基于PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路探討活血接骨復(fù)方膠囊對(duì)閉合性腰椎骨折家兔的干預(yù)效果

許和貴 王羿 李玉雄 劉洋 王思濤 鄧小龍

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550001；2貴州中醫(yī)藥大學(xué))

骨折愈合過程屬于一種復(fù)雜、有序的生物學(xué)修復(fù)過程，相關(guān)研究顯示，血液循環(huán)狀態(tài)、生物化學(xué)、物理因子、人體微量因子對(duì)骨折愈合過程產(chǎn)生嚴(yán)重的影響〔1〕。目前研究指出，有10%的骨折愈合緩慢，甚至無法愈合〔2〕，因此，促進(jìn)患者骨折愈合，縮短患者愈合時(shí)間具有重要意義。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在多種細(xì)胞信號(hào)通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞生長、分化、增殖等重要過程，是自噬通路上游主要的調(diào)節(jié)蛋白，在自噬活性中發(fā)揮著重要調(diào)控作用〔3,4〕?；钛庸菑?fù)方膠囊是在貴州中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科時(shí)光達(dá)老教授研究的治療骨折的經(jīng)驗(yàn)方之上加減并改良劑型而成，大部分患者經(jīng)過活血接骨復(fù)方膠囊治療，效果顯著，能明顯縮短患者骨折腫痛、愈合時(shí)間，產(chǎn)生的不良反應(yīng)也較少〔5〕。本文基于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信號(hào)通路探討活血接骨膠囊對(duì)閉合性腰椎骨折模型家兔的干預(yù)效果。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取普通級(jí)雄性家兔40只，平均體重(2.05±0.55)kg，均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究所提供(生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(黔)2012-0011)。

1.2模型建立及分組 40只家兔中選取10只為正常組，其余30只參考劉匆聰?shù)取?〕文獻(xiàn)建立閉合性腰椎骨折模型，手術(shù)前將家兔脫毛處理后使用10%水合氯醛(2 ml/kg)給予腹腔麻醉，皮膚使用紗布覆蓋，防止對(duì)其他部位產(chǎn)生損傷。采用預(yù)損傷結(jié)合逐級(jí)撞擊法進(jìn)行，先采用3 mm的鉆頭對(duì)家兔L3錐體前方、側(cè)方皮質(zhì)進(jìn)行破壞，使用1 250 g重力，厚1.0 cm牽引砣從45 cm高處向下垂直沖擊，控制撞擊點(diǎn)在標(biāo)本前1/3部位，如果L3未骨折，則以10 cm為一梯度逐級(jí)升高牽引砣高度，增加撞擊力，直到L3骨折。術(shù)后3 d每只家兔給予青霉素80萬U，防止感染。最終建模成功27只，分為模型組、對(duì)照組和活血接骨組各9只?；钛庸菑?fù)方膠囊由活血接骨方(骨碎補(bǔ)、續(xù)斷、自然銅、土鱉蟲、丹參、透骨草、蘇木、三七、冰片、元胡等藥物)按藥物比例研磨成粉制成膠囊?；钛庸墙M給予活血接骨復(fù)方膠囊干預(yù)，500 mg/kg，使用10 ml/kg蒸餾水配制混懸液對(duì)家兔給予灌胃給藥，1次/d。正常組和模型組給予等量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。對(duì)照組給予等量的傷科接骨片進(jìn)行干預(yù)。4組均連續(xù)干預(yù)4 w，家兔均給予相同的普通飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.3檢測血清鈣(Ca)、磷(P)、堿性磷酶酸(ALP)、Ⅰ型膠原、骨鈣素、自噬相關(guān)蛋白(LC3)-Ⅱ及Beclin-1水平 抽取家兔腹部靜脈血3 ml,以3 000 r/min，離心處理10 min后，分離上層血清。偶氮胂Ⅲ法檢測鈣水平，嚴(yán)格按照偶氮胂Ⅲ試劑盒及其相關(guān)試劑說明書進(jìn)行操作；鉬藍(lán)比色法檢測磷水平。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測：將提前稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品100 μl加入相應(yīng)的微孔板反應(yīng)空中，第1孔只加樣品稀釋液為零孔。蓋上模板混合均勻，在37℃下處理90 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；將準(zhǔn)備好的抗體加入到每孔中0.1 ml，在37℃下處理60 min，底物四甲基聯(lián)苯胺(TMS)空白孔不加；甩去孔內(nèi)液體，每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，浸泡1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，吸干水分；每孔中加入90 μl TMS，避光處理15～20 min；每孔中加入90 μl TMS終止液，即藍(lán)色變?yōu)辄S色。在波長450 mm處分析ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素、LC3-Ⅱ、Beclin-1水平。

