脊柱結(jié)核患者骨密度與骨髓間充質(zhì)干細胞遷徙研究

郭超峰，胡小江，李 韜，張宏其，高琪樂，唐明星，劉少華，李艷冰

[1. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院骨科脊柱外科，湖南 長沙 410008； 2. 國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(湘雅醫(yī)院)，湖南 長沙 410008； 3. 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院檢驗科，湖南 長沙 410008]

脊柱結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌侵入椎體及附件引起的一類繼發(fā)性感染疾病。近年來，由于人口基數(shù)居高不下、人口流動率高以及耐藥菌的出現(xiàn)，脊柱結(jié)核發(fā)病率有回升的趨勢[1]。國內(nèi)外臨床研究[2-3]顯示，脊柱結(jié)核患者骨質(zhì)減少，骨質(zhì)疏松發(fā)生率明顯高于正常人。目前引起脊柱結(jié)核患者骨質(zhì)減少的病因尚未完全明確，有研究[3]顯示，脊柱結(jié)核患者骨質(zhì)疏松的發(fā)生可能與患者成骨分化能力不足相關(guān)。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一種存在于骨髓或骨膜中具有增殖分化為骨、軟骨、脂肪組織的潛能細胞，在細胞培養(yǎng)瓶中具有貼壁生長的趨勢。BMSCs是成骨細胞的前體細胞，在增殖分化之前需接受“指令”從而遷徙到目標位置[4]。BMSCs的遷徙能力是其成骨分化的前提條件，BMSCs遷徙能力受限將影響其成骨分化能力，并可能最終導(dǎo)致宿主骨質(zhì)減少[5-6]。目前，針對脊柱結(jié)核患者BMSCs成骨分化的相關(guān)研究較少，結(jié)核分枝桿菌對宿主BMSCs遷徙能力的影響更鮮見報道。

本研究收集脊柱結(jié)核患者和對照人群的骨密度信息，并提取兩者的BMSCs，比較兩者BMSCs遷徙能力的差異，同時向BMSCs中加入卡介苗(BCG)進行共培養(yǎng)，模擬結(jié)核分枝桿菌感染環(huán)境，進一步觀察BMSCs遷徙能力的變化，以期闡明宿主因素和環(huán)境因素對BMSCs遷徙能力的影響，進而為脊柱結(jié)核患者骨代謝異常的相關(guān)研究提供方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2020年6月1日—2021年12月1日中南大學(xué)湘雅醫(yī)院脊柱外科住院確診為脊柱結(jié)核行脊柱內(nèi)固定的患者為結(jié)核組，胸腰椎骨折或椎管狹窄行脊柱內(nèi)固定的患者為對照組。本研究已獲得中南大學(xué)倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：①結(jié)核組需通過培養(yǎng)、Xpert等確診脊柱結(jié)核；②年齡18～75歲；③患者自愿接受骨密度測定。排除標準：①有吸煙、喝酒等不良嗜好者；②有風(fēng)濕性疾病、自身免疫性疾病者；③垂體功能障礙者；④腫瘤患者或既往患腫瘤者。

1.3 儀器和試劑 BCG(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司)、人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)、DMEM F12(1∶1)1×(Gibco，美國)、FBS(BI，以色列)、胰酶(0.25% TRYPSIN-EDTA，Gibco，美國)、雙能X線(型號：Discovery Wi S/N87047)。

1.4 骨密度測定 應(yīng)用雙能X線掃描測量所有納入人群腰椎1～4(L1～4)骨密度(g/cm2)。

1.5 BMSCs的提取與培養(yǎng) 取結(jié)核組和對照組患者(各6例)手術(shù)時采集的釘?shù)姥? mL，立即轉(zhuǎn)入無菌真空肝素管內(nèi)，迅速置于二級生物安全實驗室內(nèi)，用同等體積的生理鹽水稀釋。隨后將稀釋后的釘?shù)姥徛又梁? mL人外周血淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，使血液處于淋巴細胞分離液的上層。離心(10 min，1 000 g)后取中間白色云霧狀細胞層于另1支離心管中，加入DMEM F12(1∶1)1×稀釋后離心(10 min，1 000 g)，棄上清液，將離心管底部原代BMSCs用含15%FBS的DMEM F12(1∶1)1×的培養(yǎng)基重懸，移至細胞培養(yǎng)瓶中，并于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后每3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)單層細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%后用胰酶(0.25% TRYPSIN-EDTA)傳代，并將原代BMSCs凍存于液氮內(nèi)，后續(xù)傳代細胞用于正式試驗，BMSCs代數(shù)不超過4代。

