基于促進心肌能量代謝的復蘇策略對家兔失血性心跳驟停效果的初步觀察

張 琳，于 蕊，宗兆文，葉 釗，鐘 鑫，賈益君，蔣仁慶，周小林，楊昊洋，杜文瓊

400038 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)陸軍衛(wèi)勤訓練基地戰(zhàn)救技能訓練教研室/創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室1；050083 石家莊，陸軍軍醫(yī)大學士官學校戰(zhàn)術衛(wèi)勤系2；400037 重慶，陸軍軍醫(yī)大學(第三軍醫(yī)大學)第二附屬醫(yī)院骨科3

大出血及出血性休克是戰(zhàn)場上導致可預防性死亡的最常見原因，占所有創(chuàng)傷性傷亡的40%以上。死亡的主要機制是失血性休克引發(fā)心臟驟停，被稱為失血引發(fā)的創(chuàng)傷性心跳驟停(hemorrhage-induce traumatic cardiac arrest, HiTCA)。HiTCA的救治成功率非常低，一度被認為對其進行心肺復蘇是徒勞的。后經臨床實踐和研究表明，使用全血和血液制品及時進行復蘇可促進自主循環(huán)恢復(return of spontaneous circulation, ROSC)，成功率接近內科性心跳驟停(medical cardiac arrest, MCA)。創(chuàng)傷和失血后出現的高血糖、高血鉀、酸中毒等病理變化，對創(chuàng)傷性心跳驟停(traumatic cardiac arrest, TCA)復律和臟器功能可能有重要的影響。其中，血糖和血鉀變化是失血后常見的變化，對心肌能量代謝和TCA后的復律有明顯影響。目前尚末有針對上述病理變化的救治策略的研究。假設通過補充三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)和使用改進的極化液(glucose-insulin-potassium, GIK)方法促進心肌能量代謝，可改善HiTCA后的ROSC和臟器功能恢復，本文針對這一假設進行驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

三磷酸腺苷、胰島素、氯化鉀、葡萄糖購自重慶醫(yī)藥公司；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國Signalway Antibody LLC公司；手持式血氣分析儀購自新加坡Flextronics公司；BC-5180 CRP型全自動全血細胞計數儀購自中國深圳邁瑞公司；HB-P01全自動干式生化分析儀購自光寶醫(yī)療器械常州有限公司；rac-030自動凝血分析儀購自中國深圳雷諾生命科學有限公司；微孔板光密度儀(MR-96A)購自中國深圳邁瑞公司。

1.2 動物分組和制模

20只家兔[實驗動物生產許可證號為SCXK(渝)20170002，使用許可證號為(渝)20170002]。本實驗已獲陸軍軍醫(yī)大學校倫理委員會許可(AMUWEC 20192178)，雌雄不拘，質量(2.82±0.43)kg，(9.5±0.45)月齡，通過隨機數字分組法分為A、B兩組(

n

=10)，通過控制性失血法制備HiTCA模型。制模前，1%戊巴比妥鈉以5 mL·kg的劑量腹腔注射麻醉家兔，然后左側頸總動脈置管用于持續(xù)監(jiān)測平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)、收縮壓、舒張壓和心率以及采集動脈血做血氣分析。右側頸內靜脈置三通管用于采集血樣，檢測血常規(guī)、常規(guī)凝血象和血生化以及用于輸注復蘇液體。左側股動脈置管，用于控制性抽取血液降壓。完成上述工作后，從股動脈置管中以2 mL/(kg·min)的速度抽取血液，直至收縮壓<20 mmHg，且持續(xù)20 s以上；此時，判定HiTCA動物模型制備成功。抽取的血液用檸檬酸磷酸葡萄糖儲存，室溫20 ℃下保存，用于下述的復蘇策略。

