凝血酶生成檢測的應用現(xiàn)狀與發(fā)展

武藝（Wu Yi），魯翌（Lu Yi），葉絮（Ye Xu），劉爍（Liu Shuo）

（1.國家血液病臨床醫(yī)學研究中心，唐仲英醫(yī)學研究院，蘇州大學，蘇州215123；2.武漢塞力斯生物技術有限公司，武漢430040；3.廣州醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科，廣州510260；1. National Clinical Research Center for Hematologic Diseases，Cyrus Tang Medical Institute，Soochow University Suzhou 215123，China.；2.Wuhan Thalys Biotechnology Co.，Ltd.，Wuhan 430040；3.Department of Hematology，Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260）

在基礎與臨床研究中，我們主要依賴于凝血基礎試驗（basic tests of coagulation）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和活化部分促凝血酶原激酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）評價凝血功能。凝血酶生成實驗（thrombin generation assay，TGA）的問世將凝血功能檢測提高到新的臺階。但是，最初TGA的檢測方法既費力又耗時，需要單獨采樣，尤其是沒有考慮凝血酶-抗凝血酶復合物對凝血酶的滅活，因此無法準確地反映凝血酶生成的動態(tài)變化和整體情況。校準的自動凝血酶生成圖（calibrated automated thrombogram，CAT）系綜合抗凝血酶復合物的客觀因素，且具備對多個樣品同時快速且連續(xù)的測量，大大提高TGA的準確性、效率和可重復性。因此，基于CAT的TGA檢測逐漸成為凝血檢測的主流方法。與傳統(tǒng)的凝血實驗相比，TGA有以下幾個優(yōu)點［1-3］。首先，PT和APTT的測量依賴于纖維蛋白原的濃度和活性［4］，但是，TGA不受纖維蛋白原的影響，即使在纖維蛋白網絡形成后仍然能夠檢測到凝血酶的生成。其次，在PT和APTT中僅5%的凝血酶發(fā)揮作用形成血凝塊，這意味著95%生成的凝血酶檢測不到。而且，TGA測定曲線反映了凝血全過程的多個參數(shù)，包括滯后時間、凝血酶生成速度、凝血酶生成峰值和內源性凝血酶生成潛力，其中最重要的參數(shù)是內源性凝血酶生成潛力，即生成凝血酶的凈量，但是PT和APTT僅提供凝血完成的終點時間值。

基于TGA檢測的優(yōu)勢，其在臨床中的應用日益廣泛。例如，監(jiān)測服用抗凝劑和抗血小板藥物的患者、評估接受旁路藥物或替代療法的血友病患者的出血風險、篩查遺傳性或獲得性血栓性和出血性疾病等。與傳統(tǒng)的凝血實驗相比，雖然TGA適合于全面的止血與血栓傾向的評估，但是為了更可靠地評價凝血的特定途徑和階段，以及更精確地評估整個凝血過程，該方法仍然需要進一步優(yōu)化，包括其臨床檢測的標準化。

1 實驗方法

1993年Hemker等報道了TGA的基本原理，他們使用顯色底物甲基丙二酰-甲基苯丙酰-精氨酰-pNA（SQ 68）［5］，建立了連續(xù)凝血酶生成檢測。2003年該方法升級為CAT［6］。在過去的二十年中，在該方法的基礎上，改進出三種商業(yè)化的TGA自動檢測方法：Technoclone公司Technothrombin和Diagnostics Stago公司擁有Thrombobinoscope，兩者均使用熒光底物，Behring公司凝血系統(tǒng)（BCS）使用顯色底物。熒光檢測比顯色法特異性更高，不受血漿樣品中纖維蛋白及其它化學物理參數(shù)的影響。這三個系統(tǒng)的共同點是：

（1）檢測樣品的制備方法相同，應用檸檬酸鈉抗凝，制備乏血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）；

（2）均使用低濃度或高濃度磷脂化重組組織因子（tissue factor，TF）啟動凝血反應；

（3）以底物裂解作為檢測對象，連續(xù)監(jiān)測凝血酶的生成。

但是，這三種系統(tǒng)在樣品設置、檢測底物、測量過程和標準校準品等方面存在以下不同：

（1）樣品設置。盡管這三種方法均使用TF啟動凝血，但是BCS系統(tǒng)還需要纖維蛋白抑制劑和配方不公開的緩沖液保持測定體系的穩(wěn)定性。顯色測定的缺陷之一是僅能測定PPP樣本。