1.6 細胞劃痕試驗 ①將每例患者第1代BMSCs接種于6孔板(1.3×104細胞/孔)中，用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中3孔加入BCG(1.3×105CFU/孔)，即為BCG共培養(yǎng)，3孔未加BCG者即為單純培養(yǎng)。②用劃痕細胞耙在每孔劃痕3條，BCG共培養(yǎng)和單純培養(yǎng)各3孔、9條劃痕，取9條劃痕細胞遷徙率的平均值用作后續(xù)統(tǒng)計分析。③用1 mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗細胞3次，去除非貼壁細胞并使劃痕邊緣光滑；分別于0、第8小時、第16小時、第24小時用倒置顯微鏡拍攝(4×)細胞遷徙愈合圖像，用ImageView軟件測定每條劃痕的寬度，測定結(jié)果取平均值。

1.7 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用構(gòu)成比描述，比較采用卡方檢驗；各組患者年齡和骨密度、BMSCs遷徙率比較采用ANOVA檢驗，成對比較采用LSD-t檢驗；使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析骨密度和BMSCs遷徙率的相關(guān)性，以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度檢測結(jié)果 結(jié)核組納入病例72例，對照組納入病例76例，兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.5)。結(jié)核組患者的骨密度低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者基本資料及骨密度檢測結(jié)果

2.2 BMSCs遷徙能力 兩組患者釘?shù)姥獎澓墼囼灲Y(jié)果顯示，在第8小時、第16小時結(jié)核組患者BMSCs遷徙率小于對照組(P<0.05)；在第24小時結(jié)核組BMSCs遷徙率數(shù)值仍小于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1～2。

2.3 BCG對BMSCs遷徙能力的影響 結(jié)核組BCG共培養(yǎng)與單純培養(yǎng)比較，對照組BCG共培養(yǎng)與單純培養(yǎng)比較，不同時間BMSCs遷徙率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。在第8小時、第16小時，結(jié)核組BCG共培養(yǎng)BMSCs遷徙率低于對照組BCG共培養(yǎng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在第24小時，結(jié)核組BCG共培養(yǎng)與對照組BCG共培養(yǎng)BMSCs遷徙率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖1～2。

表2 兩組患者BCG共培養(yǎng)及單純培養(yǎng)不同時間BMSCs遷徙率(μm/h)

2.4 BMSCs遷徙率與骨密度相關(guān)分析 將BMSCs遷徙率與標本來源患者的椎體骨密度進行Pearson直線相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第8小時、第16小時患者骨密度和患者BMSCs遷徙率相關(guān)系數(shù)(r值)分別為0.80、0.67(均P<0.05)；在第24小時兩者r值為0.51(P>0.05)。見圖3。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，相較胸腰椎骨折或椎管狹窄患者，脊柱結(jié)核患者骨密度明顯降低。脊柱結(jié)核患者骨質(zhì)疏松的發(fā)生率明顯上升[3]，在脊柱結(jié)核小鼠模型中也發(fā)現(xiàn)結(jié)核小鼠骨小梁密度普遍降低[7]。結(jié)核分枝桿菌可降低成骨細胞骨保護素(OPG)的表達，增強核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的表達，且能誘導(dǎo)成骨細胞凋亡[8]。BMSCs作為成骨細胞的前體細胞，與脊柱結(jié)核患者的骨代謝密切相關(guān)。BMSCs可吞噬結(jié)核分枝桿菌造成持續(xù)感染狀態(tài)[9]，并使機體作出相應(yīng)的免疫應(yīng)答[10]。

BMSCs向病灶區(qū)域的遷徙和聚集，是啟動成骨分化的必要條件[11]。劃痕試驗是一種用于研究細胞遷移和細胞間相互作用的實驗室技術(shù)，通過半定量的方法來測定細胞遷徙率，從而反映細胞的遷徙能力強弱[12]。影響B(tài)MSCs遷徙的因素有很多：包括趨化因子[基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)]、細胞因子[骨調(diào)素(OPN)]和生長因子[轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)]等化學(xué)因素，以及生理循環(huán)靜水壓、流體剪切應(yīng)力、骨基質(zhì)形變和脈沖電磁場等物理因素[4]。影響B(tài)MSCs遷徙能力的因素，最終也會對BMSCs的成骨能力造成影響。本研究將患者BMSCs遷徙率與椎體骨密度進行Pearson直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，患者骨密度與BMSCs遷徙率之間具有相關(guān)性。關(guān)于BMSCs遷徙的研究逐漸成為了成骨機制研究的重點，但關(guān)于脊柱結(jié)核患者BMSCs遷徙能力的研究鮮有報道。