1.3 復蘇策略

制模成功后10 min內，2組動物分別接受全血回輸和全血回輸+三磷酸腺苷+改進GIK治療。兩組均回輸抽取的全血，輸注速度均為3 mL·kg·min。上述時間點的選擇模擬我軍《戰(zhàn)傷救治規(guī)則》中規(guī)定，即戰(zhàn)現場急救在傷后10 min內完成。改進的GIK方法為：根據測量的葡萄糖和鉀濃度應用GIK療法，即根據測量的葡萄糖和鉀濃度調整胰島素、葡萄糖與鉀離子之間的比例：如果葡萄糖水平>6.0 mml/L，鉀離子濃度>5.5 mmol/L，則胰島素劑量為0.1 U/kg在5 min內泵入，不補充氯化鉀；如果葡萄糖水平在3.0～6.0 mml/L之間，鉀離子濃度在3.5～5.5 mmol/L之間，則使用相同劑量胰島素的標準GIK方案(200 g/L葡萄糖、50 U/L胰島素和80 mmol/L氯化鉀)。如果鉀離子濃度<3.5 mmol/L且葡萄糖水平<3.0 mml/L(大出血后非常罕見)，則使用高糖和適當體積的氯化鉀調整GIK；如果只有血糖或鉀水平異常，則相應地調整GIK治療。ATP使用方法：每小時每只動物靜推0.1 mL。

收縮壓恢復至50 mmHg、維持1 min以上且可觸及頸總動脈搏動判定為ROSC。從復蘇結束至恢復ROSC計時，各組間進行比較。ROSC后，持續(xù)監(jiān)測MAP和心率，TCA后1 h內每隔20 min記錄1次MAP和心率，1～4 h每隔1 h記錄1次MAP和心率，4～8 h每隔2 h記錄1次MAP和心率，8～24 h每隔4 h記錄1次MAP和心率。

1.4 實驗室檢測指標和方法

麻醉后制模前(0 h)、制模后1、4、8、24 h取血檢測各項實驗室指標。使用手持式血氣分析儀測定動脈血氣，記錄乳酸和血氧飽和度(SaO)。使用全自動全血細胞計數儀計數血細胞，記錄紅細胞和血小板數量。各時相點1.5 mL靜脈血低速離心后取血漿使用HB-P01全自動干式生化分析儀檢測血糖、鉀離子、肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、肌酸激酶同工酶-MB的濃度；使用rac-030自動凝血分析儀檢測常規(guī)凝血象，記錄國際標準化比值(international ratio, INR)。

制模后24 h，所有血液標本收集后，以過量氯化鉀溶液靜推致死動物。如果在實驗終點前動物發(fā)生死亡，其各項測量指標統(tǒng)計至其死亡前一時相點。死亡判斷標準：收縮壓為0 mmHg，無自主呼吸，持續(xù)時間>3 min。

1.5 ELISA檢測

ELISA檢測指標包括S100β蛋白, C反應蛋白(C-reaction protein, CRP)和Syndecan-1。1.5 mL血液低速離心后取血漿按照說明書進行ELISA檢測，方法簡述如下：將100 μL各稀釋液(標準、空白和樣品)添加到適當的孔中，并用平板密封劑覆蓋平板，在37 ℃下培養(yǎng)2 h。然后從每個孔中取出液體，將100 μL檢測試劑A工作溶液添加到每個孔中，然后在37 ℃下將培養(yǎng)皿再培養(yǎng)1 h。孵育后，吸入溶液，并用300 μL洗滌液洗滌孔3次。隨后，向每個孔中添加100 μL檢測試劑B工作溶液，并在37 ℃下培養(yǎng)1 h。培養(yǎng)后，再次清洗孔，然后向每個孔中添加90 μL底物溶液，并將平板再培養(yǎng)15 min。最后，向每個孔中添加50 μL終止液，并通過輕敲板的側面進行混合。從平板底部去除所有水滴和指紋，并確認液體表面沒有氣泡，然后立即用微孔板光密度儀在450 nm處測量吸光度來測量上述標記物的濃度。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 ROSC、生存率和生理指標變化情況

