兒童重癥肺炎支原體肺炎支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞因子變化及臨床意義分析

王潔 王丹丹 張薇 縱書芳 王寅

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是引起兒童呼吸道感染的常見病原體,肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)成為兒童社區(qū)獲得性肺炎的主要類型之一,占15%～40%［1-3］。近年來,兒童MPP 發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長趨勢(shì),且重癥MMP(severe mycoplasma pneumoniae pneumonia,SMMP)占比也逐年升高,不僅增加治療難度,且除肺部癥狀及體征外,還極易引起心肌炎、肝炎等肺外并發(fā)癥［4］。SMPP 的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確,多項(xiàng)研究表明細(xì)胞免疫所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與其發(fā)生及發(fā)展有關(guān),且有研究顯示MMP 患兒的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中多項(xiàng)炎癥細(xì)胞因子呈現(xiàn)明顯異常變化［5］。目前,相關(guān)研究多集中于病情嚴(yán)重程度與BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平的相關(guān)性研究,涉及SMMP患兒BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平變化與MP-DNA 載量、轉(zhuǎn)歸等的關(guān)系研究較少。因此,本研究就此開展相關(guān)研究和分析,以期為兒童SMPP 的臨床診治提供一定的參考依據(jù),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年1 月～2021 年6 月在本院接受支氣管肺泡灌洗術(shù)的66 例SMPP 患兒為SMPP組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(shí)(2015 年版)》［6,7］中對(duì)SMMP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②具有支氣管鏡術(shù)以及肺泡灌洗指征；③年齡1～14 歲,首次發(fā)病；④痰培養(yǎng)顯示未合并細(xì)菌、病毒、真菌等感染；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并支氣管哮喘、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病患兒；②入院時(shí)已行氣管插管或切開、機(jī)械通氣(mechanical ventilation,MV)患兒；③合并血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤患兒；④合并嚴(yán)重心、肝、肺、腎等原發(fā)性疾病患兒；⑤近期嚴(yán)重創(chuàng)傷、手術(shù)患兒；⑥蕁麻疹、濕疹及過敏性鼻炎等過敏狀態(tài)患兒。另選同期因支氣管異物入院需行支氣管鏡術(shù)以及肺泡灌洗的非SMPP 患兒66 例為非SMPP 組,異物吸入時(shí)間≤1 d,近6 個(gè)月內(nèi)無肺部感染史,其余排除標(biāo)準(zhǔn)同SMPP組。SMPP 組患兒年齡1～13 歲；非SMPP 組患兒年齡1～13 歲。兩組患兒一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。SMPP 組根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科急救學(xué)組提出的小兒危重病例評(píng)分(pediatric critical illness score,PCIS)［8］進(jìn)一步分為非危重組(81～100 分,34 例)、危重組(71～80 分,25 例)與極危重組(0～70 分,7 例)；病程中發(fā)生呼吸衰竭需行MV 患兒作為MV 組(29 例),無需MV 患兒為非MV 組(37 例)。本次研究獲得患兒家長的知情同意,且研究設(shè)計(jì)經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)通過。

表1 兩組患兒一般資料比較［n(%),］

表1 兩組患兒一般資料比較［n(%),］

注：兩組比較,P＞0.05

1.2 主要儀器與試劑 人細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 試劑盒由美國R&D 公司提供；離心機(jī)為美國 Eppendorf 公司生產(chǎn)；纖維支氣管鏡為日本Olympus 公司生產(chǎn)；Rayto全自動(dòng)酶標(biāo)儀(RT6100)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀由美國BD 公司提供；電子支氣管鏡(BF-XP260F)由奧林巴斯提供。

1.3 研究方法

1.3.1 BALF 采集 兩組患兒均接受纖維支氣管鏡檢查或治療,根據(jù)《支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)中國專家共識(shí)(2020)》［9］和《中國兒科可彎曲支氣管鏡術(shù)指南(2018 年版)》［10］中關(guān)于兒童BALF 的采集標(biāo)準(zhǔn)要求施行。選取一側(cè)支氣管或患側(cè)支氣管肺段,采用37℃無菌生理鹽水(總量＜3 ml/kg)分3 次進(jìn)行灌洗,留取灌洗液5 ml,采用雙層無菌紗布進(jìn)行過濾去除黏液,然后轉(zhuǎn)移至離心管中。BALF 樣品在4℃溫度下,以轉(zhuǎn)速1200 r/min 離心10 min,分離上清液,保存于4℃冰箱中于24 h 內(nèi)統(tǒng)一測(cè)定。

