外泌體對前列腺癌診斷的研究進(jìn)展

李哲源，王志剛，王紅梅，閔衛(wèi)平

(1.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院a.病理生理教研室； b.免疫學(xué)教研室； 2.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所,南昌 330006)

在我國，由于醫(yī)療資源的不足和個(gè)人對身體健康的忽視，很多患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已處于晚期，錯失了最佳治療時(shí)機(jī)，其治療效果和預(yù)后較差[1]；而對外泌體的檢測能夠反映腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，為診斷提供更多信息，為癌癥的早期發(fā)現(xiàn)提供一條新途徑。腫瘤循環(huán)細(xì)胞(CTC)檢測主要用于去勢抵抗性前列腺癌患者(CRPC)[2]，CTC是擴(kuò)散到血液或淋巴系統(tǒng)的癌細(xì)胞[3]，外周血高CTC計(jì)數(shù)往往與較差的預(yù)后有關(guān)，在前列腺癌(PCa)、結(jié)腸癌、乳腺癌中，以計(jì)數(shù)≥5 個(gè)·7.5 mL-1可判斷為預(yù)后不良，對預(yù)測患者的總生存時(shí)間及預(yù)后有著很好的效果[4]。前列腺癌是世界范圍內(nèi)男性第二常見的癌癥，大多數(shù)前列腺癌相關(guān)死亡是由于局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病所致[5-6]，目前也缺乏對轉(zhuǎn)移性前列腺癌有效的治療方案[7]，標(biāo)準(zhǔn)治療方案為雄激素剝奪療法，可控制和緩解癌癥，但這種治療方法仍不能滿足CRPC患者。因此通過開發(fā)能夠檢測惡性腫瘤的方法來提高疾病早期診斷水平顯得尤為重要，且有必要針對前列腺癌開發(fā)更特異的生物標(biāo)志物，以此來改善和減少過度診斷、過度治療。而外泌體能夠參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移，外泌體中的信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNAs)、非編碼RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等可以作為前列腺癌腫瘤標(biāo)志物，通過檢測尿液、血液等體液中的外泌體相關(guān)腫瘤標(biāo)志物，能提高對疾病的早期預(yù)防。本文對外泌體在前列腺癌診斷中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步尋找外泌體內(nèi)容物中更多特異性高的腫瘤生物標(biāo)志物提供參考。

1 現(xiàn)階段前列腺癌常用的診斷方法

目前一般將前列腺特異性抗原(PSA)檢測與直腸指診(DRE)相結(jié)合來篩查前列腺癌。PSA特異性存在于人前列腺腺泡及導(dǎo)管上皮細(xì)胞胞漿中，前列腺的結(jié)構(gòu)致密，PSA幾乎不可能進(jìn)入血液中，當(dāng)前列腺結(jié)構(gòu)遭破壞，血清PSA水平升高，會顯著增加PCa的風(fēng)險(xiǎn)[8]。但PSA水平升高并不是PCa所特有的，在患有良性前列腺增生(BPH)和前列腺炎癥的男性中，PSA水平也可升高[9-10]，PSA篩查的假陽性結(jié)果以及前列腺穿刺活檢的副作用會產(chǎn)生過度檢測、過度治療，這無疑增加了患者的心理壓力和醫(yī)療費(fèi)用，甚至?xí)a(chǎn)生不良反應(yīng)[11]，當(dāng)PSA水平超過4.0 ng·mL-1或DRE異常時(shí)，通常會懷疑是前列腺癌，但此標(biāo)準(zhǔn)可能會隨著年齡、種族和個(gè)人生理狀況的變化而變化[12]。PSA檢測不能很好地區(qū)分前列腺癌或BPH[13]。目前對于PSA灰區(qū)患者，可利用游離PSA/總PSA比值來區(qū)分PCa與BPH，但其診斷敏感性和特異性不足，僅為75%和32%[14]。DENHAM等[15]認(rèn)為游離PSA/總PSA的比值在臨床中區(qū)分PCa和BPH方面并無優(yōu)勢，澳大利亞各州對PSA的要求與游離PSA/總PSA比值的要求有很大差異。PCA3也是目前應(yīng)用十分廣泛的前列腺癌尿液標(biāo)志物，尿PCA3檢測是美國食品和藥物管理局(FDA)于2012年批準(zhǔn)的，樣本為DRE后的尿液，方法簡單快捷。

