骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠缺血性腦卒中炎癥反應(yīng)中小膠質(zhì)細(xì)胞的分子調(diào)控機(jī)制

柏秀娟，李一凡，時(shí)霄冰，姜磊，孫博，尚延昌，吳衛(wèi)平*

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心：1神經(jīng)內(nèi)科,2國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京100853)

近些年患缺血性腦卒中的人群越來(lái)越多，缺血性腦卒中除了可以引起局部腦組織的缺血性壞死，同時(shí)也啟動(dòng)了局部組織非特異性炎癥，這種非特異性炎癥反應(yīng)加重了腦組織缺血局部的壞死[1]。缺血性腦卒中發(fā)生后，針對(duì)其炎癥反應(yīng)應(yīng)答的首要細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞，早期主要是M2型反應(yīng)，持續(xù)時(shí)間短，隨后M1型反應(yīng)占主導(dǎo)地位[2,3]。這些M1型細(xì)胞為抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞，可以釋放如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等有害因子，從而加重腦組織神經(jīng)元的壞死，而M2型細(xì)胞抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞，主要發(fā)揮腦保護(hù)作用，所以M2型向M1型細(xì)胞極化加重了神經(jīng)元損傷，降低了神經(jīng)修復(fù)[4-8]。很多研究發(fā)現(xiàn)體外間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)可以調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的這種表型轉(zhuǎn)化，前期我們的研究已經(jīng)證實(shí)了移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)可以使大鼠腦卒中缺血區(qū)的M1型細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[9]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，趨化因子CX3C配體1(ligand 1 of CX3C，CX3CL1)可能參與了調(diào)控MSC對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化，它具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和遷移、促進(jìn)神經(jīng)損傷的修復(fù)等作用[10,11]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，趨化因子CX3C受體1(recepor 1 of CX3C，CX3CR1)主要在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，其配體CX3CL1主要在神經(jīng)元表達(dá)，CX3CL1-CX3CR1相結(jié)合的途徑在維持小膠質(zhì)細(xì)胞的功能方面發(fā)揮著重要作用[12]。那么腦缺血時(shí)MSC能否通過(guò)分泌CX3CL1來(lái)調(diào)控M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞在缺血區(qū)的分布，從而調(diào)節(jié)和控制缺血后的炎癥反應(yīng)。我們前期已成功構(gòu)建和包裝了CX3CL1的干擾慢病毒，并順利將其轉(zhuǎn)染至BMSC細(xì)胞，高效抑制了BMSC的CX3CL1基因的表達(dá)[13]。本研究在構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型的基礎(chǔ)上，移植BMSC及被CX3CL1干擾慢病毒感染的BMSC，進(jìn)一步闡明BMSC是否通過(guò)分泌CX3CL1逆轉(zhuǎn)抗炎型、促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織的分布，初步探討B(tài)MSC體內(nèi)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

選擇SD大鼠30只，3周齡，購(gòu)買(mǎi)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)購(gòu)于Sigama公司；TritonX-100購(gòu)于上海生工；一抗Iba抗體和TNF-α抗體及CD206抗體(兔來(lái)源)、二抗Alexa Fluor FITC抗體和CY3抗體(抗兔)均購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液均購(gòu)自北京碧云天公司。

1.2 大鼠MCAO模型的構(gòu)建及分組方法

參照改良的Zea Longa線(xiàn)栓法構(gòu)建SD大鼠的MCAO模型。沿著大鼠頸部正中進(jìn)行切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈大約1.0～1.5 cm，可見(jiàn)頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈呈“Y字形”。結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈的近心端，并在頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)埋線(xiàn)，用動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸總動(dòng)脈近心端的結(jié)扎處剪一“V”形切口，用眼科鑷夾持住栓線(xiàn)由頸總動(dòng)脈進(jìn)入到頸內(nèi)動(dòng)脈，到達(dá)動(dòng)脈夾時(shí)，將埋線(xiàn)稍微拉緊，用以防止?jié)B血，然后松開(kāi)動(dòng)脈夾，繼續(xù)插入栓線(xiàn)，當(dāng)栓線(xiàn)黑色標(biāo)記處到達(dá)Y字形分叉口時(shí)，表明栓線(xiàn)已進(jìn)入大腦中動(dòng)脈且不能繼續(xù)前行。栓線(xiàn)插入完畢后，將預(yù)留的結(jié)扎線(xiàn)拉緊固定。90 min過(guò)后，在SD大鼠頸部打開(kāi)一個(gè)小口，用眼科鑷夾住栓線(xiàn)的固定處，然后將栓線(xiàn)拔出約1 cm，通過(guò)其他血管如翼鄂動(dòng)脈和對(duì)側(cè)的血液進(jìn)入右側(cè)大腦中動(dòng)脈從而實(shí)現(xiàn)血流的再灌注。大鼠于造模24 h后，參照Z(yǔ)ea Longa 5級(jí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分(圖1)。將神經(jīng)功能評(píng)分在0和4分的大鼠剔除，選擇評(píng)分在1～3分的大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

