人源抗菌肽LL-37 對柯薩奇B3 病毒誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠病毒復(fù)制及炎癥反應(yīng)的影響△

劉 敬，李 薇，孫國文

（1.郴州市第一人民醫(yī)院兒童心胸血管中心，湖南郴州 423000；2.郴州市第一人民醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護室，湖南郴州 423000）

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由嗜心性病毒直接或間接損傷引起的心肌局限性或彌漫性炎癥病變。目前已知多種病毒能導(dǎo)致VMC，其中以柯薩奇病毒（Coxsackie virus，CV）B、CVA 和腺病毒最常見［1］。根據(jù)病毒對乳鼠的致病特點和病毒抗原性差異，其中CVB3 致病力最強，因而常用CVB3誘導(dǎo)制備VMC 動物模型［2］。Toll 樣受體（tolllike receptor，TLR）是固有免疫模式的識別受體，可識別病原微生物并做出一系列反應(yīng)。TLR-4 作為I型跨膜受體，識別多種病毒抗原，經(jīng)髓細胞樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）誘導(dǎo)下游核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，調(diào)控多種炎癥細胞因子［如白細胞介素（interleu?kin，IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α］的表達水平［3］。LL-37是人類抗菌肽中唯一已知的組織蛋白酶家族成員，其除了具有廣譜的抗菌活性外，還可以通過TLR-4/NF-κB活性通路調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)［4］。近年還發(fā)現(xiàn)，LL-37 通過與細胞膜和病毒外殼之間的相互作用產(chǎn)生抗病毒作用，且作用于多種病毒［5］。但LL-37 對CVB3誘導(dǎo)的VMC 小鼠是否具有抗病毒和抗炎癥作用還未知。本研究通過構(gòu)建CVB3 誘導(dǎo)的VMC 模型小鼠，經(jīng)人源抗菌肽LL-37處理后，探討LL-37對病毒性心肌炎小鼠心肌組織病毒復(fù)制和炎癥反應(yīng)的影響，并且闡述其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及病毒株

無特定病原體（SPF）級雄性5～6 周齡BALB/c小鼠48只，體質(zhì)量18～20 g，購自湖南太平生物科技有限公司，動物許可證編號：SCXK（湘）2015-0004。小鼠均在濕度40%～60%、溫度（21±2）℃的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進行實驗處理。

將CVB3 在HeLa 細胞中活化擴增后，采用Reed-Muench 法對病毒進行滴度測定，以50%的病變細胞為判斷標準，計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染量（TCID50）為10-7/0.1 mL。

1.2 主要試劑

人源抗菌肽LL-37 購自南京萊昂生物科技有限公司；蘇木素和伊紅染液購于美國Sigma 公司；心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin，cTnI）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）和肌紅蛋白（myoglobin，Mb）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；心肌組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度檢測的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immu?nosor bent assay，ELISA）試劑盒購于深圳晶美生物技術(shù)有限公司；Reverse Transcription System 試劑盒購于美國PROMEGA公司；SYBR熒光定量試劑盒購于大連寶生物公司；兔抗鼠TLR4、p-NF-κB p65、MyD88 和GAPDH 抗體均購于英國ABCAM 公司。

1.3 動物模型建立及分組

將48只BALB/c小鼠隨機分為正常對照（Blank）組、模型（VMC）組、LL-37 低劑量（LL-37-L）組和LL-37高劑量（LL-37-H）組，每組12只小鼠。VMC組和LL-37 高、低劑量組小鼠通過腹腔注射0.1 mL 100 TCID50 的CVB3溶液建立VMC小鼠模型，而Blank 組小鼠注射等量不含病毒的培養(yǎng)液。以CVB3 注射當天記為第0 天，根據(jù)前期預(yù)實驗結(jié)果確定LL-37 濃度，從第1 天開始LL-37-L 組和LL-37-H 組小鼠每天分別腹腔注射0.75 mg/kg 和3 mg/kg 濃度的人源抗菌肽LL-37，而Blank 組和VMC 組小鼠在同一時刻采用同樣的方法注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)干預(yù)7 d 后，各組小鼠眼球取血后處死并取心肌組織。小鼠注射病毒第3天開始出現(xiàn)精神萎靡，活動量減少，體溫下降，體質(zhì)量持續(xù)降低等情況。