（2）檢測底物。BCS系統(tǒng)的顯色底物為H-β-Ala-Gly-Arg-pNA-pNA，凝血酶對其裂解產生發(fā)色基團。熒光檢測使用Z-Gly-Gly-Arg-AMC（ZGGRAMC）底物，凝血酶將其裂解后釋放出AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），產生熒光信號，通過熒光強度的相對變化的動態(tài)曲線（dx／dt），確定內源性凝血酶生成潛力（endogenous thrombin potential，ETP）、最大凝血酶生成量（曲線下面積，area under curve，AUC）、滯后時間（凝血酶產生所需時間）、達到峰值時間（達到凝血酶生成速率最大值所需的時間）和速度指數(shù)（凝血酶生成速率）。

（3）測量過程。熒光法測定需要50到120分鐘，顯色測定法更快，平均需要20分鐘。

（4）校準品。Technothrombin校準品是不同稀釋度的人凝血酶。Thrombinoscope使用α-2-巨球蛋白（α2M）-凝血酶復合物，TGA不受血漿因素的影響，但是樣品中α2M濃度或結構的變化可能會影響讀數(shù)。BCS系統(tǒng)需使用專有的校準品。

應用Technoclone TGA體系，我們發(fā)現(xiàn)TGA主要參數(shù)，包括延時（tLag）、峰時（tPeak）、峰值（Peak）、曲線下面積（AUC）均與PT-INR和APTT顯著相關（0.61≤r≤0.79）。而且，多元回歸分析顯示，tLag與tPeak（r＝0.91）之間及Peak與AUC（r＝0.95）之間高度相關，TGA各參數(shù)與常規(guī)凝血測試（PT-INR和APTT）顯著相關［7］。

2 應用TGA對內源性和外源性凝血系統(tǒng)活化的特異性評價

TG是外源性凝血系統(tǒng)和內源性凝血系統(tǒng)活化的最終產物。外源性凝血系統(tǒng)是血管壁受損后出血管外壁TF暴露于血液，與FVII結合，激活凝血級聯(lián)反應（圖1）。內源性凝血系統(tǒng)（或接觸活化途徑，contact pathway）是在血管壁完整情況下，凝血因子XII（FXII）、前激肽釋放酶（prekallikrein，PK）和高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen，HK）與活化表面結合并形成復合物，激活凝血反應。最初TGA主要用于評估TF激活外源性凝血系統(tǒng)，不適于檢測內源性凝血系統(tǒng)活化。為了克服這一缺陷，我們開發(fā)了能夠評估內源性凝血系統(tǒng)的新的TGA檢測方法［8］（圖1）。內源性凝血系統(tǒng)的主要成分FXII（又稱Hageman因子）是FXIIa的酶原。FXII通過Arg353-Val354肽鍵的裂解形成雙鏈FXIIa而被激活。FXII的激活存在兩種主要形式。FXII與帶負電荷表面結合，發(fā)生構象變化而被活化（自身激活）［8］。另外，激肽釋放酶（kallikrein，Kal）裂解FXII使其活化（異源激活）。我們最近發(fā)現(xiàn)FXII在凋亡細胞介導的促凝活性中發(fā)揮關鍵作用［8］。利用Technoclone公司TGA儀器，我們開發(fā)了評估細胞膜表面磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）活化內源性凝血系統(tǒng)的檢測方法［8］，發(fā)現(xiàn)凋亡細胞在無TF的情況下顯著增強凝血酶生成，后者被膜聯(lián)蛋白V（annexin V，AxV）顯著抑制［8］，提示FXII、PK和HK在PS陰離子表面形成復合物而被活化。抑制性抗FXII抗體（C6B7）降低凋亡細胞介導的凝血酶生成，而抗TF抗體無抑制作用。而且，在FXII缺陷血漿中凋亡細胞不能誘導TG，而添加純化FXII恢復其功能。為了確定PS在凝血酶生成中的作用，我們使用了PS脂質體包被珠（圖1），發(fā)現(xiàn)PS脂質體同樣誘導TG，C6B7抗體顯著降低PS誘導的TG［8］。因此，TGA以PS脂質體作為激動劑，可用于評估內源性凝血途徑的特異性激活（圖1）。過去的研究表明，F(xiàn)XII被各種生物或人工陰離子表面激活，如高嶺土、鞣花酸、核苷酸、硫酸鹽、糖胺聚糖、錯誤折疊的蛋白質聚集體、聚磷酸鹽和膠原蛋白等。FXII介導凋亡細胞促凝功能的發(fā)現(xiàn)為凋亡細胞相關的病理學研究提供了新的見解［9］。