2 外泌體簡介

2.1 外泌體的作用機(jī)制

外泌體呈杯狀或扁平球形態(tài)，直徑在30～150 nm，外泌體參與細(xì)胞間的通訊、凝血、核酸與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移[16-17]，同時(shí)也有類似抗原呈遞細(xì)胞刺激體內(nèi)免疫反應(yīng)的作用[18]，外泌體與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程密不可分[19]。外泌體有3種方式進(jìn)入受體細(xì)胞：1)與細(xì)胞膜直接融合進(jìn)入受體細(xì)胞；2)外泌體通過表面分子與受體細(xì)胞膜表面分子結(jié)合進(jìn)入；3)受體細(xì)胞的內(nèi)吞作用使外泌體進(jìn)入并分泌外泌體內(nèi)容物，進(jìn)而發(fā)揮外泌體作用[20]。

前列腺癌中跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)與成紅細(xì)胞病毒E26致癌物(ERG)融合基因已被證明與較差的預(yù)后相關(guān)[21]，可利用外泌體液體活檢產(chǎn)品ExoDx Prostate IntelliScore(EPI)對PSA灰區(qū)患者的尿液外泌體中3個(gè)RNA(ERG、PC3、SPDEF)進(jìn)行檢測，避免不必要的穿刺活檢。外泌體作為一把雙刃劍，不僅能夠幫助臨床對疾病的檢測，還能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的凋亡，降低人體免疫系統(tǒng)的功能，前列腺癌外泌體中的Fas配體通過誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞的凋亡，抑制T細(xì)胞反應(yīng)，完成前列腺癌細(xì)胞的免疫逃逸[22]。

2.2 外泌體作為生物標(biāo)志物的優(yōu)勢

前列腺癌患者血清外泌體可通過PKM2誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的CXCL12促進(jìn)PCa腫瘤生長[23]，說明外泌體可能是前列腺癌潛在的腫瘤標(biāo)記物。外泌體作為生物標(biāo)志物有以下優(yōu)點(diǎn)：1)腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體中含有腫瘤相關(guān)分子，可以在血液[24]、尿液[25]、精液[26]和母乳[27]等體液中進(jìn)行分析；2)外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)能很好地維持其中核酸的穩(wěn)定性，不會被RNase降解；3)可以通過無創(chuàng)的方法從患者尿液、精液中提取外泌體；4)外泌體膜表面的特異性蛋白有利于反映其親代細(xì)胞的生理、病理功能[28]。一些外泌體中包含的蛋白質(zhì)，mRNAs、miRNAs、脂質(zhì)已被確定為潛在的前列腺癌生物標(biāo)志物[29]。

3 外泌體的內(nèi)容物與前列腺癌的關(guān)系

3.1 mRNA

激肽釋放酶3(KLK3)和雄激素受體剪接變異體7(AR-V7)這2種基因分別編碼PSA和AR-V7。最近發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血漿外泌體中可檢測到KLK3 mRNA，外泌體KLK3與血清PSA值有很強(qiáng)的相關(guān)性，AR-V7是前列腺癌特異性mRNA，通過檢測外泌體AR-V7 mRNA的結(jié)果顯示，在CRPC患者中，外泌體AR-V7的表達(dá)與性激素水平有關(guān)，AR-V7的表達(dá)與不良預(yù)后及對阿比特龍、恩雜魯胺的反應(yīng)降低相關(guān)[30-32]，還有研究[33]發(fā)現(xiàn)晚期前列腺癌患者尿液外泌體中的 AR-V7 mRNA水平和 AR-V7/AR-FL 比值較高。作為典型的PCa生物標(biāo)志物PSA和PCA3，其mRNA的表達(dá)在尿液中PSMA(前列腺特異性膜抗原)陽性外泌體內(nèi)明顯升高，所以捕獲尿液PSMA陽性外泌體檢測PSA和PCA3 mRNA水平能提高Pca的診斷效率[34]。