1.4 心肌組織蘇木精-伊紅染色

沿右心室游離壁正中間切開，取1/2 心臟組織，迅速置于4 %多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)常規(guī)包埋、固定后，切成5～7 μm 厚度的石蠟切片。將石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度濃度乙醇處理后，加入蘇木素染色10 min，用蒸餾水沖洗，吸干水分后，再加入伊紅染液染色2 min。經(jīng)乙醇、二甲苯處理后，滴加中性樹脂封片。將制備好的切片置于顯微鏡下觀察心肌組織炎癥病理變化，根據(jù)心肌組織病理積分［6］統(tǒng)計心肌組織炎癥病理情況。每個樣本隨機取3 張切片，每張切片上隨機取5 個視野，計算視野內(nèi)炎癥細胞浸潤、細胞壞死所占面積，無病變計0 分，病變面積占比＜25%計1 分，25%～50%計2 分，51%～75%計3 分，＞75%計4 分，最后積分取平均值。

1.5 全自動生化儀檢測血清心肌損傷標志物

每組小鼠眼球取血，室溫靜置2 h 后，血清自然析出。3 000 r/min 離心10 min 后，取上清液保存至-80 ℃冰箱中待測。采用全自動生化儀檢測血清心肌損傷標志物cTnI、CK-MB 和Mb 濃度。

1.6 50%終點法測定心肌組織CVB3 病毒滴度

取部分心臟組織，剪碎并研磨，在4 ℃下3 000 r/min 離心10 min 后，取上清液，將上清液以10 倍梯度稀釋法（10-1～10-6）稀釋。將HeLa 細胞以1.0×104/mL 加入96 孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至約80%。然后每個濃度上清液取0.2 mL 加入HeLa 細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)，每個濃度設(shè)3 個復(fù)孔。逐日觀察HeLa 細胞病變情況，連續(xù)觀察5 d，細胞病變達50%以上計為陽性。根據(jù)Reed-Muench 法計算心肌組織中CVB3 的TCID50。

1.7 心肌組織中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α濃度檢測

取部分心臟組織，用組織搗碎機12 000 r/min上下研磨制備組織勻漿液。利用小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA 檢測試劑盒檢測組織勻漿液中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度。

1.8 心肌組織CVB3 mRNA 表達水平檢測

取部分心臟組織，無菌剪刀剪碎后，液氮研磨呈粉末狀，采用TRIzol 試劑提取組織總RNA，分光光度計法測定RNA 純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，配制逆轉(zhuǎn)錄體系，震蕩混勻后置入聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀中，42 ℃，1 h；95 ℃，5 min，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)熒光定量試劑盒說明書，以GAPDH 為模板，進行PCR 擴增反應(yīng)。引物序列：CVB3 上游引物：5′-CGGTACCTTTGTGCGCCTGT-3′；下游引物：5′-CAGGCCGCCAACGCAGCC-3′；GAPDH 上游引物：5′-ACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′；下游引物：5′-ATCC GTTGACTCCGACCTTC-3′。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，循環(huán)35 次。利用2-ΔΔCt法計算各組小鼠心肌組織中CVB3 mRNA的相對表達量。

1.9 Western blot 法檢測心肌組織TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65 蛋白表達

取部分心臟組織，無菌剪刀剪碎后立刻加入預(yù)冷的蛋白裂解液，冰浴反應(yīng)30 min 后，4 ℃12 000g離心5 min，收集上清液，采用BCA 試劑盒檢測提取出的蛋白濃度。將蛋白樣品調(diào)至等濃度后，98 ℃水浴3 min變性。將蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離蛋白后，濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyviny lidene fluoride，PVDF）膜。用5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，TBST 清洗PVDF 膜，分別加入一抗GAP?DH（稀釋1∶10 000）、TLR-4（稀釋1∶1 000）、MyD88（稀釋1∶500）和p-NF-κB p65（稀釋1∶1 000）置于4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗PVDF 膜3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，在搖床上室溫輕搖1 h。TBST 清洗3 次后，用ECL 發(fā)光顯影后，在凝膠成像儀中拍照掃描進行分析。用Image J 軟件對條帶進行灰度值檢測，目的蛋白的相對表達量為目的蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。小鼠心肌病理積分、血清cTnI、CK-MB 和Mb 濃度、CVB3 病毒滴度和CVB3 mRNA 相對表達量、組織IL-1β、IL-6和TNF-α濃度以及組織TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平等符合正態(tài)分布計量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌組織病理變化