鑒于TGA檢測內源性凝血系統(tǒng)活性的敏感性，我們進一步嘗試如何在去除內源性凝血系統(tǒng)的影響下，特異地反映外源性凝血系統(tǒng)介導的TG。TF是止血最關鍵的起動蛋白［10］，通常處于非活性（加密）狀態(tài)［11］。最近的研究表明，蛋白二硫鍵異構酶（protein disulfide isomerase，PDI）通過氧化二硫鍵的形成，激活TF［12］，但是缺乏直接證據(jù)表明PDI通過調控TF增強凝血功能。因此，我們使用TGA判定PDI在TF介導凝血中的作用［13］。首先，我們應用 Technoclone TGA體系發(fā)現(xiàn)，脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）顯著上調外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）表達TF及凝血酶生成［13］。加入抑制性抗TF抗體4501抑制凝血酶生成，表明PBMC凝血酶生成依賴于TF［13］。用重組野生型PDI預孵育PBMC顯著提高凝血酶生成，PDI抑制劑PACMA31降低PBMC的凝血酶生成。此外，與野生型細胞相比，PDI缺陷小鼠骨髓單核細胞介導凝血酶生成降低［13］。上述應用TGA的結果（圖1）為PDI調控TF促進外源性凝血系統(tǒng)的關鍵作用提供了直接證據(jù)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)內皮細胞微粒（microparticles，MPs）增加了凝血酶生成峰并縮短了達峰時間［14］。MP膜表面TF表達和PS暴露均參與微粒的促凝活性［15］。由上可見，基于FVII缺陷和FXI缺陷血漿的TGA檢測可以具體評價PS和TF在凝血酶生成中的特異性貢獻（圖1）。

圖1 TGA分析不同凝血途徑

3 TGA檢測在臨床應用的現(xiàn)狀

3.1 抗凝藥物的效果評價 由上述可見，TGA檢測不但可以評價血漿整體的凝血活性，而且能夠分別檢測兩條凝血系統(tǒng)的活化水平，并兼具優(yōu)良的敏感性與特異性，與常規(guī)凝血實驗相比，TGA檢測在評估抗凝藥物療效方面具有優(yōu)勢，在臨床應用中越來越廣泛。直接口服抗凝劑（如利伐沙班和達比加群等）引起出血，尤其是存在腎損害患者。有研究應用TGA和血栓彈力圖（TEG），對接受達比加群（非瓣膜性心房顫動）和利伐沙班（髖關節(jié)或膝關節(jié)置換術后預防深靜脈血栓形成）患者進行了評估［16］，發(fā)現(xiàn)達比加群顯著增加TEG動態(tài)參數(shù)和TGA的延遲時間，并降低TGA和ETP的峰高。利伐沙班對TEG無影響，但會增加TGA的延遲時間，降低TGA和ETP的峰高。這些結果說明TGA更有助于監(jiān)測出血效應和設計預防策略。此外，TGA檢測有助于評估止血劑（如凝血酶原復合物濃縮物和重組活化FVIIa）逆轉異常的凝血酶生成［17］。另一研究發(fā)現(xiàn)，阿哌沙班減少房顫患者凝血酶生成，故有助于預防中風［18］。

RASTEN多中心隨機3期臨床試驗研究了新確診小細胞肺癌（SCLC）患者接受依諾肝素治療的生存效果［19］，通過總TF和TGA評估全身凝血功能，發(fā)現(xiàn)TG峰值的升高與總生存期降低顯著相關（OS；P＝0.03），尤其是重癥患者。這項研究表明TG峰值具有評估患者生存和對低分子肝素治療反應的價值。

3.2 深靜脈血栓（DVT）的監(jiān)測 為了評價TGA在預測靜脈血栓栓塞（VTE）危險因素和復發(fā)的能力，有前瞻性研究對914名首次VTE患者進行了平均47個月的隨訪［20］。11%患者出現(xiàn)VTE復發(fā)，其凝血酶生成量高于未復發(fā)患者（P＜0.001）。凝血酶生成小于400nM的患者4年后復發(fā)的概率為6.5%（95%CI，4.0%-8.9%），而凝血酶生成大于400nM的患者4年后復發(fā)的概率為20.0%（95%CI，14．9%-25．1%）（P＜0.001），這些結果說明TGA反映癌癥的促凝水平。維也納癌癥和血栓研究（CATS）前瞻觀察性隊列研究，使用TGA評估新診斷癌癥患者或緩解后疾病進展的患者發(fā)生血栓形成的風險［21］，發(fā)現(xiàn)凝血酶峰值升高（定義為凝血酶值≥611nM）患者發(fā)生VTE的風險增加，風險比為2.1（95%CI，1．3～3．3；P＝0.002）。另一項肺腺癌患者前瞻性研究應用TGA確定，凝血酶生成平均速率指數(shù)（mean rate index，MRI）可以作為VTE的危險因素［22］。這些研究表明，TGA在評估癌癥凝血系統(tǒng)的活化狀態(tài)和相關血栓形成的臨床風險中具有價值。

