血清HMGB1、BNP水平參與先天性心臟病大鼠肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的機(jī)制

汪毅 張曉羽 張旭光 閆志國(guó)

(昆明市第一人民醫(yī)院心胸外科，云南 昆明 650051)

先天性心臟病作為先天畸形常見(jiàn)類型，約占全部先天畸形的20%，而心臟大血管形成障礙或發(fā)育異常，容易增加心臟負(fù)荷，導(dǎo)致肺循環(huán)血流量升高，加重肺臟負(fù)擔(dān)，引發(fā)肺動(dòng)脈高壓(PH)〔1〕。據(jù)報(bào)道，PH會(huì)誘發(fā)肺小動(dòng)脈反射性收縮，增加回心血量，從而進(jìn)一步加重心臟負(fù)荷，引發(fā)心力衰竭〔2〕。目前，臨床多采用右心導(dǎo)管評(píng)估PH，此檢查方式雖可明確肺血管阻力情況，但有創(chuàng)性檢查不利于臨床推廣〔3〕。研究指出，PH病理特征主要以血管痙攣、內(nèi)膜重構(gòu)等為主，而肺血管炎癥免疫、血管收縮在PH病理改變中發(fā)揮重要作用〔4〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是一種具有特征性損傷相關(guān)分子模式的分子，可參與免疫應(yīng)答、組織重構(gòu)、血管再生等多種過(guò)程，且可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化〔5〕。腦鈉肽(BNP)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)拮抗劑，可促血管松弛，抑制血管活性肽收縮，且可降低交感神經(jīng)活性〔6〕。結(jié)合HMGB1、BNP作用機(jī)制，推測(cè)二者在先天性心臟病患者PH發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但具體作用機(jī)制尚待探討。本研究建立先天性心臟病大鼠模型，分析血清HMGB1、BNP水平與先天性心臟病大鼠發(fā)生PH的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究獲得動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查批準(zhǔn)。選取10只正常大鼠，20只先天性心臟病大鼠(由動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買)，全部大鼠飼養(yǎng)在22～25℃恒溫動(dòng)物房?jī)?nèi)，予以足夠水及顆粒飼料，進(jìn)行黑暗與光照處理(間隔12 h交替1次)；10只正常大鼠周齡5～10 w，平均(7.56±0.67)w；體重0.15～0.26 kg，平均(0.19±0.02)kg。20只先天性心臟病大鼠周齡5～11 w，平均(7.58±0.65)w；體重0.12～0.26 kg，平均(0.18±0.02)kg。

1.2主要藥品與試劑 同型半胖氨酸購(gòu)自北京博奧派克生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)自四川佰春科技有限責(zé)任公司；野百合堿購(gòu)自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：YS-R63643；生理鹽水購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：PY08-074；戊巴比妥鈉購(gòu)自湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自上海滬震實(shí)業(yè)有限公司。

1.3主要儀器與設(shè) 八導(dǎo)生理記錄儀購(gòu)自北京華睿寶科技有限公司(型號(hào)：BIOPAC MP150)；低速離心機(jī)購(gòu)自濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司(型號(hào)：TD-4X)。

1.4先天性心臟病大鼠建模方法 于孕鼠妊娠第7天，注入高劑量同型半胖氨酸200 mg/(kg·d)，1次/d，直至孕第17天，停止1 d后，孕第19天再次注射1次，注意每次注射結(jié)束需保證回抽無(wú)液體；孕第20天，在水合氯醛麻醉下剖宮取胎；于體視鏡下觀察仔鼠心臟結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)房間隔缺損、室間隔缺損、大血管錯(cuò)位等即可判定為先天性心臟病。

1.5先天性心臟病大鼠PH建模方法 采用野百合堿建立20只先天性心臟病大鼠PH模型，將野百合堿以2∶8比例溶于生理鹽水中，配置成1%溶液，取50 mg/kg溶液注入大鼠腹部，1次/d，共注射28 d。注射結(jié)束，用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，使其呈仰臥位，區(qū)分左側(cè)頸總動(dòng)脈與右側(cè)頸靜脈，將壓力感受器連接在左側(cè)頸總動(dòng)脈，并經(jīng)右側(cè)頸靜脈置入含有0.3%肝素生理鹽水的PE50導(dǎo)管直至右心室，將八導(dǎo)生理記錄儀與壓力感受器相連接，經(jīng)記錄儀觀察壓力波形變化，判斷導(dǎo)管是否進(jìn)入右心室，穩(wěn)定后測(cè)定肺平均動(dòng)脈壓；海平面靜息狀態(tài)下，肺動(dòng)脈平均壓≥25 mmHg即可判定為PH。

1.6血清HMGB1、BNP水平檢測(cè) 空白對(duì)照組、先天性心臟病大鼠眼眶取血2 ml，用低速離心機(jī)以1 000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，采取血清用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清HMGB1、BNP水平，檢驗(yàn)流程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1空白對(duì)照組、先天性心臟病組血清HMGB1、BNP水平比較 先天性心臟病組血清HMGB1、BNP水平〔(10.43±2.03)μg/L、(166.26±12.35)pg/ml〕高于空白對(duì)照組〔(4.25±1.24)μg/L、(79.25±9.62)pg/ml〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.796、15.436,均P<0.05〕。