各組動物達到HiTCA制模成功時的失血量之間無顯著性差異，分別為(67.4±5.87)mL和(62.6±8.06)mL(

P

>0.05)。2組家兔自主循環(huán)恢復率均為100%，從復蘇至獲得ROSC時間分別為(104±7.52)s和(98±6.03)s，無顯著差異(

P

>0.05)?；謴蚏OSC后，A組和B組動物MAP在1 h輸注血液后趨于穩(wěn)定，波動在(64.6±6.22)～(86.8±7.43)mmHg之間，B組動物稍高于A組，但無顯著性差異(

P

>0.05，圖1A)。心率在HiTCA后處于最高值，約為150～160次/min，然后逐漸降低并趨于平穩(wěn)，波動在88～115次/min左右，兩組之間無顯著差異(

P

>0.05，圖 1B)。兩組動物SaO在0 h最高，為100%；HiTCA后各個時相點波動在91.4%～96.7%，B組數值略高于A組，但兩組之間無顯著差異(

P

>0.05，圖1C)。

A：兩組平均動脈壓變化情況；B：兩組心率變化情況；C：兩組血氧飽和度變化情況

A組8～24 h內死亡2只動物，B組動物24 h內無死亡發(fā)生。

上述結果可見，全血回輸基礎上增加ATP和極化液后心率等生理指標稍好于全血輸注，并可一定程度減少死亡率。

2.2 實驗室檢測指標變化

與基礎值相比，HiTCA后葡萄糖和鉀離子濃度顯著升高(

P

<0.05，表1)；與A組相比，接受GIK治療的B組的葡萄糖和鉀濃度顯著降低(

P

<0.05，表1)。A組和B組的紅細胞計數、血小板計數顯著低于基礎值(

P

<0.05，表1)，且隨著時間延長，和基礎值相差越大；2組之間紅細胞計數、血小板計數無顯著差異(

P

>0.05，表1)。在0 h和1 h的時間點，2組間乳酸、肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和肌酸激酶同工酶-MB的濃度無統(tǒng)計學差異(

P

>0.05，表1)。HiTCA后4 h，B組乳酸、肌酐、尿素氮、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶和肌酸激酶同工酶-MB的濃度顯著低于A組(

P

<0.05，表1)。這些數據表明ATP和GIK治療對心臟、腎臟和肝功能有保護作用。

表1 各組動物實驗室檢測指標變化情況

與基礎值相比，2組的INR值顯著增加，呈創(chuàng)傷凝血病的表現。在0 h和1 h的時間點，兩組間INR無顯著差異(

P

>0.05，圖2)，而在4 h后的各個時相點，B組的INR值低于A組(

P

<0.05，圖2)。這一結果表明，ATP和GIK治療可改善HiTCA后的凝血功能障礙。

a: P<0.05,與A組比較

2.3 ELISA檢測結果

在HiTCA后4 h的各個時相點，B組CRP濃度低于A組(圖3A)，這一結果表明ATP和GIK治療有助于減輕HiTCA后的炎性反應。

a: P<0.05,與A組比較

與基線值相比，各組的Syndecan-1濃度均明顯升高(圖3B)。從HiTCA后4 h的各個時相點，B組Syndecan-1濃度明顯低于A組(

P

<0.05)。因為Syndecan-1具有肝素效應的內皮糖萼成分，可能導致凝血病，因而B組中syndecan-1低于A組與B組INR值低于A組有關，表明ATP和GIK治療有助于減輕HiTCA后凝血病的嚴重程度。S100β是腦損傷的有效標志物。在HiTCA后8 h和24 h兩個時相點，B組S100β濃度低于A組(

