METTL3在早期鱗狀細胞宮頸癌中的表達及其與臨床特征和預后的關系

王彩霞，盧 寒，周 宏，帥翰林，李玉潔

宮頸癌是全世界婦女癌癥死亡的第四大原因。盡管進行了廣泛的宮頸癌篩查，全球宮頸癌的發(fā)病率正在下降，但它仍然是婦女癌癥相關死亡的主要原因之一。因此，探索一個新的宮頸癌診斷和預后的生物標志物對宮頸癌患者的個性化治療至關重要。

N6 -甲基腺苷(m6A)修飾作為真核細胞中mRNA最常見的修飾之一，在基因調控過程中，如mRNA的穩(wěn)定、剪接和翻譯等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。甲基化轉移酶3 (methyltransferase like 3, METTL3)作為主要的RNA腺苷甲基轉移酶，參與了腫瘤的各種生物學過程。既往發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，METTL3在胃癌組織中明顯增加，并且METTL3的表達隨著腫瘤分期和分級的進展而逐漸增加，可作為胃癌患者的一個不良預后因素。細胞實驗中敲低METTL3后人胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到顯著的抑制。此外，Li等發(fā)現(xiàn)METTL3基因可以通過PI3K/AKT途徑，誘導腫瘤細胞凋亡，從而抑制肺癌的發(fā)展。Wang等發(fā)現(xiàn)，METTL3表達水平在乳腺癌組織上調，敲低METTL3可以降低mRNA甲基化水平，減少腫瘤細胞增殖，加速細胞凋亡并抑制腫瘤生長；同時發(fā)現(xiàn)Bcl-2可作為 METTL3 的靶點，調節(jié)乳腺腫瘤細胞的增殖和凋亡。這些結果表明，METTL3可能通過抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡等在癌癥的進展中起重要作用。然而，METTL3在鱗狀細胞宮頸癌中的表達情況尚未見報道，本研究旨在探討METTL3在早期鱗狀細胞宮頸癌中的表達及其與臨床特征和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入2008年1-12月于武警廣東總隊醫(yī)院和暨南大學附屬第一醫(yī)院收治的宮頸癌患者110例，納入標準：(1)經病理證實為FIGOⅠb1-Ⅱa(2018 FIGO分期)鱗狀細胞宮頸癌患者；(2)行廣泛性子宮切除術及雙側盆腔淋巴結清掃術，術前有或無輔助治療，術后取得新鮮手術標本及相鄰正常宮頸組織，癌旁正常組織為距腫瘤病灶5 cm以上的組織，經免疫組織化學染色證實； (3)既往無其他癌癥病史； (4)臨床資料及隨訪資料齊全。排除標準：(1)接受姑息性手術； (2)手術中確認有遠處轉移或腹膜播散。所有患者均簽署知情同意書，本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法 分析METTL3在宮頸癌標本和相鄰非腫瘤宮頸組織標本中的表達水平，并根據(jù)METTL3的表達水平將患者分成METTL3高/低表達組。收集臨床病理資料，包括年齡、FIGO分期、腫瘤大小、淋巴血管間隙浸潤、宮頸深部間質浸潤、盆腔淋巴結轉移，以及隨訪時間和生存狀態(tài)，分析METTL3表達水平及其與臨床病理特征預后的關系。

1.2.1 主要試劑及儀器 鼠抗人METTL3單克隆抗體購自美國 ProteintechGroup公司，免疫組化檢測試劑盒及PBS緩沖液購自武漢Servicebio生物科技有限公司，DAB試劑盒購自上海碧云天公司。免疫組織化學染色方法染色步驟嚴格按 SP試劑盒說明書進行。

