木精-伊紅(HE) 染色于光鏡下觀察卵巢組織病理變化

取多聚甲醛溶液固定的卵巢組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后， 以4 μm厚連續(xù)切片，HE染色(BDH，普爾，英國)。光鏡下觀察卵巢變化，每個卵巢以5張切片為宜，計算所有切片卵泡數(shù)量和級別。

1.6 大鼠血清性激素、糖脂代謝水平的檢測

給藥結(jié)束后禁食12 h，尾尖取血采用(欣舒測AB-103G血糖儀，批號：CZ119799)(葡萄糖脫氫酶法)測空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)BG)值。在處死前心臟取血1.5 ml，在4℃以3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清移入EP管，置于-20℃冰箱保存，做其他血清學指標檢測。采用酶法測空腹胰島素(insulin)、甘油三酯(triglyceride，TG)和膽固醇(cholesterol，TC)；采用ELISA法檢測血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、雌激素(estrogen，E2)、睪酮(testosterone，T)和孕酮(progesterone，P)；性激素結(jié)合蛋白(sex hormone binding protein，SHBG)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，按試劑盒操作步驟進行，96孔檢測，設(shè)置空白孔(不加樣)，標準孔(加樣50 μl)，待測孔(先加樣品稀釋液40 μl，再加待測樣10 μl)，顯色，在15 min內(nèi)使用酶標儀在450 nm波長進行吸光度 (OD) 檢測。計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment for insulin resistance, HOMA-IR)。HOMA-IR 公式為：HOMA-IR =空腹血糖(mmol/L)×空腹胰島素(mIU/L)/ 22.5。

1.7 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測卵巢組織p38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表達

取凍存卵巢組織200 mg，按照試劑盒說明進行，加入一抗(p38-MAPK和NF-κB為1∶1 000 稀釋，c-Jun為1∶250 稀釋)，以β-actin(1∶5 000)抗體為內(nèi)參，4℃孵育過夜。洗膜后加二抗，山羊抗兔(1∶5 000稀釋) 孵育2 h，免疫熒光增強法顯色，采用Image J對條帶進行灰度值分析量化。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)比較

與空白組比較，模型組大鼠體重明顯增加(P<0.05，表1)，子宮指數(shù)降低(P<0.05)，卵巢指數(shù)無影響；與模型組比較，二甲雙胍組、達英-35組、黃連素組能增加子宮指數(shù)(P<0.05)，對卵巢指數(shù)無影響。

Tab. 1 The body weight, ovarian index and uterine index in each group n=10)

2.2 大鼠卵巢組織病理學

空白組卵巢內(nèi)有不同發(fā)育階段的卵泡及多個黃體，成熟卵泡顆粒細胞多為6～8 層，形態(tài)完整，排列整齊，卵泡膜細胞呈梭形排列。模型組卵泡囊性擴張，多個初級卵泡，竇卵泡顆粒細胞層變薄，個別呈空泡樣變性。與模型組比較，黃連素增加初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數(shù)量(P<0.05，圖1，表2)，與達英-35類似，尤其可以降低閉鎖卵泡數(shù)量(P< 0.05)和囊狀卵泡數(shù)量(P<0.01)，而二甲雙胍在增加成熟卵泡和降低囊狀卵泡方面有差異(P<0.05)。

Tab. 2 The number of follicles of different grades in each group n=10)

Fig. 1 Histopathologicalprofiles of ovary tissues(HE ×400) multiple follicles (black arrows), vacuolated degeneration (red arrow), sinus follicles, absence of oocyte nuclei (white arrows);A,A1: Control group; B,B1: Model group; C,C1: Dyne-35 group; D,D1: Metformin group; E,E1： Berberine group

2.3 大鼠血清性激素水平變化

與空白組比較，模型組大鼠血清LH、T水平和LH/FSH比值升高(P<0.05，表3)，F(xiàn)SH水平下降(P<0.05)，E2和P水平無差異，符合PCOS血清學標志；與模型組比較，黃連素降低大鼠血清 LH、T水平以及LH/FSH比值(P<0.05)，作用與達英-35、二甲雙胍類似，尤其在降血清T水平作用更顯著(P<0.01)，對血清E2和P影響差異無統(tǒng)計學意義。

Tab. 3 The levels of FSH, LH, E2, T and P in rats n=10)

*P<0.05vsnormal group；#P<0.05vsmodel group

2.4 大鼠血清糖脂代謝變化

與空白組比較，模型組大鼠總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、胰島素含量和胰島素指數(shù)(HOMA)增加(P<0.05，表4)，空腹血糖(FBG)變化沒有差異(P>0.05)；與模型組比較，黃連素組能降低甘油三酯(TG)、空腹胰島素水平和胰島素指數(shù)(P<0.05)，作用類似二甲雙胍組，而達英-35對PCOS大鼠糖脂代謝沒有影響(P>0.05)。

