微小RNA-21 靶向抑制c-Ski 在轉化生長因子-β1 介導人冠狀動脈內皮細胞上皮間充質轉化中的作用△

韓素霞，朱 頻，盛樂智，杜煥華，陸 錚，崔珍玉

（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院心內科，上海 201200）

心力衰竭（heart failure，HF）是心血管疾病終末期階段，而心肌纖維化為HF 進展中的重要事件［1-4］。內皮-間充質轉化（endothelial-mesenchy?mal transition，EMT）是心肌纖維化的重要病理變化過程，在此過程中轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）1為關鍵啟動因子之一［5-7］。有研究報道，TGF-β 信號通路活化與c-Ski 等多種因子調控有關，并可促進成纖維細胞的存活和增殖［8-11］，但TGF-β 如何影響c-Ski 表達尚不明確。

微小RNA（microRNA，miR）為體內調控特定蛋白的重要非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 參與調節(jié)心肌纖維化的重要分子信號通路［12-15］。有鑒于此，本研究通過構建TGF-β1 誘導人冠狀動脈內皮細胞（human coronary artery endothelial cells，HCAEC）構建細胞EMT 模型，研究miR-21 對c-Ski的調控關系，從而闡明TGF-β-miR-21-c-Ski 調控軸在心肌纖維化進展中的意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

HCAEC 購自上海澤葉生物科技有限公司。DMEM 高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清、胰酶購自美國Gibco公司；細胞用青霉素和鏈霉素購自上海碧云天生物技術有限公司；總RNA分離提取試劑TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；miR 轉染試劑LipofectamineTM3000 試劑購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（fluores?cence quantitative polymerase chain reaction，fqPCR）檢測試劑盒購自日本TaKaRa 公司；RIPA 裂解液，BCA 蛋白定量檢測試劑盒，鼠抗人GAPDH 單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗鼠及抗兔二抗購自上海碧云天生物技術有限公司。ECL化學發(fā)光試劑盒購自Millipore 公司。CD31、vimentin 蛋白一抗購自CST 公司，α-平滑肌肌動蛋白（smooth muscle actin，SMA）、c-Ski 蛋白一抗購自Abcam 公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；TGF-β1 購自美國R&D System 公司；c-Ski 慢病毒過表達質粒plvx-cSki 購自漢陽生物有限公司；miR-21 mimics 及miR-21 inhibitor 購自生工生物工程（上海）股份有限公司。本研究通過倫理審批（審批號：PRYLL-QKJW1702），受試者知情同意。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HCAEC 細胞貼壁生長于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察期生長情況，隔日進行細胞傳代。

1.2.2 逆轉錄-熒光定量聚合酶鏈反應 收集各組細胞，根據(jù)說明書采用Trizol 法提取細胞總RNA，使用Thermo 公司的NanoDrop 超微量分光光度計檢測RNA 濃度，取1 μg RNA，2 μL 5×HiScriptII qRT SuperMix，RNase-Free ddH2O 補足10 μL 體系，50℃15 min，85℃5 s 合成cDNA，cDNA 產(chǎn)物-20℃保存。CD31、波形蛋白（vimentin，VIM）、α-SMA 及GAPDH 逆轉錄采用試劑盒配套隨機引物，而miR?NA 逆轉錄采用莖環(huán)引物，其中miR-21-5p 莖環(huán)引物為：5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACA CAG CC-3′。將cDNA 使用ddH2O 進行20 倍稀釋待測并按照以下體系進行擴增。反應總體積為10 μL：cDNA 4 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s擴增30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃5 min。所用引物miR-21-5p 為F：5′-CAA CAC CAG TCG ATG GGC TGT-3′，R：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。U6 為F：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，R：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。CD31引物為F：5′-AAC AGT GTT GAC ATG AAG AGC C-3′，R：5′-TGT AAA ACA GCA CGT CAT CCT T-3′。VIM 引物為F：5′-AGT CCA CTG AGT ACC GGA GAC-3′，R：5′-CAT TTC ACG CATCTGGCGTTC-3′。α-SMA 引物為F：5′-CCG AAT GCA GAA GGA GAT CA-3′，R：5′-GTG。GAPDH 引 物：5′-ACA ACT TTG GTA TCG TGG AAG G-3′，R：5′-GCC ATC ACG CCA CAG TTT C-3′。對于miR-21-5p 相對定量采用U6 為內參基因，對于CD31、VIM、α-SMA 相對定量采用GAP?DH 為內參基因。采用2-△△Ct法對目的基因進行定量，其中△△Ct=（Ct目的基因-Ct內參基因）處理組-（Ct目的基因-Ct內參基因）對照組。