3.2 miRNA

miRNAs是長度為18～22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA，常通過與其目標(biāo)蛋白編碼mRNA結(jié)合來阻斷基因表達(dá)，參與翻譯的抑制和mRNA的降解[7]，外泌體攜帶了豐富的miRNA[5]，在外泌體所含的RNA中，成熟miRNA約占41.72%[13]，miRNA可通過癌基因或抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，所以外泌體miRNA對于腫瘤早期診斷及預(yù)后的意義重大，將外泌體中miRNA應(yīng)用于前列腺癌的液體活檢，能提高PSA檢測的特異性。miR-196A-5p和miR-501-3p在前列腺癌來源尿外泌體樣本中表達(dá)下調(diào)[5]，PCa患者尿液外泌體中miR-145的水平相比BPH患者顯著升高(P=0.018)，miR-145與Gleason評分顯著相關(guān)，Gleason評分≥8分的患者相比于Gleason評分≤7分的患者，miR-145水平顯著增加(P=0.02)，結(jié)合外泌體miR-145和血清 PSA，能比單獨(dú)用PSA指標(biāo)更好區(qū)分PCa和BPH，ROC曲線下面積(AUC)分別為 0.863和0.805[35]。另有研究[36]報(bào)道PCa患者尿外泌體中的miRNA-21和miRNA-375的表達(dá)上調(diào)，把兩者結(jié)合起來鑒別前列腺癌也具有較大優(yōu)勢，AUC 為 0.872。

miRNA水平與腫瘤的分期有著密切的聯(lián)系，外泌體miRNA具有預(yù)測侵襲性或局部性轉(zhuǎn)移的潛力，可以區(qū)分正常、BPH和侵襲性前列腺癌。miR-888的過表達(dá)能使小鼠腫瘤生長加速，且尿外泌體miR-888在CRPC患者中的表達(dá)明顯高于正常人和BPH患者[7]。外泌體miRNA 1246在侵襲性PCa中表達(dá)失調(diào)，侵襲性前列腺癌中外泌體miRNA-1246是正常人的31倍(P=0.026)，是BPH患者的23倍(P=0.035)[37]。

結(jié)合PSA與精液外泌體miR-142-3p、miR-142-5p、miR-223-3p的檢測，可以準(zhǔn)確地區(qū)分PCa與BPH患者，敏感性為91.7%，特異性為42.9%[26,38]，由此增加PSA篩選測試的特異性。

3.3 lncRNA

lncRNA(長鏈非編碼RNA)能調(diào)節(jié)腫瘤抑制、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展，lncRNA-Myu可以被外泌體包裹運(yùn)輸，在PCa細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中發(fā)揮作用，lncRNA-Myu水平在前列腺癌組織中顯著上調(diào)，lncRNA-Myu通過競爭性結(jié)合miR-184上調(diào)c-Myc表達(dá)，從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的增殖，而Myu基因的敲除會減弱前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移[39]。外泌體 lncRNA 水平可能有助于診斷 BPH 和 PCa。有證據(jù)證明，lncRNA在不同前列腺疾病中的表達(dá)也會不同，BPH組lncRNA-SAP30L-AS1水平明顯高于PCa組(P<0.05)和對照組(P<0.000 1)，PCa組lncRNA-SChLAP1水平明顯高于BPH組(P<0.000 1)和健康人(P<0.000 1)，lncRNA-SChLAP1水平會隨著PCa的進(jìn)展而增加[40]。