本研究中，脊柱結(jié)核患者BMSCs的遷徙能力低于對照組，此與脊柱結(jié)核患者骨密度降低、骨代謝紊亂的臨床表現(xiàn)相符合。在脊柱結(jié)核感染的過程中，病灶中的結(jié)核分枝桿菌是否會影響B(tài)MSCs遷徙能力的下降，從而造成脊柱結(jié)核患者成骨的減弱？為驗證此假設(shè)，研究將BCG和BMSCs共培養(yǎng)以模擬脊柱結(jié)核椎體病灶環(huán)境。共培養(yǎng)后的劃痕試驗表明，BCG的存在對BMSCs的遷徙能力影響并不明顯，可能與BCG致病力不足有關(guān)，但在共培養(yǎng)的條件下仍然觀察到脊柱結(jié)核患者BMSCs遷徙能力出現(xiàn)進一步下降的趨勢，與Rahyussalim等[13]在體外細胞試驗中結(jié)核分枝桿菌不影響B(tài)MSCs的生長和分化的結(jié)論一致。因此，推測結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病患者疾病嚴重程度的差異主要是因為宿主和環(huán)境因素，而結(jié)核分枝桿菌變異造成的影響較小[14]。結(jié)核病患者存在多個易感基因，宿主對于結(jié)核分枝桿菌感染的免疫反應(yīng)受多個易感基因共同調(diào)控。Gao等[15]對208例脊柱結(jié)核患者和210名健康志愿者進行DNA測序分析后發(fā)現(xiàn)，MCP-1-2518 GG基因型和G等位基因的存在，可能與中國漢族人群對脊柱結(jié)核的易感性有關(guān)；2020年Xu等[16]研究表明，MC3R rs6127698基因的多態(tài)性與多灶性結(jié)核病的易感性有關(guān)；2013年郭超峰等[17]研究發(fā)現(xiàn)，單核細胞趨化蛋白1基因多態(tài)性、人血清中單核細胞趨化蛋白1的表達水平與脊柱結(jié)核易感性相關(guān)；最近，Li等[18]研究表明，SLC11A1 rs17235409基因的多態(tài)性與脊柱結(jié)核的易感性有關(guān)。

本試驗存在以下不足：①共培養(yǎng)使用的是無毒的BCG，而不是結(jié)核分枝桿菌強毒株，可能對試驗結(jié)果產(chǎn)生一定影響。但無毒的BCG抗原性和強毒株一致，且研究[19]表明BCG和結(jié)核分枝桿菌強毒株引起某些細胞因子、生長因子升高的水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Inoue等[20]研究也曾使用BCG代替結(jié)核分枝桿菌進行研究，因此本試驗共培養(yǎng)也采用BCG模擬脊柱結(jié)核椎體病灶環(huán)境。②本研究基于現(xiàn)有條件只采集了6對BMSCs進行試驗，在一定程度上可能存在偏倚。

綜上所述，本研究在臨床上發(fā)現(xiàn)脊柱結(jié)核患者骨密度降低，提出脊柱結(jié)核分枝桿菌感染影響B(tài)MSCs遷徙能力的假設(shè)，從而研究脊柱結(jié)核患者BMSCs遷徙能力的改變以及BCG對于脊柱結(jié)核患者BMSCs遷徙率的影響，并通過已有的樣本分析骨密度與BMSCs遷徙率的相關(guān)性。本組研究發(fā)現(xiàn)，脊柱結(jié)核患者BMSCs遷徙率減低，BCG對BMSCs的遷徙能力無明顯影響，且骨密度與BMSCs遷徙率之間具有相關(guān)性。結(jié)果提示脊柱結(jié)核患者骨密度降低與BMSCs遷徙能力的減低存在相關(guān)性，但暴露于結(jié)核分枝桿菌抗原并不引起B(yǎng)MSCs遷徙能力減低，推測脊柱結(jié)核患者BMSCs遷徙能力的減低主要與宿主自身因素相關(guān)，而結(jié)核分枝桿菌的影響較弱。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。