1.2.2 METTL3免疫組化檢測與評定 所有石蠟包埋切片均切成厚度為 4～6 μm，在65 ℃烘箱中加熱30 min后放入二甲苯中脫蠟；而后在3%的HO中進行抗原修復，冷卻至室溫，用免疫組化專用封閉液將切片封閉30 min；接著將切片用鼠抗人METTL3 單克隆抗體孵育4 ℃過夜。在孵二抗前將切片從冰箱拿出回溫30 min，接著切片用二抗室溫孵育30 min，PBS洗5 min，二氨基聯(lián)苯染色5 min。染色結果按兩個標準評分：(1)腫瘤細胞染色陽性比例，分為0(無)、1(1%～10%)、2(11%～50%)、3(51%～75%)、4 (76%～100%)；(2)陽性細胞平均強度，分為0(無)、1(弱)、2(中等)、3(強)。將比例分數(shù)和強度分數(shù)相乘，得到復合總分(范圍0～12)。根據(jù)總分的平均數(shù)數(shù)值，將METTL3的表達水平分為高、低兩組，高于平均值的為METTL3高表達組。

1.2.3 治療方案 34例(30.3%)術前接受2～3個周期的化療。化療方案為紫杉醇175 mg/m，順鉑60 mg/m；每3周重復1次。術后對有盆腔淋巴結轉移、切緣陽性、癌旁浸潤等危險因素的病例同時加放化療?；煼桨笧轫樸K40 mg/m，每周第1天，共4～5個周期?？倓┝繛?0 Gy，每日2.0 Gy，每周5次。

1.2.4 隨訪方法 總生存期 (OS) 定義為從治療到因任何原因死亡的時間?？傠S訪時間定義為從手術日期到最后一次就診的時間(以月為單位)，隨訪截至2020-06-30。

2 結 果

2.1 一般情況 在110例鱗狀細胞宮頸癌患者中，52例為Ib1期，20例為Ib2期，38例為IIa期。平均年齡(45.3±10.1)歲，腫瘤平均(2.8±1.4)cm，存活患者的隨訪時間平均(58.6±7.9)月。

2.2 METTL3在鱗狀細胞宮頸癌組織中的表達 免疫組織化學檢測結果顯示，鱗狀細胞宮頸癌患者腫瘤樣本METTL3 的表達水平(2.705±0.273)低于癌旁正常組織(8.574±0.421)，差異有統(tǒng)計學意義(<0.01，圖1)。

2.3 鱗狀細胞宮頸癌中METTL3表達與臨床病理特征的關系 METTL3的低表達與較高的FIGO分期(=0.041)和盆腔淋巴結轉移(=0.001)有關。METTL3的表達與其他臨床病理特征之間不存在相關性(表1)。

2.4 METTL3 表達水平與鱗狀細胞宮頸癌預后的關系 與METTL3 表達水平較高的患者相比，METTL3 表達水平較低的患者的總生存期 (OS)明顯短(=3.576，95%CI：1.474～8.677，=0.0048)(圖2)。采用Cox比例風險模型單變量生存分析顯示，F(xiàn)IGO 分期(=5.526，95% CI: 1.315～21.791，<0.001)、盆腔淋巴結轉移(=3.315, 95% CI: 1.115～9.189,=0.04) 和 METTL3 表達水平(=13.5，95% CI: 2.321～31.105，=0.001) 是早期宮頸癌患者OS的預測因子。多變量生存分析也顯示了類似的結果，METTL3低表達(=6.187，95% CI: 2.314～21.292，=0.004)、FIGO分期(=5.109，95% CI: 1.891～11.135，<0.01)和盆腔淋巴結轉移(=2.395, 95% CI: 1.156～4.879,=0.017)是早期鱗狀細胞宮頸癌患者OS的獨立影響因素(表2)。