圖1 MCAO模型神經(jīng)功能評(píng)分

本研究共納入大鼠30只，MCAO模型構(gòu)建使用大鼠29只，做TTC染色使用大鼠1只。MCAO模型構(gòu)建剔除大鼠9只；納入模型大鼠20只，其中2只做TTC染色；將剩余模型大鼠18只隨機(jī)分為2組，每組9只。對(duì)照組為模型大鼠注射BMSC，實(shí)驗(yàn)組為模型大鼠注射CX3CL1干擾慢病毒感染的BMSC[13]。

1.3 TTC染色

隨機(jī)取2只模型大鼠和1只正常大鼠均麻醉，迅速取出大腦，置于-80 ℃冰箱中冷凍5 min左右。一般沿著大腦的冠狀位進(jìn)行切片，厚度2 mm。將切片置于1%TTC中，于37 ℃的水浴箱內(nèi)孵育15 min左右。將染色完成的切片取出，然后進(jìn)行固定。拍照檢測(cè)梗死體積大小。

1.4 側(cè)腦室定位注射BMSC

1.4.1 側(cè)腦室注射BMSC 實(shí)驗(yàn)鼠稱(chēng)重并麻醉，頭部備皮后固定于腦立體定位儀，沿中線(xiàn)切開(kāi)頭皮，剝離筋膜，標(biāo)記前囟，高速顱骨鉆于右側(cè)腦室注射部位正上方鉆穿顱骨，插入微量注射器，注射速度0.5 μl/min，注射劑量5 μl/只(含細(xì)胞105個(gè))，注射完成后涂抹骨蠟，完成腦定位注射。

1.4.2 取材 在干細(xì)胞注射1、3、7 d后取材，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只大鼠。實(shí)驗(yàn)鼠稱(chēng)重并麻醉，開(kāi)胸腹暴露肝臟和心臟，注射針插入左心室并剪開(kāi)右心耳，快速灌注生理鹽水至肝臟變白，待右心耳流出澄清液體后換用4%多聚甲醛固定液，先快速再緩慢灌注至大鼠肝臟變硬肢體僵直，斷頭取腦，腦組織固定，4 ℃保存用于免疫熒光檢測(cè)。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

1.5.1 制作切片 冠狀位取樣，取樣后用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)清洗，4%多聚甲醛固定。首先是組織石蠟制作，主要經(jīng)過(guò)脫水、透明、透蠟、包埋、切片及烤片；然后石蠟切片脫蠟復(fù)水；最后熱抗原修復(fù)，下接免疫熒光染色步驟。

1.5.2 免疫熒光染色 在切片組織上滴加0.5% TritonX-100，室溫打孔60 min，PBS浸洗3次。然后滴加山羊血清，室溫封閉60 min。每張切片滴加稀釋好的一抗Iba(比例為1∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜。室溫下復(fù)溫30 min，然后滴加足量稀釋好的熒光二抗cy3(比例為1∶800)，37 ℃孵育60 min。滴加稀釋好的一抗TNF-α(比例為1∶400)、CD206(比例為1∶200)，37 ℃孵育60 min。然后滴加稀釋好的足量熒光二抗FITC(比例為1∶800)，37 ℃孵育60 min。最后進(jìn)行細(xì)胞核染色，用含抗熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)雙染細(xì)胞數(shù)并采集圖像。每個(gè)樣本3個(gè)切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，在激光掃描共聚焦顯微(400×)下計(jì)數(shù)每個(gè)視野雙染重合陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)(Iba+CD206+、Iba+TNF-α+)，并采集部分圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TTC染色結(jié)果

TTC染色結(jié)果可見(jiàn)2只MCAO模型大鼠均存在大腦中動(dòng)脈供血區(qū)的梗死病灶，1只正常大鼠大腦未見(jiàn)梗死病灶，梗死病灶為蒼白色，正常組織為紅色(圖2)。

