膠質(zhì)瘤中TRP基因家族預(yù)后模型的開發(fā)和驗(yàn)證

郭兆剛，欒 濤，鄧 超，岳 博，祖 靜，萬 研

膠質(zhì)瘤是一種發(fā)病率最高的原發(fā)性腦腫瘤,根據(jù)WHO指南，可分為高級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅲ-Ⅳ)與低級(jí)別膠質(zhì)瘤(Ⅰ-Ⅱ)。目前外科手術(shù)聯(lián)合放化療治療效果有限，患者中位生存期依然保持在15個(gè)月以下。尋找新的分型并預(yù)測患者預(yù)后對(duì)指導(dǎo)膠質(zhì)瘤的臨床治療具有重大意義。瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential, TRP)通道為位于細(xì)胞膜上的離子通道蛋白，通過形成四聚體結(jié)構(gòu)行使非選擇性陽離子跨膜運(yùn)輸功能。在哺乳動(dòng)物中，有7個(gè)TRP亞家族，包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP、TRPML和TRPN。除調(diào)節(jié)感覺及激素和信息素信號(hào)傳導(dǎo)的作用外，TRP基因家族也可通過影響細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫和CGGA數(shù)據(jù)庫中的膠質(zhì)瘤測序數(shù)據(jù)，探討有影響的TRP家族蛋白對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 使用Perl語言從UCSC Xena網(wǎng)站中下載的TCGA target GTEx數(shù)據(jù)集中提取膠質(zhì)瘤(低級(jí)別膠質(zhì)瘤523例、高級(jí)別膠質(zhì)瘤171例)和正常腦皮質(zhì)(105例)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及膠質(zhì)瘤患者的臨床信息，并從CGGA數(shù)據(jù)庫中提取了1018例膠質(zhì)瘤患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床信息。

1.2 預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 在R語言中，使用TCGA中數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素COX回歸分析以確定與預(yù)后相關(guān)的TRP家族基因，使用“glmnet”包建立LASSO-COX回歸和多因素COX回歸模型，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算以評(píng)估患者預(yù)后，并使用CGGA數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后模型的效能驗(yàn)證。

1.3 臨床特征的預(yù)后分析 采用R語言對(duì)患者年齡、病理分級(jí)、性別、復(fù)發(fā)類型及風(fēng)險(xiǎn)得分進(jìn)行單因素和多因素COX分析以探究其對(duì)膠質(zhì)瘤預(yù)后是否有影響。

1.4 免疫浸潤分析 使用CIBERSORT以評(píng)估患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 TRP基因家族在膠質(zhì)瘤組織及正常對(duì)照組織中的表達(dá)差異使用Wilcoxon檢驗(yàn)；TRP基因家族表達(dá)情況及不同風(fēng)險(xiǎn)亞組與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后相關(guān)性使用Kaplan-Meier方法分析及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較；<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TRP家族在膠質(zhì)瘤的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系 與105組正常腦皮質(zhì)樣本相比，在膠質(zhì)瘤患者中，TRPC2、TRPC4、TRPC6、TRPC7、TRPM7、TRPM8、TRPV4表達(dá)顯著上調(diào)，TRPA1、TRPC5、TRPM2、TRPM3、TRPM4、TRPM5、TRPM6、TRPV1、TRPV3、TRPV5顯著下調(diào)(圖1)；使用GEPIA網(wǎng)頁工具評(píng)估TRP基因家族與患者預(yù)后相關(guān)性(表1)，提示TRP基因家族在膠質(zhì)瘤中表達(dá)失調(diào)且會(huì)影響膠質(zhì)瘤患者的生存周期。

2.2 預(yù)后模型構(gòu)建與效能驗(yàn)證 為進(jìn)一步理解TRP基因家族與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性，使用單因素COX回歸分析確定與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)的18個(gè)TRP基因(TRPA1、TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7、TRPM2、TRPM4、TRPM6、TRPM7、TRPM8、TRPV1、TRPV2、TRPV4、TRPV5、TRPV6)，進(jìn)一步利用LASSO-COX回歸分析，從上述18個(gè)TRP基因家族中篩選出7個(gè)基因TRPC1、TRPC3、TRPM4、TRPM6、TRPM8、TRPV2、TRPV4以構(gòu)建預(yù)后模型[風(fēng)險(xiǎn)得分= Exp×(-0.1067)+Exp×(-0.0286)+Exp×0.1614+Exp×(-0.1432)+Exp×0.2074+Exp×0.2022+Exp×0.0114)]。