3.4 circRNA

circRNA(環(huán)狀RNA)是一種單鏈閉合RNA，不具有5′端帽子和3′末端poly(A)尾巴，以共價(jià)鍵形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)，比線性RNA更穩(wěn)定[41]。CircRNA與腫瘤的增殖、遷移有著重要的聯(lián)系[42]。在前列腺癌患者中，能觀察到外泌體circRNA-0044516表達(dá)顯著上調(diào)，且circRNA-0044516的下調(diào)會抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[43]。表明circRNA-0044516在前列腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。通過對前列腺癌患者尿液外泌體circ_0040507的水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組患者尿液外泌體circ_0040507表達(dá)水平顯著高于BPH組(t=4.165，P<0.001)，2組ROC曲線下面積為0.767(95%CI0.649～0.884)，4.12 copies·mL-1可作為尿液外泌體circ_0040507診斷前列腺癌最佳臨界值，其靈敏度為68.6%，特異度為77.8%[44]。

3.5 蛋白

外泌體中的PSA可能成為前列腺癌篩查和早期診斷的新工具，以BPH患者作對照，發(fā)現(xiàn)只有PCa患者具有同時(shí)高水平表達(dá)PSA以及CD81的納米囊泡[12]。與健康人相比，PCa患者血漿中外泌體CA IX(碳酸酐酶9)表達(dá)升高[45]， 其原因在于PCa外泌體呈酸性，腫瘤微環(huán)境的酸度導(dǎo)致PCa外泌體中CA IX活性增強(qiáng)，其表達(dá)上調(diào)[46]。

血清外泌體GGT(γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶)活性可能是潛在的PCa生物標(biāo)志物，免疫組織化學(xué)分析顯示，癌組織中GGT1的表達(dá)明顯高于BPH組(P<0.01)，且前列腺癌患者血清中外泌體GGT的活性高于BPH患者(P<0.05)[47]。

血漿中CLDN3(封閉蛋白3)的水平隨腫瘤分級的升高而升高。CLDN3是PC3外泌體的一種表面蛋白。Gleason 8級及更高級別的腫瘤患者外泌體表面蛋白CLDN3的表達(dá)與BPH或Gleason評分6～7分的患者相比明顯增高 (P=0.029)[48]。

前列腺癌患者血液分離的外泌體高表達(dá)αvβ3整聯(lián)蛋白，αvβ3從外泌體中轉(zhuǎn)移至β3陰性受體細(xì)胞，與該疾病高度相關(guān)[49]，提示檢測前列腺癌患者的外泌體αvβ3整合素可能是追蹤前列腺癌進(jìn)展的臨床生物標(biāo)記物。

3.6 脂類

外泌體中的脂質(zhì)可能成為潛在的前列腺癌生物標(biāo)志物。內(nèi)體分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合物(ESCRT)在外泌體的形成、釋放中發(fā)揮了重要作用[50]，而有的外泌體是通過ESCRT非依賴機(jī)制產(chǎn)生的，中性鞘磷脂酶能夠水解鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺，神經(jīng)酰胺能不依賴ESCRT形成外泌體，是外泌體形成的關(guān)鍵脂質(zhì)之一[51-52]。對15例前列腺癌患者和13例健康人群尿外泌體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)磷脂酰絲氨酸(PS) 18：1/18：1和乳糖基神經(jīng)酰胺(LacCer)(d18：1/16：0)最顯著(P<0.001)，后者也是在前列腺癌患者與健康人群樣本中比例差異最高，為95%，特定的脂質(zhì)組合可以使前列腺癌的診斷得到更好的結(jié)果，根據(jù)LacCer(d18：1/16：0)與PS 18：1/18：1和PS 18：0/18：2與PS 18：1/18：1的組合的敏感性為93%，特異性為100%，AUC為0.989[29]。前列腺癌中外泌體相關(guān)腫瘤標(biāo)志物見表1。