Blank 組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊有序，無明顯炎癥病理情況；VMC 組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞間質(zhì)出現(xiàn)大量炎癥細胞浸潤和大片細胞壞死區(qū)；LL-37-L 組小鼠心肌組織有少量炎癥細胞浸潤情況，細胞壞死區(qū)較小且分散；LL-37-H 組小鼠心肌組織細胞排列有序，炎癥細胞浸潤較模型組明顯減少，無明顯細胞壞死區(qū)（圖1）。各組小鼠心肌病理積分比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=396.25，P＜0.001）；與Blank 組比較，VMC組小鼠心肌病理積分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義［（3.18±0.33）分vs.（0.00±0.00）分，P＜0.05］；VMC 組與LL-37-L 組小鼠心肌病理積分［（2.94±0.28）分］比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而LL-37-H 組小鼠心肌病理積分明顯低于VMC 組，差異有統(tǒng)計學意義［（1.56±0.27）分vs.（3.18±0.33）分，P＜0.05］。

圖1 各組小鼠心肌組織光學顯微鏡下圖像（蘇木精-伊紅染色，×400）

2.2 各組小鼠血清心肌損傷標志物濃度變化

與Blank 組比較，VMC 組小鼠血清cTnI、CKMB 和Mb 濃度均明顯升高（P＜0.05）；與VMC 組比較，LL-37-H組小鼠血清cTnI、CK-MB和Mb濃度均明顯降低（P＜0.05），而LL-37-L組小鼠的血清cTnI、CK-MB 和Mb 濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清心肌損傷標志物濃度比較［n=12，］

表1 各組小鼠血清心肌損傷標志物濃度比較［n=12，］

注：與Blank 組比較，*P＜0.05；與VMC 組比較，1）*P＜0.05；與LL-37-L 組比較，2）*P＜0.05

2.3 各組小鼠心肌組織CVB3 病毒滴度及CVB3 mRNA 表達水平比較

與Blank 組比較，VMC 組小鼠心肌CVB3 病毒滴度和CVB3 mRNA 相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；與VMC 組比較，LL-37-H 組小鼠心肌CVB3病毒滴度和CVB3 mRNA 相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；而LL-37-L 組小鼠心肌CVB3 病毒滴度和CVB3 mRNA 相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組小鼠心肌組織CVB3 病毒滴度以及CVB3 RNA表達水平比較 ［，n=12］

表2 各組小鼠心肌組織CVB3 病毒滴度以及CVB3 RNA表達水平比較 ［，n=12］

注：與Blank 組比較，*P＜0.05；與VMC 組比較，1）*P＜0.05；與LL-37-L 組比較，2）*P＜0.05。

2.4 各組小鼠心肌組織炎癥因子濃度比較

與Blank 組比較，VMC 組小鼠心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度均明顯升高（P＜0.05）；與VMC 組比較，LL-37-H 組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度均顯著降低（P＜0.05），而LL-37-L 組小鼠心肌組織IL-1β、IL-6 和TNF-α濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組小鼠心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α濃度比較 ［n=12，pg/mL，］

表3 各組小鼠心肌組織炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α濃度比較 ［n=12，pg/mL，］

注：與Blank 組比較，*P＜0.05；與VMC 組比較，1）*P＜0.05；與LL-37-L 組比較，2）*P＜0.05

2.5 各組小鼠心肌組織中TLR-4、MyD88和p-NFκB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平變化

與Blank 組比較，VMC 組小鼠心肌組織炎癥因子TLR-4、MyD88 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與VMC 組比較，LL-37-H 組小鼠心肌組織TLR-4、MyD88 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），而LL-37-L 組小鼠心肌組織TLR-4、MyD88 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組小鼠心肌組織TLR-4、MyD88和p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表達水平比較