2.2先天性心臟病大鼠PH建模情況 20例先天性心臟病大鼠中，有13例(65.0%)PH建模成功。大鼠研究期間均無(wú)病死及意外死亡。

2.3發(fā)生PH、未發(fā)生PH先天性心臟病大鼠血清HMGB1、BNP水平比較 發(fā)生PH先天性心臟病大鼠血清HMGB1、BNP水平〔(12.63±3.25)μg/L、(185.35±15.24)pg/ml〕高于未發(fā)生大鼠〔(6.35±2.10)μg/L、(130.81±14.22)pg/ml〕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.592、7.804,均P<0.001)。

2.4血清HMGB1、BNP水平與先天性心臟病大鼠發(fā)生PH的回歸分析 將先天性心臟病大鼠PH發(fā)生情況作為因變量(1=發(fā)生，0=未發(fā)生)，將血清HMGB1、BNP作為自變量(均為連續(xù)變量)，經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清HMGB1、BNP水平升高是先天性心臟病大鼠發(fā)生PH的風(fēng)險(xiǎn)因子(OR>1，P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 血清HMGB1、BNP水平與先天性心臟病大鼠 發(fā)生PH的回歸分析

3 討 論

先天性心臟病作為心臟外科常見(jiàn)疾病，多因胚胎時(shí)期心臟及大血管發(fā)育異常所導(dǎo)致，據(jù)報(bào)道，先天性心臟病發(fā)生率為0.4%～1.0%〔7〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)，先天性心臟病長(zhǎng)期發(fā)展會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓進(jìn)行性升高，引發(fā)PH，而PH發(fā)生后會(huì)進(jìn)一步增加右心負(fù)荷，形成惡性循環(huán)，增加心力衰竭發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔8〕。因此，明確可能與先天性心臟病發(fā)生PH有關(guān)指標(biāo)及機(jī)制，可能對(duì)臨床早期干預(yù)有重要意義。

HMGB1作為高度保守的蛋白質(zhì)，其在細(xì)胞核內(nèi)可與DNA、組蛋白相互作用，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在細(xì)胞核外可與趨化因子、病原相關(guān)分子相互作用，調(diào)控細(xì)胞因子表達(dá)〔9〕。研究顯示，HMGB1可結(jié)合晚期糖基化終末產(chǎn)物、toll樣受體2、4等受體，其中與toll樣受體4結(jié)合后可活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF)-κB，促使巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素6等炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)〔10〕。而相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路活化可能會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞炎癥性重構(gòu)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓升高〔11〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可結(jié)合RAGE，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使血管病變〔12〕。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1是PH發(fā)生的起始因子，通過(guò)促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)釋放，可引發(fā)肺血管炎癥反應(yīng)，促進(jìn)氧自由基釋放，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致PH發(fā)生，而采用抗HMGB1抗體干預(yù)，可阻止PH發(fā)展〔13〕。BNP是由32個(gè)氨基酸組成的多肽，主要由心室分泌，可阻滯縮血管活性肽生成，促使血管平滑肌細(xì)胞松弛，抑制心肌纖維細(xì)胞增殖〔14〕。目前，BNP已被作為心力衰竭敏感標(biāo)志物之一，心肌細(xì)胞受損后會(huì)大量分泌BNP入血，且BNP水平不受年齡、腎功能等因素影響，可良好反映心功能狀態(tài)〔15〕。研究發(fā)現(xiàn)，BNP表達(dá)與急性肺栓塞患者PH發(fā)生有關(guān)，且BNP可作為PH發(fā)生評(píng)估指標(biāo)之一〔16〕。結(jié)合HMGB1、BNP作用機(jī)制，推測(cè)二者與先天性心臟病大鼠發(fā)生PH有關(guān)。

本研究結(jié)果初步說(shuō)明HMGB1、BNP可能與先天性心臟病有關(guān)。分析原因在于，先天性心臟病大鼠心臟負(fù)荷大會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致?lián)p傷分子HMGB1表達(dá)增加，且受損的心肌細(xì)胞會(huì)大量分泌BNP，從而導(dǎo)致血清BNP水平大幅升高〔17〕。本研究進(jìn)一步證實(shí)HMGB1、BNP與先天性心臟病大鼠發(fā)生PH有關(guān)。分析原因，HMGB1水平升高會(huì)促使多種炎癥因子生成，引發(fā)肺血管炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺動(dòng)脈血管重構(gòu)，增加肺動(dòng)脈壓；BNP水平升高提示心肌損傷嚴(yán)重，可能會(huì)增加肺血流量，從而增加PH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔18〕。但本研究并未分析HMGB1、BNP預(yù)測(cè)先天性心臟病大鼠發(fā)生PH風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值，研究結(jié)果存有局限，未來(lái)仍需展開前瞻性研究加以驗(yàn)證，并將所得結(jié)果在先天性心臟病患者中推廣應(yīng)用。

綜上，先天性心臟病大鼠發(fā)生PH與血清HMGB1、BNP水平升高有關(guān)，考慮未來(lái)可檢測(cè)血清HMGB1、BNP水平，輔助評(píng)估先天性心臟病并發(fā)PH的風(fēng)險(xiǎn)。