1.3.2 檢測(cè)方法 采用雙抗體夾心ELISA 法檢測(cè)BALF 中炎癥細(xì)胞因子,包括白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、白細(xì)胞介素-4(interleukin-4,IL-4)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)。MP-DNA 載量采用PCR 熒光探針法進(jìn)行檢測(cè),具體操作步驟按照試劑說明書嚴(yán)格執(zhí)行。SMPP 組于急性期和恢復(fù)期各測(cè)1 次。

1.4 觀察指標(biāo) 比較SMPP 組患兒急性期和非SMPP組患兒BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平；SMPP 組不同病情、不同危重程度患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子及MP-DNA 載量,急性期與恢復(fù)期BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平。分析SMPP 組患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子與MP-DNA 載量的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson 線性相關(guān)性分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平比較SMPP組患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 均顯著高于非SMPP 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組患兒BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平比較()

表2 兩組患兒BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平比較()

注：與非SMPP 組比較,aP＜0.05

2.2 SMPP 組不同病情患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子及MP-DNA 載量比較 MV 組患兒急性期BALF中MP-DNA 載量、IL-1β、IL-6 水平顯著高于非MV 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；兩組患兒急性期BALF中IL-2、IL-4、INF-γ 及IL-4/IFN-γ 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 SMPP 組不同病情患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子及MP-DNA 載量比較()

表3 SMPP 組不同病情患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子及MP-DNA 載量比較()

注：與非MV 組比較,aP＜0.05

2.3 SMPP 組不同危重程度患兒BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平及MP-DNA 載量比較 隨著病情程度的加重,SMPP 患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 及MP-DNA 載量呈顯著升高趨勢(shì),非危重組、危重組、極危重組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 SMPP 組不同危重程度患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平及MP-DNA 載量比較()

表4 SMPP 組不同危重程度患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平及MP-DNA 載量比較()

注：三組比較,P＜0.05

2.4 SMPP 組患兒急性期與恢復(fù)期BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平比較 SMPP 組患兒恢復(fù)期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和IL-4/IFN-γ均明顯低于急性期,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表5。

表5 SMPP 組患兒急性期與恢復(fù)期BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平比較(,n=66)

表5 SMPP 組患兒急性期與恢復(fù)期BALF 中炎癥細(xì)胞因子水平比較(,n=66)

注：與急性期比較,aP＜0.05

2.5 SMPP 組患兒急性期BALF 中炎癥細(xì)胞因子與MP-DNA 載量的相關(guān)性分析 Pearson 相關(guān)性分析顯示：SMPP 組患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 均 與MP-DNA 載量呈顯著正相關(guān)性(r=0.513、0.402、0.336、0.509、0.502、0.324,P＜0.05)。

3 討論

MPP 的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明晰,主要認(rèn)為與上皮細(xì)胞吸附、病原直接侵入及免疫學(xué)因素等有關(guān),而免疫應(yīng)答紊亂被認(rèn)為是MPP 發(fā)生及發(fā)展的重要因素之一［11］。在MPP 感染初期,因免疫失衡與免疫逃逸等可導(dǎo)致MP 逃避宿主的免疫監(jiān)視,從而導(dǎo)致病情進(jìn)展［12］。不同于血液標(biāo)本,BALF 直接來源于病變周圍,能夠更為客觀、準(zhǔn)確、直接地反映感染后呼吸系統(tǒng)免疫紊亂情況［13］。

