鋅指蛋白A20對LPS刺激時人退變髓核細胞衰老與凋亡的影響

唐 盼，劉 渤

400016 重慶，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科

椎間盤退變是年齡相關(guān)性疾病，并在遺傳因素、吸煙、感染、異常力學負荷、椎體終板營養(yǎng)物質(zhì)的運輸減少等誘因刺激下進行性加重。異常炎癥被認為是椎間盤退變的重要原因，胞外誘因刺激下，髓核細胞產(chǎn)生促炎癥因子如IL-1β和TNF-α，經(jīng)過NF-κB及MAPK通路激活如P65、ERK、JUNK等內(nèi)信號分子，促進靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起聯(lián)級的擴大炎癥反應，促使髓核細胞發(fā)生不可逆的改變，并伴隨過度的髓核細胞凋亡、衰老、自噬改變。此外，炎性通路的激活促進金屬基質(zhì)蛋白酶表達增加，如MMP3、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5，導致胞外親水基質(zhì)的減少以及纖維環(huán)結(jié)構(gòu)的破壞，從而導致椎間盤退變甚至髓核突出，造成慢性疼痛，嚴重影響患者生活質(zhì)量。

鋅指蛋白A20是一種內(nèi)源性保護蛋白，其可通過A20自身的去K-63泛素酶及K-48泛素酶對同一底物實行去泛素化及泛素化實現(xiàn)負反饋地抑制NF-κB炎癥信號通路的傳導，在炎癥疾病領(lǐng)域受到密切關(guān)注。本課題組的前期研究揭示，A20對髓核細胞具有內(nèi)源性的保護作用，減弱LPS刺激引起的炎癥信號NF-κB過度激活、傳導及相關(guān)親水基質(zhì)的分解，但在人退變椎間盤髓核細胞中鋅指蛋白A20對細胞衰老及凋亡影響不明確。因此本實驗擬使用小干擾RNA降低A20表達，LPS作為炎癥刺激因素，探究A20對細胞衰老及凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人退變椎間盤髓核組織 實驗所用標本均來自于重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，并獲得倫理委員會批準(2016-059)，且術(shù)前與患者簽署知情同意書。收集2020年6月至2021年12月住院患者術(shù)中常規(guī)切除的退變椎間盤組織。標本來自20例患者，男性9例，女性11例，年齡(42.10±12.07)歲?；颊咝g(shù)前癥狀、體征和影像學檢查確診為腰椎間盤突出癥，經(jīng)保守治療無效，Pfirrmann 分級均為Grade Ⅲ～Ⅴ。

1.1.2 主要試劑 DMEM/F12細胞培養(yǎng)液(以色列BI公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶和LPS(美國Sigma公司)，兔抗人P21多克隆、兔抗人P16多克隆(中國萬類生物科技公司)，兔抗人BCL2單克隆、兔抗人BID單克隆、兔抗人BAX單克隆(美國Abcam公司)，兔抗人P-P65單克隆、兔抗人TNFAIP3單克隆抗體(美國Cell Signaling 公司)，兔抗人P65多克隆抗體、羊抗兔二抗(中國博士德公司)，CAPE(中國美侖生物公司)，一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(綠色熒光，中國碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 髓核細胞的提取及培養(yǎng) 將患者術(shù)中切除并廢棄的退變髓核組織用50 mL離心管收集，放置冰上。用已高溫高壓消毒的眼科剪及眼科鑷小心分離混入髓核組織中的破碎骨片、肌肉及部分纖維環(huán)。無菌PBS溶液仔細沖洗髓核組織，直至沖洗后的廢液無明顯變色，將髓核組織剪成3～5 mm長寬的碎片，夾入15 mL無菌離心管內(nèi)，加入大約2倍體積0.25%胰蛋白酶，充分混勻，放置于37 ℃、5%CO的細胞孵箱內(nèi)消化30 min，隔10 min搖勻1次。0.25%胰蛋白酶消化完畢后，1 200 r/min離心5 min，吸棄上清液，并加入2倍體積的0.2%二型膠原酶，充分搖勻，消化4 h，每隔40～60 min手動混勻1次。用一次性的200目細胞篩過濾細胞懸液，并用無菌PBS溶液沖洗細胞篩，收集濾液，1 200 r/min離心8 min，棄上清，保留底部沉淀。加入完全培養(yǎng)基，充分重懸，轉(zhuǎn)移至由透氣孔的T25細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，加完全培養(yǎng)基至4 mL，放置細胞孵箱待其貼壁。髓核細胞大致4 d左右可見明顯貼壁細胞形態(tài)，大約20 d融合度達90%，進行傳代，傳至P2用于進行后續(xù)實驗。