P

<0.05)。這表明全血復合ATP、GIK治療對HiTCA后腦組織有保護作用(圖3C)。

3 討論

HiTCA后會發(fā)生高血鉀、高血糖等病理生理改變，目前研究結果顯示高血鉀對創(chuàng)傷修復是負向作用，但高血糖在HiTCA中的作用尚存一定的爭議。

創(chuàng)傷后的急性高血糖主要是由應激引起的下丘腦-腎上腺低生理應激反應引起的，應激反應受創(chuàng)傷嚴重程度、休克發(fā)生率和年齡的調節(jié)。失血性休克是哺乳動物中最強烈的應激源，可引發(fā)最高水平的皮質醇和兒茶酚胺，進而誘發(fā)顯著的高血糖。既往研究顯示，高血糖對創(chuàng)傷患者預后既有負面影響，也有正面的影響，TCA患者也是如此。一些研究支持高血糖在心跳驟停期間有益的假設。相反，RUSSO等發(fā)現，心跳驟停患者入院后96 h內平均血糖水平升高與死亡率增加和嚴重神經功能障礙相關。由于使用全血復蘇本身促進ROSC的概率較高，因而本文研究發(fā)現，使用ATP和改進后的GIK治療沒有明顯提高ROSC的概率，但這種治療方法卻明顯改善了乳酸濃度、血壓、凝血等指標，并最終減輕了心臟、肝臟、腎臟和腦的功能損傷。

本研究表明，TCA后結局的關鍵是心臟能否有效利用葡萄糖，并滿足產生力量的能量需求。一方面，基于實際葡萄糖和鉀濃度的GIK治療可能增加心臟和其他臟器的葡萄糖利用率，ATP進一步提供了臟器能量代謝所需物質，這些有助于促進ROSC和維持其他臟器功能；另一方面，它可以減少高血糖的負面影響。結果發(fā)現，ATP和GIK治療后CRP濃度顯著降低，表明GIK治療可減輕HiTCA的炎癥反應。此外，發(fā)現GIK治療后凝血各項指標有所改善。研究結果顯示，急性高血糖會加劇創(chuàng)傷誘導的內皮細胞和糖萼損傷，因此，ATP和GIK療法對凝血功能的改善可能是由對內皮細胞的保護作用引起的。Syndecan-1是具有肝素效應的內皮糖萼的一種成分，已證明較高水平的Syndecan-1可能導致凝血病。ATP和GIK治療后血小板活化的降低也可能有助于凝血功能提高，如血小板計數和MA值升高。GIK降低酸中毒水平可進一步改善凝血功能。凝血功能的改善可能會提高ROSC的獲得率和關鍵器官的整體功能。同時，改進后的GIK治療明顯降低了HiTCA后的血鉀水平，其可能對維護內皮細胞功能有重要作用，進而可進一步減輕HiTCA后凝血病的嚴重程度，減輕各臟器損傷的嚴重程度。同時，GIK和ATP治療后的乳酸水平降低、能量利用增加和血鉀濃度降低對心臟、肝臟、腎臟和腦組織等有直接的保護作用，進而減輕HiTCA導致的損傷。

本研究尚存在一定的局限性。一是本研究選用家兔作為研究對象，既往研究多以豬或狗作為研究對象，結果的可比性需要進一步驗證。選擇家兔作為研究對象的主要原因是市場上針對家兔的抗體、ELISA等試劑盒明顯多于豬和狗，有利于進行機制研究；次要原因是家兔的凝血系統(tǒng)同人比較接近，而狗或豬與人相比呈現高凝特性。二是本研究和其他研究一樣，使用單純失血制造HiTCA模型(因其操作方便，易于制備標準化動物模型)，與真實創(chuàng)傷中很少有單純失血導致HiTCA的情形。在以后的研究中，將驗證ATP+GIK治療對創(chuàng)傷合并大出血所致TCA 中的效果。三是本研究未觀察心肺復蘇對ROSC和臟器功能的效果，主要原因是許多研究證明心肺復蘇對HiTCA的結局是有害的。