1.2.3 免疫印跡（WB）采用RIPA（中）（加入cocktail 蛋白酶抑制劑）裂解每組樣品抽提總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒說明書進行蛋白定量，并加入6×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠Loading buffer 煮沸10 min。每組細胞取50 μg 蛋白上樣，在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳100 V 電壓條件下1.5 h，然后將蛋白轉膜至甲醇預處理的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，轉膜條件為最大電壓，恒流200 mA 1 h，轉膜結束后以5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃孵育過夜，次日磷酸鹽吐溫緩沖液（phos?phate buffered solution tween，PBST）漂洗3 次，每次10 min，加入1∶5 000 稀釋的HRP 標記的二抗室溫孵育2 h，PBST 漂洗3 次，每次10 min 后，用ECL化學發(fā)光液使用美國GE 公司ImageQuant LAS 4000 mini 進行結果掃描。

1.2.4 細胞轉染 按轉染試劑LipofectamineTM2000 說明書提供的方法進行293T 細胞轉染慢病毒感染。轉染前1 d，將293T 細胞進行消化鋪板，以（2.0～2.5）×105個/孔的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，用完全培養(yǎng)液置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；次日，當細胞融合度達80%～90%時進行轉染，將包裝質粒PsPAX2、pMD2G 和plvx-cSki按照1∶1∶2 的比例共2 μg 質?？傎|量進行轉染，轉染48 h 后，收集細胞上清凍存于-80℃過夜。將待感染細胞HCAEC 以（4.0～4.5）×105個/孔的密度接種于12 孔細胞培養(yǎng)板中，次日，當細胞融合度達40%～50%時，將培養(yǎng)基換為1 mL 病毒感染培養(yǎng)基（500 μL 完全培養(yǎng)基+500 μL 病毒液+1 μL 10 mg/mlpolybrene）感染6～8 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長滿更換為含有嘌呤霉素篩選培養(yǎng)基（濃度為2 μg/mL）進行細胞篩選，待未感染病毒液的對照空細胞全被殺死后，穩(wěn)轉細胞系構建成功，將其進行后續(xù)實驗。

1.2.5 熒光素報告載體 本實驗采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-21 靶向結合c-Ski 3′ UTR。根據(jù)廠商說明書，將野生型c-Ski 3′UTR 序列（5′AU?AAGCUA3′）和突變型c-Ski 3′ UTR 序列（5′AUC?CACUA3′）克隆至pGL3-Promoter 質粒中。將待測細胞鋪于12 孔板中，當細胞融合度達80%時，共使用lipo2000 轉染質粒和miR-21，并將海腎熒光素酶表達質粒共轉染至細胞中作為內參。轉染48 h 后，按照Promega 雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism 8.0 軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用（）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組比較采用Dunnet-t檢驗。以α=0.05 為檢驗水準，P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 c-Ski 及miR-21 在TGF-β1 誘導HCAEC 發(fā)生EMT 中的表達變化

fqPCR結果表明，與0ng/mL組相比，隨著TGF-β1 誘導濃度的增加，內皮標志物CD31 的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而細胞間充質標記物VIM和α-SMA的表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表1。c-Ski 的表達水平隨著TGF-β1 誘導濃度的增加逐漸減低（P＜0.05），而miR-21 的表達水平逐漸增加，詳見表2。因5 ng/mL TGF-β1 即可誘導HCAEC 發(fā)生EMT 變化，我們采用5 ng/mL 濃度的TGF-β1 進行后續(xù)試驗。同時，我們采用Western blotting 證實5 ng/mL TGFβ1 處理細胞可導致CD31 及c-Ski 表達水平顯著下降，而VIM、α-SMA 表達水平增加（圖1）。

圖1 TGF-β1 處理前后對各基因表達的影響

表1 TGF-β1 誘導HCAEC 后內皮間充質細胞標記基因表達變化

表2 TGF-β1 誘導HCAEC 后miR-21 及c-Ski 表達變化

2.2 過表達c-Ski對TGF-β1誘導HCAEC發(fā)生EMT 的影響變化

如圖2 所示，c-Ski 組細胞與對照組比較，高表達c-Ski，表明過表達試驗成功。如表3 所示：過表達c-Ski 組與對照組比較，CD31 水平顯著增高，而VIM、α-SMA 表達水平減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。TGF-β1 處理組與對照組比較CD31 水平下降，而VIM、α-SMA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。c-Ski 與TGF-β1 聯(lián)合處理組與對照組比較，CD31、VIM、α-SMA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 對照組與過表達c-Ski 組中c-Ski 的表達

表3 過表達c-Ski、TGF-β1 誘導及兩者聯(lián)合處理HCAEC 后內皮間充質細胞標記基因表達變化

2.3 抑制miR-21對TGF-β1誘導HCAEC發(fā)生EMT的影響變化

如表4 所示：miR-21 抑制物組與對照組比較，CD31 水平顯著增高，而VIM、α-SMA 表達水平減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。TGF-β1 處理組與對照組比較，CD31 水平下降，而VIM、α-SMA 表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。cmiR-21 抑制物+TGF-β1 處理組與對照組比較，CD31、VIM、α-SMA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 miR-21 抑制物、TGF-β1 誘導及兩者聯(lián)合處理HCAEC 后內皮間充質細胞標記基因表達變化