1.2.2 人小干擾RNA-A20的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 siRNA-A20由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計及合成，序列為A20, 正義鏈5′-CUACUAAUGGGAUCAUUCATT-3′;反義鏈5′-UGAAUGAUCCCAUUAGUAGTT-3′。提前將髓核細胞接種至6 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，密度為50%左右，待其充分貼壁約24 h后，進行小干擾RNA的轉(zhuǎn)染。準備已消毒的1.5 mL EP管，各管內(nèi)加入100 μL無血清及雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，一半EP管加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，一半加入適當?shù)膕iRNA，靜止5 min后將其兩兩混勻，充分混勻后靜止20 min。吸棄培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌2～3次，加入無血清及無雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基饑餓大約15 min。轉(zhuǎn)染試劑及siRNA混合液緩慢加入上述的髓核細胞中，siRNA-A20轉(zhuǎn)染終濃度100 nmol/L，放置細胞孵箱。轉(zhuǎn)染4～6 h，將含有轉(zhuǎn)染混合物的細胞培養(yǎng)液吸出，并用PBS清洗1～2次，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并觀察其形態(tài)是否良好，用于后續(xù)實驗。

1.2.3 實驗設(shè)計及分組處理 為探索鋅指蛋白A20在LPS刺激下對細胞凋亡及衰老影響，設(shè)置對照組、LPS組、siRNA-A20組、siRNA-A20+LPS組。為明確下調(diào)鋅指蛋白A20時LPS刺激誘導的細胞凋亡及衰老通過NF-κB通路實現(xiàn)，設(shè)置對照組、LPS組、siRNA-A20+LPS組、siRNA-A20+LPS+CAPE組。siRNA-A20轉(zhuǎn)染終濃度100 nmol/L，LPS均為200 μg/mL處理24 h，CAPE為2.5 μmol/L預處理2 h。

1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達 裂解各組細胞后，冰浴，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清并定容，BCA 法測定上清中蛋白濃度，加入RIPA稀釋蛋白以平衡各組間蛋白濃度，以1/4蛋白體積上樣緩沖液混合煮沸15 min后上樣，恒壓80 V進行電泳分離，恒流250 mA進行電轉(zhuǎn)，將蛋白電轉(zhuǎn)至0.22 mm PVDF 膜。用快速封閉液對轉(zhuǎn)好的膜封閉30 min，TBST洗滌3次，每次5 min。一抗(1∶500)4 ℃孵育12 h，TBST洗滌3次，每次15 min，二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌2次，每次15 min。顯影，發(fā)光。用Image J 軟件處理。系統(tǒng)分析目標條帶的光密度值。

1.2.5 β-半乳糖苷酶檢測 對于6孔板中培養(yǎng)的細胞，吸除細胞培養(yǎng)液，用PBS或HBSS洗滌1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。吸除細胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細胞3次，每次3 min。根據(jù)試劑盒說明書將β-半乳糖苷酶染色液A、B、C及X-Gal溶液按照比例配置成染色工作液，每孔加入1 mL染色工作液。用parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)，在無CO孵育箱中37 ℃孵育過夜，普通光學顯微鏡下觀察，拍照并計數(shù)陽性細胞占比。

1.2.6 流式細胞儀Annexin V-PI雙標法檢測細胞凋亡 流式細胞儀 Annexin V-PI雙標法檢測髓核細胞凋亡: 髓核細胞培養(yǎng)和處理同前。用PBS洗滌3次，用無EDTA胰蛋白酶消化后，PBS 洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，采用Annexin V-PI染料染色，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