3.3 造血系統(tǒng)惡性腫瘤 止血并發(fā)癥常見于惡性血液病患者。Damien Gheldof等使用TGA研究新診斷白血病患者的細胞外囊泡（EV）對凝血酶生成的影響，評估EV相關的促凝活性（EV-PCA）作為患者血栓并發(fā)癥的生物標志物［23］。他們發(fā)現(xiàn)EV-PCA具有止血并發(fā)癥（如DIC或血栓形成）標志物的預測價值。另一項對23名接受L-天冬酰胺治療的急性淋巴細胞白血病患者的研究發(fā)現(xiàn)，誘導期的內源性凝血酶生成和凝血酶峰值水平顯著高于再誘導期（P＜0.001）［24］。Nielson等通過TGA檢測發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者存在高凝狀態(tài)，可能是由于較高的TF和促凝磷脂（PPL）活性所致［25］。此外，慢性粒單核細胞白血病患者間充質基質細胞衍生EV比健康供體MSCs產生的凝血酶能力更強［26］。

3.4 血栓形成傾向篩查 TGA在臨床篩查血栓性危險因素中也有潛力，特別是因子V Leiden或凝血酶原G20210A突變患者和蛋白S缺乏癥患者［27］。當TGA滯后時間相差1.5分鐘時可排除因子V Leiden的影響；當凝血酶峰值濃度＜426 nmol／L［28］時，可排除凝血酶原G20210A影響。當APC誘導的內源性凝血酶潛力抑制百分比＞63%時，可以排除蛋白S缺乏癥的影響［28］。此外，在蛋白S缺乏癥患者血漿中，凝血酶峰和TGA速度顯著升高［29］。

原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）和真性紅細胞增多癥（polycythemia vera，PV）患者血栓并發(fā)癥的發(fā)生率顯著增加，尤其是在JAK2V617F陽性患者。與對照組相比，ET和PV患者TG顯著升高，而且JAK2V617F陽性患者TG值更高［30］。鐮狀細胞貧血?。╯ickle cell disease，SCD）是促血栓形成疾病。Whelihan等發(fā)現(xiàn)SCD患者全血TG顯著升高，而血漿凝血酶生成卻減少［31］，全血中表達PS紅細胞對SCD的TG具有顯著貢獻?？沽字C合征（APS）患者凝血酶生成增加，表明TGA可用于APS的血栓傾向監(jiān)測［32］。肝硬化患者的ST-Genesia測定顯示高凝狀態(tài)［33］。

3.5 心血管疾病和貧血性中風 有研究表明血漿TG水平與癥狀性動脈粥樣硬化疾病之間的關聯(lián)［34］。存在頸動脈斑塊［35］或內膜中層厚度增加［36，37］患者TG增加。急性心肌梗死患者TG升高，且至少持續(xù)6個月［38］。在老年人中，TG升高與中風發(fā)病有關，但與心肌梗死無關［39］。Olson等發(fā)現(xiàn)內源性凝血系統(tǒng)依賴性TG是導致缺血性腦卒中的危險因素之一［40］，而且凝血因子XII的單核苷酸多態(tài)性（SNP）在TG中具有重要性。相反地，Balogun等發(fā)現(xiàn)乏血小板血漿TG不適合于檢測急性缺血性腦卒中的高凝狀態(tài)［41］。另一項研究也沒有發(fā)現(xiàn)ST段抬高型心肌梗死與TG的內源性凝血酶潛力的相關性［42］。因此，雖然“凝血酶越多，血栓形成風險越大”的概念已在VTE研究中得到證實，但凝血酶在動脈粥樣硬化血栓形成中的作用尚不明確［43］。可能的原因是與VTE不同，誘發(fā)血栓形成的動脈粥樣硬化病理變化發(fā)生在血管壁組織，而TGA難以檢測到動脈壁成分的變化。

4 目前TGA應用存在的問題與未來優(yōu)化方向

綜上所述，與其它凝血檢測技術相比，TGA在許多臨床疾病研究和評估方面更有應用價值和前景。但是，目前的TGA檢測系統(tǒng)仍然存在技術難點和局限性，這些問題的解決將推動TGA在臨床實驗更廣泛的應用和優(yōu)化，具體有待解決的關鍵問題如下：

