阿霉素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠腸道菌群改變及益生菌對(duì)其NLRP3表達(dá)和心功能的影響

王建林 楊麗 史磊

(東營(yíng)市中醫(yī)院 1心內(nèi)科，山東 東營(yíng) 257000；2急診科)

炎癥小體是一類存在于胞質(zhì)內(nèi)的大分子蛋白復(fù)合體，與慢性心力衰竭(CHF)〔1，2〕等心血管疾病密切相關(guān)〔3〕。其中Nod樣受體蛋白(NLRP)3炎癥小體是目前研究相對(duì)最多的炎癥小體，其激活后可促進(jìn)炎癥介質(zhì)表達(dá)、釋放，促進(jìn)CHF發(fā)生發(fā)展〔4〕。腸道是抵御“外來(lái)侵略”的主要屏障，其正常的菌群結(jié)構(gòu)在維持營(yíng)養(yǎng)、物質(zhì)代謝等機(jī)體生理活動(dòng)方面發(fā)揮重要作用〔5〕。腸道菌群改變?cè)谛募」Ｋ馈?dòng)脈粥樣硬化、CHF、高血壓等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用〔6，7〕。益生菌是一類能夠促進(jìn)腸道菌群生態(tài)平衡，修復(fù)腸道屏障，有益于宿主健康的活體微生物〔8〕。益生菌能通過(guò)修復(fù)腸道屏障控制機(jī)體炎癥平衡〔9〕。本研究將使用阿霉素誘導(dǎo)大鼠CHF模型，探討益生菌對(duì)CHF大鼠NLRP3表達(dá)及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量(250±10)g，購(gòu)自寧波康泰博科技發(fā)展有限公司，許可證號(hào)：SYXK(浙)2018-0014。

1.2主要試劑與儀器 阿霉素(貨號(hào)：K0091，購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司)；芪藶強(qiáng)心膠囊(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040141，購(gòu)自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司)；益生菌(貨號(hào)：WTLS-05552，購(gòu)自蘭州沃特萊斯生物科技有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(貨號(hào)：DEM202，購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號(hào)：DH0006，購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司)；(RIPA)裂解液(貨號(hào)：AR0020，購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司)；NLRP3抗體、抗體分泌細(xì)胞(Asc)抗體、半胱氨酸蛋白酶(caspase)-1抗體、白細(xì)胞介素(IL)-1β抗體、IL-18抗體、GAPDH抗體、羊抗兔lgG(貨號(hào)：ab263899、ab111852、ab138483、ab200478、ab223293、ab59164、ab205718，購(gòu)自abcam公司)。

彩色超聲顯像儀(型號(hào)：VividE9,購(gòu)自美國(guó)GE公司)；顯微鏡(型號(hào)：CKX41SF,購(gòu)自日本Olympus公司)；熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI 7500,購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiDocXRS,購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3分組、造模與給藥 40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性組和益生菌組各10只。用0.9%氯化鈉注射液將阿霉素配制成2 mg/ml溶液，模型組、陽(yáng)性組和益生菌組每只大鼠按照2 mg/kg劑量給予阿霉素尾靜脈注射；同時(shí)，對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉注射液尾靜脈注射，1次/w，連續(xù)給藥7 w〔10〕。最后一次給藥12 h后，陽(yáng)性組按0.32 g/kg劑量灌胃芪藶強(qiáng)心膠囊，益生菌組按5×108CFU/kg劑量灌胃益生菌，對(duì)照組、模型組均給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥4 w結(jié)束。

1.4超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 按3 ml/kg給予大鼠10%水合氯醛腹腔注射，取仰臥位，胸部備皮，使用彩色超聲顯像儀的10 MHz高頻探頭獲取左心室長(zhǎng)軸二維圖像，在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于左心室后壁和室間隔，獲得M型超聲心動(dòng)圖，測(cè)定左心室舒張末內(nèi)徑(LVEDD)和左心室收縮末內(nèi)徑(LVESD)，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.5qRT-PCR檢測(cè)大鼠腸道菌群 收集各組大鼠糞便樣品1～2 g，提取糞便細(xì)菌基因組總DNA，利用功能菌群(乳酸桿菌、雙歧桿菌和彎曲桿菌)特異性引物，采用熒光定量PCR儀檢測(cè)乳酸桿菌、雙歧桿菌和彎曲桿菌的豐度，結(jié)果用細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)/g糞便表示。

1.6HE染色觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變 處死大鼠，每組取5只大鼠心肌組織，4%多聚甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋、切片，石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后行HE染色，脫水、透明、封片，使用光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織病變情況并拍照。