1.2.7 TUNEL染色檢測細胞凋亡 根據(jù)試劑盒說明書配制適當量的TUNEL檢測液，充分混勻。用PBS或HPBS洗滌2次。在樣品上加50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。PBS或HPBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，拍照并計數(shù)陽性細胞占比。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 人退變髓核組織選擇及細胞培養(yǎng)

選擇退變等級為3級或4級的髓核組織。提取原代細胞第5天，可見明顯呈短梭狀、聚集細胞貼壁，培養(yǎng)21 d可見細胞逐漸呈長梭形聚集，融合度達85%以上，且細胞形態(tài)良好(圖1)。

2.2 下調(diào)A20促進衰老相關(guān)蛋白表達

與對照組相比，LPS組P21、P16蛋白表達無明顯變化，siRNA-A20組及siRNA-A20+LPS組P21、P16蛋白水平明顯增加(

P

<0.05)，siRAN-A20+LPS組P16及P21略高于siRNA-A20，但差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

2.3 siRNA-A20處理后β-半乳糖苷酶染色陽性細胞明顯增加

與對照組相比，LPS組陽性細胞占比無明顯增加，siRNA-A20組及siRNA-A20+LPS組陽性細胞占比明顯增加(

P

<0.05)。見圖3。

A：β-半乳糖苷酶染色結(jié)果；B：各組陽性細胞占比 a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.4 下調(diào)A20促進細胞凋亡相關(guān)蛋白表達

與對照組相比，LPS組僅BID蛋白量增加(

P

<0.05)，BCL2、BAX蛋白水平無明顯差異；siRNA-A20組蛋白表達與LPS組類似；siRNA-A20+LPS組BID及BAX蛋白明顯增加，BCL2明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見圖4。

A：Western blot檢測結(jié)果；B：半定量分析 1：對照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.5 下調(diào)鋅指蛋白A20表達量LPS可明顯誘導細胞凋亡

單純LPS刺激及單純siRNA-A20處理組中細胞凋亡明顯高于對照組(

P

<0.05)，但兩組間無統(tǒng)計學差異；siRNA-A20+LPS組細胞凋亡顯著增加，高于二者單獨作用對細胞凋亡影響(

P

<0.05，圖5)。TUNEL染色中，LPS組及siRNA-A20組陽性細胞占比明顯高于對照組(

P

<0.05)，但明顯低于siRNA-A20+LPS組(

P

<0.05，圖6)。

A：流式細胞儀檢測結(jié)果；B：細胞凋亡率 1：對照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

A：TUNEL染色結(jié)果；B：陽性細胞占比 1：對照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.6 下調(diào)A20表達量LPS刺激可明顯增加NF-κB通路活性

與對照組相比，p-P65蛋白水平在LPS組中增加(

P

<0.05)，在siRNA-A20+LPS組中顯著上升(

P

<0.05)，在siRAN-A20組中無明顯差異(圖7)。

A：Western blot檢測結(jié)果；B：半定量分析 1：對照組；2：LPS組；3：siRNA-A20組；4：siRNA-A20+LPS組 a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與LPS組比較

2.7 CAPE預處理后衰老及凋亡相關(guān)蛋白表達量的變化

與siRNA-A20+LPS組相比，CAPE預處理后，p-P65、P21、P16、BID、BAX蛋白表達降低(

P

<0.05)，BCL2蛋白表達增加(

P

<0.05)，A20及P65蛋白水平無明顯變化(圖8)。

A：Western blot檢測結(jié)果；B：半定量分析 1：對照組；2：LPS組；3：siRNA-A20+LPS組；4：siRNA-A20+LPS+CAPE組 a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與siRNA-A20+LPS組比較