表1 前列腺癌中外泌體腫瘤標(biāo)志物

4 外泌體與前列腺癌的治療與預(yù)后

外泌體能夠攜帶各種蛋白質(zhì)以及核酸等物質(zhì)的生物學(xué)特性，讓它可能成為一種能夠用于腫瘤治療的載體，有證據(jù)表明，外泌體可能具有向癌細(xì)胞輸送化療藥物的潛力。前列腺癌患者血清的外泌體，可以影響對多西他賽的反應(yīng)，CRPC患者以多西紫杉醇為首選抗腫瘤藥，而將紫杉醇裝載到前列腺癌細(xì)胞來源外泌體中能增加了它的細(xì)胞毒效應(yīng)，外泌體被PCa細(xì)胞持續(xù)攝取，通過內(nèi)吞作用將紫杉醇輸送到受體細(xì)胞，導(dǎo)致藥物從細(xì)胞內(nèi)釋放，增強(qiáng)了藥物能力[53]。

對前列腺癌患者的血漿外泌體進(jìn)行高通量測序，結(jié)果顯示外泌體miR-423-5p在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中表達(dá)下調(diào)[54]。在前列腺癌骨轉(zhuǎn)移過程中，外泌體miR-214能夠記過Notch1信號通路增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的分化[55]，外泌體miR-940的高表達(dá)也明顯增強(qiáng)了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移[56]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-21-5p在PC3中的高表達(dá)能通過下調(diào)PHLPP2蛋白增強(qiáng)其增殖、EMT、遷移、侵襲能力[57]。

LNCAP細(xì)胞外泌體miR-26a的過表達(dá)能抑制PC-3細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力[58]，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體miR-205標(biāo)高表達(dá)有助于抑制前列腺癌細(xì)胞并增強(qiáng)其凋亡[59]。隨著前列腺癌臨床分期的增加,外泌體miR-141的表達(dá)水平增加[60]，外泌體miR-141-3p能促進(jìn)成骨細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移，縮短生存時(shí)間。前列腺癌細(xì)胞MDA-PCa-2b外泌體miR-141-3p能調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)移微環(huán)境，讓成骨細(xì)胞活性增強(qiáng)[61]。上述研究表明，通過對前列腺癌這些外泌體內(nèi)容物的檢測可能為前列腺癌骨轉(zhuǎn)移治療和預(yù)后提供新的可能。

5 總結(jié)與展望

PSA結(jié)合外泌體內(nèi)容物的檢測能提高PCa診斷的特異性、敏感性，彌補(bǔ)PSA檢測在假陽性、診斷敏感性、特異性這些方面的不足。外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)使得它還能成為癌癥靶向藥物的載體，增加藥效，說明外泌體不僅是一個(gè)有前途的腫瘤生物標(biāo)志物，更是向人們提供了未來治療癌癥的新途徑。目前外泌體的提取方法主要以超速離心法為主，優(yōu)點(diǎn)是可以適用各種體液類型的標(biāo)本，但缺點(diǎn)在于儀器昂貴、操作費(fèi)時(shí)、需要的樣本量較大，另外提取的方法還有外泌體沉降法(適合大樣本量，操作簡單，但周期長且純度不高)，免疫親和捕獲法(純度高，但成本高，產(chǎn)率低)、ExoQuick試劑盒法(操作簡單效率高但使用成本也高)、超濾法(純度一般且會因?yàn)闉V膜的堵塞而有所影響)[16,62]，目前還未開發(fā)出一套效率高、特異性好、成本較低、適用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)方案，所以要進(jìn)一步研究外泌體的提取方案，現(xiàn)有一種新型微流體系統(tǒng)能高效地提取外泌體，操作方便、速度快、純度較高且成本較低，但目前臨床測試很少，效果還有待驗(yàn)證[62]。若能將這些外泌體生物標(biāo)記物整合到一個(gè)篩查方案中，也許能夠提高PCa診斷水平，避免不必要的穿刺活檢，幫助病患減輕疼痛，降低心理壓力，減少費(fèi)用。綜上所述，值得進(jìn)一步尋找外泌體內(nèi)容物中更多特異性高的腫瘤生物標(biāo)志物來提高PCa的診斷水平。