圖2 TTC染色結(jié)果

2.2 免疫熒光染色結(jié)果

2.2.1 Iba+CD206+免疫熒光染色結(jié)果 與實(shí)驗(yàn)組相比，對(duì)照組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)缺血區(qū)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba+CD206+)的數(shù)量明顯增加(均P<0.05；表1)。干細(xì)胞注射后1、3、7 d后的Iba+CD206+雙染陽(yáng)性的細(xì)胞，詳見(jiàn)圖3。

圖3 Iba+CD206+免疫熒光圖片

2.2.2 Iba+TNF-α+免疫熒光染色結(jié)果 在第3天和第7天促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba+TNF-α+)的數(shù)量明顯減少(均P<0.05；表1)。干細(xì)胞注射后1、3、7 d后的Iba+ TNF-α+雙染陽(yáng)性的細(xì)胞，詳見(jiàn)圖4。

表1 Iba+CD206+/Iba+TNF-α+雙染陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較

圖4 Iba+TNF-α+免疫熒光圖片

3 討 論

缺血性腦卒中是導(dǎo)致人類(lèi)殘疾、死亡的重要疾病之一。合理減輕腦梗死后的炎癥反應(yīng)，可改善腦組織的繼發(fā)性損傷，在腦梗死的治療中起著比較關(guān)鍵的作用。在正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織中都是靜息狀態(tài)[14]，缺血性腦血管病發(fā)生后小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化增殖，成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷應(yīng)答的主要效應(yīng)器，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[15]。因此，在腦組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的類(lèi)型轉(zhuǎn)化已成為缺血性腦血管病治療的潛在靶點(diǎn)，探尋可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞有效的干預(yù)措施將為缺血性腦卒中的治療帶來(lái)新的希望。

近年來(lái)，干細(xì)胞的特殊修復(fù)作用讓其獲得了研究者們的青睞，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)開(kāi)展了諸多圍繞著干細(xì)胞的研究課題。有研究報(bào)道，BMSC可以緩解心血管疾病的癥狀，保護(hù)器官的功能并修復(fù)受損的組織[16,17]。已有研究證實(shí)MSC可以改善腦卒中動(dòng)物的神經(jīng)功能，主要集中在神經(jīng)再生及修復(fù)方面，但MSC能否調(diào)控卒中后炎癥反應(yīng)鮮有報(bào)道。近年很多研究結(jié)果表明MSC對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、增殖及功能均可產(chǎn)生一定的影響，然而具體作用機(jī)制還不是很明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CX3CL1可能參與了MSC對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)控，CX3CL1-CX3CR1信號(hào)途徑對(duì)維持小膠質(zhì)細(xì)胞的功能發(fā)揮重要作用，此信號(hào)途徑激活后小膠質(zhì)細(xì)胞主要表現(xiàn)為神經(jīng)保護(hù)型，而破壞此途徑后小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)為神經(jīng)毒性[18,19]。

因此，我們?cè)跇?gòu)建大鼠MCAO模型的基礎(chǔ)上移植BMSC及被CX3CL1慢病毒感染的BMSC，進(jìn)一步闡明BMSC是否通過(guò)分泌CX3CL1來(lái)完成這種逆轉(zhuǎn)作用。本實(shí)驗(yàn)成功建立了SD大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，然后將其分為2組，對(duì)照組為MCAO模型注射BMSC組，實(shí)驗(yàn)組為MCAO模型注射CX3CL1慢病毒感染的BMSC組，每組處理3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(干細(xì)胞注射后1、3、7 d)。每張切片均進(jìn)行抗Iba和抗CD206/TNF-α雙重免疫熒光染色，然后在光掃描共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)雙染重合陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)并采集圖像。最后對(duì)這2組模型不同時(shí)間點(diǎn)雙染陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)BMSC移植使梗死區(qū)抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞(CD206陽(yáng)性)明顯增加，促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞(TNF-α陽(yáng)性)明顯減少，移植被CX3CL1慢病毒感染的BMSC就沒(méi)有這種逆轉(zhuǎn)作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明移植BMSC可能通過(guò)釋放CX3CL1來(lái)完成小膠質(zhì)細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)，使腦組織缺血區(qū)的促炎型小膠質(zhì)細(xì)胞向抗炎型小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，這可為缺血性腦卒中后干細(xì)胞的治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。