3 討論

應用siRNA-A20處理髓核細胞后，衰老相關(guān)蛋白P21、P16明顯增加，且β-半乳糖苷酶染色陽性細胞占比顯著提高，提示細胞衰老程度提升。年齡相關(guān)性疾病中，細胞衰老占據(jù)著重要影響，可由一系列內(nèi)在和外在的傷害引起，包括致癌激活、氧化和遺傳毒性應激、線粒體功能障礙、輻射或化療藥物。在退變的椎間盤中，髓核處于炎性微環(huán)境的刺激下，易誘導髓核細胞及其祖細胞的衰老。此外，衰老細胞可產(chǎn)生的衰老相關(guān)分泌表型(SAPA)影響周圍細胞，加之異常的炎癥環(huán)境促使正常功能髓核細胞急劇減少，加速髓核組織中干細胞的耗竭，導致椎間盤退變。抑制精氨酸酶Ⅱ可減少IL-1β誘導的細胞衰老及凋亡，其機制涉及對NF-κB炎癥信號通路的抑制。彭鑫等研究顯示，siRNA-A20+TNF-α可明顯誘導大鼠髓核細胞的衰老，其機制可能涉及NF-κB通路的過度激活。但在本實驗中單純siRNA-A20處理后，細胞衰老明顯增加，聯(lián)合LPS刺激后，P-P65雖明顯上升，但P21、P16及陽性細胞占比與siRNA-A20組無統(tǒng)計學差異。兩實驗所得結(jié)果差異可能與細胞種屬及分組不同有關(guān)，并且本課題組前期研究提示單純下調(diào)A20可能減弱髓核細胞自噬，因此A20調(diào)節(jié)細胞衰老的機制還有待深入探索。

本研究結(jié)果表明，LPS或siRNA-A20處理時，可誘導細胞凋亡，且siRNA-A20+LPS組凋亡細胞占比顯著升高，并伴隨著BID、BAX表達量增加，BCL2下降。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，是正常生長發(fā)育的一部分，也在多種疾病中存在，主要分為依賴線粒體的內(nèi)源性途徑及依賴死亡配體受體的外源性途徑，但最終都通過Caspase家族蛋白發(fā)揮作用。髓核組織處于IL-1β、TNF-α高表達的微環(huán)境，這些炎性刺激可通過細胞外Fas受體、腫瘤壞死因子受體1及腫瘤壞死因子相關(guān)配體1誘導外源性的細胞凋亡，并且在炎性因子的作用下，細胞內(nèi)NF-κB、MAPK等多種信號通路激活，導致了內(nèi)源性的凋亡發(fā)生——線粒體途徑凋亡。在本實驗中，siRNA-A20+LPS組線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白BID、BAX、BCL2明顯改變。BCL2及BID是線粒體凋亡途徑的重要蛋白，可激活BAX、BAK，促使線粒體外膜通透性增加，釋放細胞色素C，Caspase家族激活，誘導細胞凋亡。因此，猜測siRNA-A20+LPS處理時，凋亡可能通過該途徑實現(xiàn)。

髓核細胞中，cortistatin、SS-31均可抑制炎癥刺激誘導的NF-κB激活、線粒體損傷及凋亡，sirt 6可通過抑制mTOR磷酸化提升髓核細胞自噬流量，阻礙細胞衰老及IL-1β誘導凋亡，從而延緩椎間盤退變。本研究中，下調(diào)鋅指蛋白A20的表達，LPS可明顯誘導細胞衰老及凋亡，造成髓核細胞的損傷。給予NF-κB抑制劑CAPE預處理后，可明顯減少衰老及凋亡相關(guān)蛋白的表達，提示siRNA-A20+LPS誘導的細胞衰老及凋亡可能通過NF-κB通路實現(xiàn)，并且在本課題組前期研究中也已證明過表達鋅指蛋白A20可延緩LPS誘導的髓核細胞退變，因此A20在延緩椎間盤的退變中相當重要。

綜上所述，本研究顯示鋅指蛋白A20在人退變髓核細胞中同時具有抗細胞凋亡及衰老作用，且在LPS刺激下更凸顯出A20蛋白對細胞的保護效果，該作用通過抑制NF-κB實現(xiàn)。此外，下調(diào)A20后LPS刺激下線粒體凋亡通路蛋白明顯增加，提示鋅指蛋白A20的抗凋亡作用可能通過保護線粒體實現(xiàn)，為進一步研究A20對髓核細胞的內(nèi)源性保護作用提供可靠方向。本研究再次證明鋅指蛋白A20對髓核細胞退變的保護作用，并且提示了凋亡可能的作用機制，但在椎間盤退變中A20具體保護機制仍不明確，需進一步探究。