Tab. 4 The levels of TG， TC， FBG， Insulin and HOMA in rats n=10)

2.5 大鼠血清性激素結(jié)合蛋白和脂聯(lián)素含量分析

與空白組比較，模型組大鼠血清SHBG減少，LPS含量增加(P<0.05，表5)；與模型組比較，黃連素能增加血清SHBG和降低LPS含量(P<0.05)，作用與二甲雙胍類似，而達英-35可以增加血清SHBG含量(P<0.05)。

Tab. 5 The levels of SHBG and LPS in rats n=10)

2.6 大鼠卵巢組織炎性蛋白表達分析

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織內(nèi)p38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表達增加(P<0.05，圖2，表6)；與模型組比較，黃連素能明顯下調(diào)大鼠卵巢內(nèi)p38-MAPK和NF-κB蛋白表達(P<0.05)，對c-Jun蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，作用與達英-35類似，而二甲雙胍對卵巢內(nèi)38-MAPK、NF-κB和c-Jun蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。

Tab. 6 The expression levels of p38-MAPK, c-Jun and n=10)

Fig. 2 Protein expressions in rat ovary tissues

3 討論

多囊卵巢綜合征(PCOS)的月經(jīng)紊亂和不孕嚴重影響女性的生殖和健康。肥胖、性激素代謝和糖脂代謝紊亂以及胰島素抵抗(IR)是 PCOS 發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。PCOS患者胰島素抵抗，與高水平黃體生成素(LH)和雄激素(T)水平增加互為因果，已經(jīng)成為PCOS診斷不可或缺的臨床和血清學指標[2]。改善導致PCOS 代謝異常程度的重要決定因素-胰島素抵抗(IR)，是治療PCOS的重要方法之一?，F(xiàn)在研究表明PCOS 的病理機制不再單純地局限于下丘腦-垂體-卵巢軸功能失調(diào)，可能與腸道菌群紊亂[15]產(chǎn)生的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活 TLR4/NF-κB 信號通路，啟動炎癥因子活動導致肥胖和胰島素抵抗(IR)發(fā)生[16,7]。所以研究PCOS導致IR發(fā)病機制以及對其干預(yù)作用就顯得尤為重要。

血液中雄激素濃度較高和/或臨床表現(xiàn)高雄激素狀態(tài)是多囊卵巢綜合征(PCOS)發(fā)病的關(guān)鍵[2]，雄激素(T)分泌量過多，抑制卵泡發(fā)育成熟以及合成雌二醇障礙，反饋性刺激垂體分泌LH量增加，進一步抑制卵泡發(fā)育成熟，卵巢呈多囊樣改變。研究表明黃連素降低PCOS大鼠血清 LH、T水平以及LH/FSH比值，增加卵巢內(nèi)初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡數(shù)量，作用與達英-35類似，尤其可以降低閉鎖卵泡數(shù)量和囊狀卵泡數(shù)量，這與黃連素抑制PCOS卵巢組織p38和JNK蛋白表達，p38/JNK顯著降低卵巢內(nèi)細胞色素P450 17α-羥化酶(CYP17)m RNA 的表達，促進卵巢顆粒細胞的自噬，抑制卵泡膜細胞合成雄激素的能力，改善 PCOS高雄激素狀態(tài)有關(guān)[17]。同時也與黃連素減低LPS水平，抑制NF-κB活性，減輕卵巢組織炎性狀態(tài)，促進多囊卵巢患者顆粒細胞類固醇的生成[18]有關(guān)。此結(jié)果與Xie研究[19]黃連素在降低PCOS患者總睪酮和黃體生成素方面優(yōu)于卵泡刺激素一致。同時黃連素也能明顯減低PCOS大鼠體重，減少總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量，與黃連素通過肝細胞發(fā)揮消耗葡萄糖，促進脂肪轉(zhuǎn)化，類似二甲雙胍，屬于胰島素增敏劑范疇[20,21]。同時達英-35、二甲雙胍和黃連素都有升高血清SHBG，這與他們降低血清睪酮、減輕體重和減輕胰島素抵抗，促進雌激素分泌，促進肝臟合成性激素結(jié)合蛋白能力有關(guān)[2]。

綜合以上研究，黃連素除了與二甲雙胍都可以改善PCOS大鼠糖脂代謝異常和減輕體重，同時也可以降低PCOS大鼠高雄激素和高黃體生成素水平，作用類似達英-35，其作用機制可能是改善PCOS慢性炎性狀態(tài)，抑制卵巢內(nèi)p38-MAPK、c-Jun和NF-κB蛋白表達促進顆粒細胞自噬而實現(xiàn)，這可能是黃連素用于長期對PCOS管理的作用機制的一個方面，更多作用機制希望在以后研究中進行探討。