1.7Western印跡檢測(cè)心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)情況 取每組剩余5只大鼠心肌組織，用放射性免疫沉淀分析(RIPA)裂解液裂解提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，取定量蛋白，并將蛋白變性，進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(NLRP3抗體、Asc抗體、caspase-1抗體、IL-1β抗體、IL-18抗體、GAPDH抗體，均1∶500稀釋)，4℃下孵育過(guò)夜，TBST洗滌3次，加二抗(羊抗兔，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，1∶2 000稀釋)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次，顯色曝光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件行方差分析，SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠超聲心電圖參數(shù) 與對(duì)照組相比，模型組、陽(yáng)性組、益生菌組LVEDD、LVESD顯著升高，LVEF顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、益生菌組LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF顯著升高(均P<0.05)；與陽(yáng)性組相比，益生菌組LVEDD、LVESD顯著降低，LVEF顯著升高(均P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠腸道菌群變化 與對(duì)照組相比，模型組、陽(yáng)性組、益生菌組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度顯著降低，彎曲桿菌豐度顯著升高(均P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、益生菌組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度顯著升高，彎曲桿菌豐度顯著降低(均P<0.05)；與陽(yáng)性組相比，益生菌組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌豐度顯著升高，彎曲桿菌豐度顯著降低(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組LVEDD、LVESD、LVEF比較

表2 各組糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、彎曲桿菌豐度及 心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)比較

2.3各組心肌組織病理改變 HE染色顯示，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，輪廓清晰，未見(jiàn)病理學(xué)改變；模型組心肌纖維染色不均，心肌細(xì)胞變形、水腫、排列雜亂，細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂或固縮，心外膜可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；陽(yáng)性組、益生菌組心肌組織病變程度較模型組均有不同程度的改善，見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌組織病理改變(HE染色，×200)

2.4各組大鼠心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，模型組、陽(yáng)性組、益生菌組NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，陽(yáng)性組、益生菌組NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與陽(yáng)性組相比，益生菌組NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組心肌組織中NLRP3、Asc、caspase-1、IL-1β、 IL-18蛋白表達(dá)

3 討 論

阿霉素?fù)p害心肌組織具有慢性、蓄積性的優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用來(lái)誘導(dǎo)建立CHF大鼠模型。本研究采用尾靜脈注射的方式使用阿霉素誘導(dǎo)建立CHF大鼠模型〔11〕。人體腸道中含有大量的菌群，其平衡可以協(xié)助機(jī)體保護(hù)腸黏膜屏障，幫助機(jī)體吸收分解食物、攝取營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)代謝及機(jī)體免疫功能，防止病原菌及其有害副產(chǎn)物進(jìn)入體內(nèi)〔12〕。腸道菌群的失衡會(huì)引起腸黏膜屏障破壞及菌群移位，引起體循環(huán)炎癥水平，進(jìn)而影響機(jī)體健康〔13〕。CHF患者腸道菌群紊亂狀態(tài)可表現(xiàn)為乳酸桿菌、類桿菌、雙歧桿菌等益生菌數(shù)量減少，而沙門菌、彎曲桿菌、志賀桿菌、假絲酵母菌和耶氏森菌等腸道上皮細(xì)胞病原菌數(shù)量增多〔14〕。本結(jié)果提示CHF大鼠腸道菌群已發(fā)生明顯改變。益生菌能調(diào)控血脂水平，維持大鼠體內(nèi)部分抗氧化酶活力和非酶抗氧化物質(zhì)水平，拮抗肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，減輕肝臟炎癥，緩解肝臟受損的程度〔15〕。益生菌可能通過(guò)糾正腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，修復(fù)腸道屏障功能及改善腸道內(nèi)環(huán)境，以保護(hù)大鼠酒精性肝損傷〔16〕。腸道菌群改變與CHF密切相關(guān)，CHF伴發(fā)的血流動(dòng)力學(xué)改變可改變腸道通透性、功能及腸道菌群平衡，破壞腸道屏障〔17〕。本研究提示CHF大鼠灌胃益生菌可改善腸道菌群平衡、改善大鼠心功能，有利于大鼠病情好轉(zhuǎn)。

炎癥反應(yīng)是CHF發(fā)病過(guò)程中的重要病理生理機(jī)制，其發(fā)生貫穿于CHF整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大、凋亡及纖維化，促進(jìn)病情進(jìn)展〔18〕。NLRP3炎癥小體是目前研究較深入的炎性小體，由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白Asc和caspase-1組成，可調(diào)控TNF-α、IL-1β、IL-18等炎癥細(xì)胞因子的成熟與分泌，參與絕大多數(shù)炎癥反應(yīng)過(guò)程〔19，20〕。張?bào)懔盏取?〕研究發(fā)現(xiàn)，灌胃益生菌產(chǎn)品能夠有效改善慢性腎臟病大鼠腎功能缺失性腸屏障損傷，減輕大鼠體內(nèi)的系統(tǒng)炎癥現(xiàn)象。本研究提示由NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與CHF發(fā)病過(guò)程，而灌胃益生菌可抑制NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。