4.1 標準化 雖然這三種商業(yè)化TGA檢測方法均可以檢測患者樣本凝血酶的連續(xù)生成，但是每種方法在底物、樣品制備及處理數(shù)據(jù)數(shù)學公式的不同，導致三者的測量結果之間發(fā)生顯著差異。因為這三種方法各有優(yōu)缺點，沒有優(yōu)劣之分，均有待優(yōu)化之處，因此，迫切需要建立在臨床研究中能夠可靠地檢測、預測和監(jiān)測凝血障礙的標準化TGA方法，這對于全球多中心臨床研究和藥物開發(fā)臨床實驗尤其必要。目前，研究者根據(jù)個人經驗和偏好、實驗室要求或與已建立的光譜儀或熒光計的兼容性來選擇合適的方法。TGA現(xiàn)在和未來臨床適用性取決于控制／標準化變量、檢測結果與臨床病情的相關性，以及對凝血酶相關的疾病進展機制的認識。如果這些問題能夠得到解決，TGA將在臨床上得到更廣泛和可靠的應用。

4.2 全血樣本測量 循環(huán)血液中TG涉及血細胞，如血小板和白細胞（尤其是單核細胞和中性粒細胞），但是目前TGA僅使用乏血小板血漿或富血小板血漿樣本，因為制備過程耗時，所以無法快速診斷。理想的TGA檢測技術是能夠采用全血樣本［44］，這樣便能直接可靠地反映體內凝血狀態(tài)，并建立標準化患者和對照者的血液采集和樣本制備。

4.3 觸發(fā)劑 由于缺乏針對TGA測量條件的標準化觸發(fā)試劑，例如觸發(fā)劑的類型和濃度，或者是否使用接觸活化抑制劑等，因此很難比較不同臨床實驗室的數(shù)據(jù)。目前正在進行幾項研究，力圖對導致變異的主要原因（如觸發(fā)劑的來源和濃度）進行標準化，這些研究將有助于減少分析內和分析間的誤差，以及不同實驗室之間的檢測差異。

4.4 樣品容器反應杯 通過應用凝血因子缺陷的人和小鼠的血漿，我們發(fā)現(xiàn)樣品反應杯可以激活血漿接觸系統(tǒng)（負責內源性凝血途徑的啟動）誘導的凝血酶生成。因此我們需要優(yōu)化樣品容器反應杯的材料，并考慮使用接觸系統(tǒng)抑制劑，以降低材料所致的凝血系統(tǒng)活化。因為TGA是一個開放的檢測系統(tǒng)，所以可以將抗體、蛋白質、酶和多肽等引入分析系統(tǒng)以優(yōu)化測量條件。

4.5 內皮細胞的源性成分 內皮細胞在體內起著預防凝血的重要作用。未來的TGA技術改進可以考慮在反應中加入內皮細胞的源性成分或使用內皮細胞包被的樣品試管，這一改進有望提升血栓形成的整體評估的價值。

4.6 溫度 多項研究表明，導致天數(shù)間或室間結果變異的主要原因之一是血漿樣品的溫度，包括制備乏血小板血漿的離心溫度、TG儀器測量的溫度［45］。溫度的標準化將有助于減少檢測的變異。

TGA的標準化和準確性是其在臨床應用的必要條件。目前國際血栓與止血學會-科學和標準化委員會（ISTH-SSC）正在制定TGA標準化的指南和建議，盡量減少實驗室之間的差異，規(guī)范觸發(fā)劑的使用標準化，例如不同來源的磷脂、不同品牌的組織因子等。同時，制造商還需要幫助研究人員制定更精確的臨床樣本檢測程序。

5 結 論

TGA已成為最可靠的凝血活化測量方法。它可以評估不同內源性和外源性凝血途徑誘導的凝血酶生成。由于其廣泛的臨床應用，目前迫切需要一種能夠可靠地檢測、預測和監(jiān)測凝血功能障礙的全球性標準化檢測方法，以達到更精確地反映體內凝血狀態(tài)。

作者貢獻聲明武藝、魯翌、葉絮、劉爍撰寫文章；武藝負責整體設計和校正

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

縮略表

凝血酶生成實驗，TGA；校準的自動血栓形成圖，CAT；血栓彈力圖，TEG；凝血酶原時間，PT；活化部分促凝血酶原激酶時間，APTT；貧血小板血漿，PPP；富血小板血漿，PRP；組織因子，TF；因子XII，F(xiàn)XII；前激肽釋放酶，PK；高分子量激肽原，HK；鐮狀細胞貧血病，SCD；靜脈血栓栓塞癥，VTE。