3 討 論

作為一種高度動態(tài)的mRNA修飾，m6A甲基化是由甲基轉移酶、去甲基化酶和結合蛋白三者共同催化的，m6A甲基化轉移酶和去甲基化酶之間的相互作用在RNA剪接、蛋白質翻譯等生物過程中起著關鍵作用。然而，m6A修飾在人類疾病，特別是癌癥中的作用和臨床意義才剛剛開始被探索。作為一種主要的m6A甲基化轉移酶，METTL3以獨立于m6A或者m6A依賴的方式發(fā)揮作用。過表達的METTL3定位于轉錄起始位點，不依賴于其甲基化轉移酶活性的情況下增強癌基因翻譯。失調的METTL3也可通過m6A修飾影響下游靶基因，促進癌癥進展。例如，METTL3可以通過增加miR221表達和促進AFF4/ MYC信號網(wǎng)絡的成熟來促進膀胱癌細胞的增殖。在白血病中，人類髓系白血病細胞系中的METTL3缺失可以誘導細胞分化和凋亡，并延緩白血病進展。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)METTL3可以在宮頸癌的進展中發(fā)揮抑癌作用，它在宮頸腫瘤組織中下調，并與不良預后相關。

本研究結果表明，METTL3在早期鱗狀細胞宮頸癌中低表達，該蛋白表達的下降與較高的FIGO分期和較多的盆腔淋巴結轉移相關(<0.05)。根據(jù)METTL3的表達水平是否超過平均水平，將患者分為METTL3的高表達和低表達組。與METTL3 高表達組相比，METTL3低表達組患者的總生存期(OS)明顯縮短。多變量Cox分析表明FIGO分期和盆腔淋巴結轉移是早期鱗狀細胞宮頸癌預后不良的獨立影響因素(<0.05)，同時，METTL3的低表達也是一個獨立的預后因素(<0.05)。

我們推測METTL3參與的機制與其他癌癥類型相似，Wu等揭示METTL3能增強致癌基因的翻譯，促進腫瘤細胞的增殖和侵襲。Chen等報道，METTL3在人類肝細胞癌中明顯上調，且與預后不良有關。敲除METTL3可大幅降低肝癌細胞在體外的增殖和遷移能力，并可顯著抑制肝癌細胞的致瘤性及體內的肺轉移能力。這些數(shù)據(jù)表明，METTL3可能作為一種致癌基因，參與了腫瘤的進展。最近研究發(fā)現(xiàn)，METTL3通過調節(jié)癌基因的翻譯在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，敲低METTL3降低了胃癌細胞中的Bcl-2，并增加了Bax和Caspase-3的活性，這表明凋亡途徑被激活。Shi等發(fā)現(xiàn)，METTL3在乳腺癌中低表達，并與三陰性乳腺癌的短期無轉移生存密切相關，可通過降低三陰性乳腺癌細胞系中的m6A水平來增強遷移、侵襲和黏附的能力，最終促進腫瘤細胞的轉移。在結腸癌中METTL3通過抑制SOCS2促進細胞增殖來維持癌細胞的致瘤性。Xia等發(fā)現(xiàn)，與相鄰的非惡性食管黏膜組織相比，METTL3 在食管鱗狀細胞癌組織中上調，并且 METTL3的較高表達水平與較低的存活率相關，METTL3 表達水平是食管鱗狀細胞癌患者無病生存和總生存期的獨立預測因子。這可能與METTL3通過YTHDF1/HK2修飾促進Warburg效應，通過加速糖酵解和YTHDF1/HK2軸發(fā)揮致癌因子的作用有關。在宮頸癌中，METTL3 表達與腫瘤組織中 CD33細胞的密度呈正相關，并且與患者 DFS 或 OS 縮短顯著相關。研究表明，METTL3的表達與RAS癌基因家族成員之一的RAB2B的表達顯著相關，RAB2B 的過表達可以顯著抑制腫瘤細胞增殖，表明METTL3可以通過RAB2B的轉錄后修飾調控宮頸癌的惡性程度。

總之，METTL3表達水平在早期鱗狀細胞宮頸癌組織中降低，F(xiàn)IGO分期、盆腔淋巴結轉移及METTL3表達水平是早期宮頸癌患者生存不良的獨立預后因素，表明METTL3可能為新的潛在預后標志物和宮頸癌的治療靶點，但仍需要進一步研究所涉及到的分子機制及信號通路。