抗炎與促炎系統(tǒng)平衡情況直接影響肺炎患者的病情變化及臨床轉(zhuǎn)歸,多種炎性標(biāo)記物如IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 等細(xì)胞因子被作為評(píng)價(jià)肺炎病情嚴(yán)重程度的生物指標(biāo)［14］。IL-2、IL-γ 均是代表性的Th1 細(xì)胞因子,可促進(jìn)自然殺傷(NK)細(xì)胞增殖、提高T 細(xì)胞殺傷活性,促進(jìn)機(jī)體清除感染源；IL-1β、IL-4、IL-6 均是代表性的Th2 細(xì)胞因子,能夠刺激B細(xì)胞及T 細(xì)胞等分化成熟,具有抗炎效應(yīng)［15］。因此,Th1 和Th2 細(xì)胞因子平衡有利于機(jī)體防御反應(yīng)。從理論角度而言,Th1 型細(xì)胞因子具有促炎作用,而Th2 細(xì)胞因子具有抗炎效應(yīng),故兩者平衡有利于機(jī)體防御反應(yīng)。但I(xiàn)L-4 等過表達(dá)時(shí),可大量激活B 細(xì)胞釋放免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G1(IgG1)等,誘發(fā)喘息癥狀［16］。IL-6 對(duì)于宿主早期炎癥反應(yīng)具有重要調(diào)節(jié)作用,在細(xì)菌感染后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可達(dá)峰,而在非細(xì)菌感染中僅在重癥感染時(shí)有明顯增高,故IL-6 過表達(dá)也往往提示感染較為嚴(yán)重［17］。研究表明,MMP 急性期呈現(xiàn)Th1/Th2 免疫應(yīng)答平衡向Th2 應(yīng)答漂移,這種免疫反應(yīng)失衡反而加重肺損傷［18］。

本研究結(jié)果顯示,SMPP 組患兒急性期BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 均顯著高于非SMPP 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示SMPP 可引起B(yǎng)ALF 中多種細(xì)胞因子高表達(dá),且呈現(xiàn)Th2 優(yōu)勢(shì)表達(dá)趨勢(shì),這與黃小霏等［19］報(bào)道基本相符。分析其原因,MP 感染后肺組織免疫功能紊亂,促炎因子升高,為保護(hù)機(jī)體免疫平衡,抑炎因子也呈升高趨勢(shì),導(dǎo)致細(xì)胞因子整體過表達(dá)。本研究還顯示,SMPP 中MV 組患兒IL-1β 和IL-6 水平明顯高于非MV 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示BALF 中IL-1β 和IL-6 表達(dá)越高的SMPP 患兒可能具有更高的呼吸衰竭風(fēng)險(xiǎn),但其他炎癥因子可能對(duì)是否發(fā)生呼吸衰竭的評(píng)估價(jià)值有限。進(jìn)一步采用PCIS 評(píng)分進(jìn)行分組,隨著病情加重,BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 表達(dá)水平、IL-4/IFN-γ 值均呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì),比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示BALF中炎癥細(xì)胞因子與SMPP 的病情嚴(yán)重程度有關(guān),檢測(cè)BALF 中炎癥因子有助于評(píng)估SMPP 患兒的病情變化。進(jìn)一步比較SMPP 組急性期與恢復(fù)期BALF 中炎癥細(xì)胞因子表達(dá)情況顯示,恢復(fù)期后IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 表達(dá)明顯降低,且IL-4/IFN-γ 比值下降,更趨向平衡。進(jìn)一步證實(shí)在SMPP 患兒中,BALF細(xì)胞因子表達(dá)情況與病情、轉(zhuǎn)歸等均有一定關(guān)系,這為臨床評(píng)估病情和治療干預(yù)提供了一定的理論依據(jù)。MP-DNA 載量是評(píng)價(jià)MP 活動(dòng)狀況的主要指標(biāo),本研究中,MV 組患兒BALF 中MP-DNA 載量明顯高于非MV 組患兒,且隨著病情加重呈顯著增高趨勢(shì)。進(jìn)一步相關(guān)性分析顯示,MP-DNA 載量與IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN -γ 均具有顯著正相關(guān)性(P＜0.05),方柯南等［20］研究也獲得了類似結(jié)論。提示MP-DNA 載量高可能與SMPP 患兒的過度免疫反應(yīng)有關(guān),但其是否與患兒全身免疫功能亢進(jìn)的發(fā)生及維持有關(guān)尚不明確。

綜上所述,兒童SMPP 急性期BALF 中MP-DNA 載量越高,BALF 中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN -γ 越高,且病程中因呼吸衰竭需行MV 的患兒BALF 中MP-DNA 載量及炎癥因子水平明顯高于無需MV 的患兒。提示檢測(cè)BALF 中MP-DNA 載量及IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-4/IFN-γ 等細(xì)胞因子水平對(duì)病情評(píng)估具有一定的指導(dǎo)意義。