根據(jù)得分中位值，將患者分為高危亞組(=341)和低危亞組(=342)，結(jié)果顯示，在高危組中TRPM8、TRPV4、TRPM4、TRPV2表達(dá)水平較高，在低危組中TRPM6、TRPC1、TRPC3表達(dá)水平較高。使用KM分析發(fā)現(xiàn)，高危組5年生存率(0.0586)顯著低于低危組(0.1491)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.001)。為進(jìn)一步評(píng)估TRP家族基因的預(yù)后模型對(duì)總生存期預(yù)測的累積效應(yīng)，計(jì)算受試者操作特征曲線下面積，1、3、5年的AUC值均>0.8，提示該預(yù)后模型有優(yōu)秀的預(yù)測效能(圖2)。在CGGA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步驗(yàn)證該預(yù)后模型，高危組五年生存率依然明顯低于低危組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.001)；1、3、5年的AUC值均>0.6，提示該預(yù)后模型在CGGA驗(yàn)證集中依然有較高的可信度(圖3)。

2.3 患者臨床特征的預(yù)后分析 為闡明膠質(zhì)瘤患者的臨床特征與預(yù)后之間的關(guān)系，進(jìn)行了單因素與多因素COX回歸分析。單因素COX回歸及多因素COX回歸分析結(jié)果顯示患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者的年齡和疾病病理分級(jí)均可作為獨(dú)立因素評(píng)價(jià)患者預(yù)后(圖4)。

2.4 高低風(fēng)險(xiǎn)組免疫浸潤分析 使用CIBERSORT免疫浸潤算法評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者免疫浸潤之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)樹突狀細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、靜止型肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、靜止型自然殺傷細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化型記憶CD4T細(xì)胞、靜止型記憶CD4T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān)型，嗜酸性粒細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、活化型肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、活化型自然殺傷細(xì)胞、CD4幼稚性T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)性，表明高風(fēng)險(xiǎn)患者中自然殺傷細(xì)胞的活性降低及記憶CD4T細(xì)胞的休眠導(dǎo)致其免疫系統(tǒng)抗腫瘤的活性相較低風(fēng)險(xiǎn)組較弱；而低風(fēng)險(xiǎn)組患者中CD4幼稚性T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞的增加使得患者免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性更高；提示免疫微環(huán)境中不同免疫細(xì)胞的組分差異是高低評(píng)分亞組生存率差異的原因之一(表2)。

3 討 論

TRP基因家族于1969年首次在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。1997年，Caterina等首先報(bào)道了TRPV1可被辣椒素及加熱所激活，確認(rèn)了TRP基因編碼的蛋白質(zhì)在感覺系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能。隨后，有學(xué)者對(duì)TRP家族基因所編碼的蛋白在溫度、拉伸/壓力、化學(xué)物質(zhì)、氧化/還原、滲透壓和pH值等細(xì)胞周圍環(huán)境的感受作用進(jìn)行了報(bào)道；研究發(fā)現(xiàn)，除作為細(xì)胞感受器作用外，TRP家族基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。使用SKF96365抑制TRPC亞家族可以導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞系D54MG發(fā)生G/M期阻滯并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；TRPM2的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的凋亡；過表達(dá)TRPM8可以通過ERK通路依賴的方式增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性和增殖能力；在膠質(zhì)母干細(xì)胞中，TRPV2的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)纖維酸性蛋白及βⅢ型微管蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)角質(zhì)表型的分化，同時(shí)抑制膠質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖。

隨著分子病理學(xué)進(jìn)展，越來越多的分子標(biāo)志物被應(yīng)用于判斷膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后，但單個(gè)臨床因素或者單個(gè)基因特征易受多個(gè)因素的影響，對(duì)患者預(yù)后判斷的準(zhǔn)確程度有待評(píng)估，膠質(zhì)瘤患者需要更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)念A(yù)后模型以指導(dǎo)精準(zhǔn)化醫(yī)療。本研究通過探索與膠質(zhì)瘤進(jìn)展相關(guān)的TRP基因家族，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRP基因家族在膠質(zhì)瘤中存在廣泛異常表達(dá)，且與患者預(yù)后有關(guān)。使用TRP基因家族基于523例低級(jí)別膠質(zhì)瘤和171例高級(jí)別膠質(zhì)瘤樣本的表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建的預(yù)后模型在訓(xùn)練集(1、3、5年AUC均>0.08)和驗(yàn)證集(1、3、5年AUC均>0.06)中均表現(xiàn)出了良好的預(yù)后效能。單因素及多因素回歸分析顯示，基于TRP家族基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以作為預(yù)測患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。此外，基于預(yù)后模型對(duì)膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行高低風(fēng)險(xiǎn)分組，低風(fēng)險(xiǎn)組預(yù)后均明顯優(yōu)于高風(fēng)險(xiǎn)組。本研究免疫浸潤分析結(jié)果提示，低風(fēng)險(xiǎn)組中活化性自然殺傷細(xì)胞、CD4幼稚型T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞的比例均高于高風(fēng)險(xiǎn)組，低風(fēng)險(xiǎn)組患者對(duì)膠質(zhì)瘤的免疫反應(yīng)性更強(qiáng)。

綜上所述，TRP基因家族構(gòu)建的預(yù)后模型具有預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的能力，且可以指導(dǎo)膠質(zhì)瘤的臨床診療，但TRP基因家族在膠質(zhì)瘤進(jìn)展及影響免疫細(xì)胞浸潤的潛在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。