3 討論

CVB3 是一種全球流行的小克氏病毒科腸道病毒，為無包膜的單鏈RNA 病毒，常與病毒性心肌炎有關(guān)。研究顯示，CVB3 經(jīng)腹腔注射感染Balb/c 小鼠建立VMC 模型中，其病理改變與小兒VMC 病理改變類似［7］。另外，CVB3 誘導(dǎo)的VMC小鼠炎癥反應(yīng)增強［8］，并且促進心肌組織CVB3 病毒復(fù)制［9］，最終導(dǎo)致心臟功能障礙。本研究結(jié)果顯示，VMC 小鼠心肌組織病理形態(tài)發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)紊亂，細胞間質(zhì)炎癥細胞浸潤和壞死。不僅如此，心肌組織炎癥細胞因子濃度均升高，這些結(jié)果表明VMC 小鼠存在嚴重炎癥反應(yīng)。另外，VMC 小鼠心肌組織中CVB3 病毒高度復(fù)制，證明CVB3 誘導(dǎo)的VMC 小鼠模型構(gòu)建成功。病毒感染心臟后出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，并且伴隨VMC 的病理過程，在VMC 急性期（病毒感染3～4 d）和亞急性期（病毒感染5～14 d），心肌細胞表達大量促炎細胞因子，包括IL-1β、IL-6 和TNF-α［10］。TLRs是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁，在天然免疫細胞浸潤心肌組織之前，TLRs 將病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）識別為模式識別受體（PRRs），將PAMPs 作為病原體的保守基序和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）識別為模式識別受體［11］。在TLR 中，TLR4 在心臟中的表達水平最高，參與了多種病原體誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［12］。當TLR4 識別出CVB3 的雙鏈RNA 作為PAMPs 后，TLR4可通過MyD88 依賴性途徑激活NF-κB，激活NF-κB 作為轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移到細胞核，促進促炎癥或炎癥細胞因子的表達［13］。本研究結(jié)果表明，TLR-4、MyD88 和p-NF-κB p65在CVB3 誘導(dǎo)的小鼠心臟中的表達水平較正常對照組顯著升高，進一步驗證了TLR-4/NF-κB 信號通路激活參與CVB3 誘導(dǎo)VMC 的炎癥反應(yīng)。因此，阻斷TLR4 是治療炎癥相關(guān)的心臟疾病的有效途徑。同時，NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可介導(dǎo)急性VMC 的心肌炎癥反應(yīng)和代謝重構(gòu)，而抑制NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過抑制炎癥反應(yīng)減弱多種病原體誘發(fā)的心肌炎［14］。

抗菌肽是抵御入侵病原體的第一道防線，其中人源抗菌肽LL-37 主要由中性粒細胞和上皮細胞產(chǎn)生。除了抗菌活性外，LL-37 還具有多種生物學活性，包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和抗病毒作用［4，5］。研究表明，LL-37 通過抑制炎性細胞因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 的產(chǎn)生，提高膿毒癥小鼠的生存率［15］。據(jù)報道，LL-37 的抗病毒活性主要通過與病毒外膜的相互作用來介導(dǎo)，包括人類免疫缺陷病毒（HIV）-1、甲型流感病毒（IAV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、感冒病毒（HRV）、牛痘病毒（VACV）、單純皰疹病毒（HSV）、寨卡病毒（ZIKV）和丙型肝炎病毒（HCV）［5］。但人源抗菌肽LL-37 對CVB3 誘導(dǎo)的VMC 能否產(chǎn)生抗病毒作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，高濃度人源抗菌肽LL-37 對CVB3 誘導(dǎo)的VMC 有治療作用，明顯降低心肌組織炎癥反應(yīng)和CVB3 病毒復(fù)制，說明LL-37 對CVB3 誘導(dǎo)的VMC 也具有抗炎抗病毒作用。人源抗菌肽LL-37作為先天性宿主防御系統(tǒng)的效應(yīng)分子，能明顯阻止免疫識別受體TLR-4 釋放［16］，下調(diào)NF-κB 活性［17］，進而抑制下游炎癥細胞因子的表達。但人源抗菌肽LL-37 能否通過調(diào)控TLR-4/NF-κB 信號通路活性減輕CVB3誘導(dǎo)的VMC尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，人源抗菌肽LL-37 降低CVB3 引起的心肌組織炎癥反應(yīng)和病毒復(fù)制，改善心肌組織炎癥損傷，可能與CVB3 誘導(dǎo)的VMC 心肌組織TLR-4/NF-κB 信號通路活性抑制有關(guān)。

綜上所述，人源抗菌肽LL-37 降低CVB3 誘導(dǎo)的心肌組織炎癥水平和CVB3 病毒復(fù)制，治療心肌損傷，可能與心肌組織TLR-4/NF-κB 信號通路活性的抑制有關(guān)，對臨床治療CVB3 誘導(dǎo)的VMC 具有指導(dǎo)意義。