2.4 miR-21 在HCAEC 中對c-Ski 的調控作用

如圖3所示Targetscan預測了miR-21與c-Ski的結合位點。在HCAEC 細胞中轉染miR-21 mimics，fqPCR 結果表明：miR-21 過表達組細胞的c-Ski 轉錄水平（0.24±0.041）較對照組（1.00±0.20）顯著較少，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.31，P=0.0032）。免疫印跡結果也驗證了此結論（圖4）。此外如表5 所示，熒光素報告系統(tǒng)表明：miR-21 過表達組細胞內c-Ski-3′UTR 野生型報告載體的相對熒光強度顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而c-Ski-3′UTR 突變型報告載體的相對熒光強度與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01）。

圖3 miR-21 與c-Ski 的結合位點

圖4 miR-21 過表達對HCAEC 中c-Ski 的表達影響變化

表5 miR-21 過表達對HCAEC 中c-Ski3′UTR 報告載體的熒光表達影響變化

3 討論

心肌纖維化是多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的共同病理改變。近年來，內皮細胞向間充質轉化在心肌纖維化中的作用越來越受到廣大學者的關注。c-SKI 是一種核轉錄共抑制因子，可以負性調節(jié)TGF-β1/Smad 信號通路，在腫瘤、臟器纖維化、創(chuàng)傷愈合及代謝疾病等方面均有重要的作用。有鑒于此，本研究通過以HCAEC 作為細胞模型，首先利用TGF-β1 處理，誘導其發(fā)生EMT。本研究結果顯示，隨著TGF-β1濃度逐漸升高，HCAEC的表型逐漸從上皮型向間充質型發(fā)展，即表現(xiàn)為上皮型標記物CD31 減低，間充質型標記物VIM 及α-SMA表達上調，表明TGF-β1可成功誘導HCAEC的表型轉化。

通過生物信息學分析miR-21 可能與c-Ski 結合，提示miR-21 可能靶向調控c-Ski 表達。因此，我們首先分析了c-Ski及miR-21在TGF-β1誘導過程中表達變化的相關性，發(fā)現(xiàn)在TGF-β1 誘導過程中，隨著其濃度增加，c-Ski 表達逐漸下降，而miR-21 表達水平升高，提示兩者反向變化在TGFβ1 誘導EMT 中起到重要作用。同時，根據(jù)miR-21與c-Ski結合位點，我們構建了含有miR-21結合位點的野生型和突變型c-Ski 3′UTR 熒光素報告系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-21 可以抑制野生型載體的熒光活性，而對突變型無作用，上述結果證實miR-21 在HCAEC可靶向調控c-Ski。

鑒于c-Ski 在HCAEC 發(fā)生EMT 過程中表達下調，本實驗成功建立了c-Ski 過表達系統(tǒng)，進行其生物學功能研究，發(fā)現(xiàn)過表達c-Ski 可促進HCAEC向上皮型變化，表現(xiàn)為CD31 表達升高，而VIM、α-SMA表達下調。此外，過表達c-Ski可抑制TGFβ1 的誘導效應。本研究結果顯示，TGF-β1 處理HCAEC 雖能減低CD31、促進VIM、α-SMA 上調；但同時過表達c-Ski，上述作用減弱，HCAEC 仍為上皮型表型。有研究發(fā)現(xiàn)，c-Ski 在心肌細胞中可抑制Smad3 磷酸化，抑制TGF-β1 信號途徑［7］，從而抑制EMT 發(fā)生。因此，本研究過表達c-Ski 促HCAEC 上皮表型可能與TGF-β1 信號途徑抑制有關，然而具體作用機制還有待后續(xù)解析。

近年文獻報導，miRNA 可通過靶向驅動分子過程中的不同底物參與調節(jié)心肌纖維化。miR-26a 通過靶向抑制EZH2/P21 途徑，減緩高血壓介導的心臟纖維化［15］。miR-99b 靶向抑制GSK-3β促進血管緊張素Ⅱ介導的心臟纖維化［16］。鑒于miR-21在TGF-β1誘導HCAEC發(fā)生EMT過程中逐漸上調，我們在HCAEC 中抑制miR-21 表達，結果發(fā)現(xiàn)抑制miR-21 可促進HCAEC 向上皮型變化，并且抑制miR-21 可抑制TGF-β1 的誘導效應，提示miR-21具有促HCAEC發(fā)生EMT作用，其機制可能與調控c-Ski 表達有關。為此，本實驗在HCAEC細胞中過表達miR-21，發(fā)現(xiàn)c-Ski 表達顯著減低。事實上，已有臨床證據(jù)表明miR-21 與心臟纖維化、心力衰竭有密切關系［17-20］，可能與本實驗體外發(fā)現(xiàn)的調控機制有關，但還需進一步驗證。

綜上所述，miR-21 可在體外HCAEC 靶向調控c-Ski。TGF-β1 誘導HCAEC 發(fā)生EMT 過程中，miR-21逐漸上調，而c-Ski表達下降。抑制miR-21或過表達c-Ski 可阻止TGF-β1 誘導HCAEC 發(fā) 生EMT。