1.4骨痂厚度、Lane放射學(xué)評(píng)分 提取每只家兔骨痂組織，以骨折為中心選擇10個(gè)視野，使用目鏡測微尺觀察骨痂厚度。Lane放射學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無骨形成，骨折線清晰為0分；骨形成占缺損<25%，骨折線部分存在為1分；骨形成占缺損的25%～75%，骨折線消失為2分；骨形成占缺損>75%，皮質(zhì)骨塑型為3分。

1.5病理學(xué)觀察 處死家兔，解剖后快速提取家兔骨組織制作標(biāo)本，將其置于4%的多聚甲醛中進(jìn)行固定，制作常規(guī)石蠟切片，在濃度0.5%蘇木精-伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹膠進(jìn)行封片。

1.6檢測PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白 采用Western印跡檢測，將采集到的血液標(biāo)本3 000 r/min離心處理10 min，對(duì)上清液進(jìn)行提取后，二喹啉甲酸(BCA)進(jìn)行蛋白定量檢測，在2×十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，在100℃環(huán)境中加熱5 min有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間為1 h，將一抗使用0.05%～0.10%三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液(TBST)給予稀釋(PI3K、Akt、mTOR一抗為1∶1 000)，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.10% TBST稀釋(1∶10 000)，搖動(dòng)孵育時(shí)間為1 h，再次采用TBST連續(xù)洗膜3次，5 min/次。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中Ca、P、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素水平比較 與正常組相比，其余3組Ca水平、骨痂厚度明顯升高，P、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素水平、Lane放射學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，對(duì)照組、活血接骨組Ca水平明顯降低，P、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素水平及骨痂厚度、Lane放射學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.05)；與對(duì)照組相比，活血接骨組Ca水平明顯降低，P、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素水平及骨痂厚度、Lane放射學(xué)評(píng)分明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組病理學(xué)觀察 正常組有成熟骨細(xì)胞個(gè)新生骨小梁分布，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整骨邊緣界限緊密結(jié)合；模型組僅有少量的成骨細(xì)胞，細(xì)胞排列紊亂；對(duì)照組有少量的新生骨產(chǎn)生，但骨小梁未見完全成熟；活血接骨組有大量的成熟成骨細(xì)胞和新生骨小梁，細(xì)胞排列逐漸整齊，修復(fù)效果顯著。見圖1。

2.3各組LC3-Ⅱ、Beclin-1水平及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，其余3組LC3-Ⅱ、Beclin-1水平明顯降低，PI3K、Akt、mTOR表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，對(duì)照組、活血接骨組LC3-Ⅱ、Beclin-1水平升高，PI3K、Akt、mTOR表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，活血接骨組LC3-Ⅱ、Beclin-1水平升高，PI3K、Akt、mTOR表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組血清中Ca、P、ALP、Ⅰ型膠原、骨鈣素水平及骨痂厚度、Lane放射學(xué)評(píng)分比較

表2 各組LC3-Ⅱ、Beclin-1水平及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖2 各組PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

骨折是臨床中的一種常見的骨科疾病，目前如何促進(jìn)骨折快速愈合是臨床研究的重點(diǎn)，目前中醫(yī)藥在治療骨折方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，閉合性骨折常采用中醫(yī)手法復(fù)位小夾板固定輔助中藥進(jìn)行治療〔7〕。在中醫(yī)中，血淤屬于骨折范疇，骨折損傷容易帶著氣血血脈離經(jīng)，惡血留滯血瘀產(chǎn)生，氣血運(yùn)行失常容易引起淤積不散，主要表現(xiàn)為腫痛〔8〕。活血接骨膠囊具有活血化瘀、補(bǔ)腎強(qiáng)骨等作用，通過改善骨折局部的血流循環(huán)，能緩解血腫狀況，對(duì)骨折部位骨基質(zhì)鈣鹽沉淀有顯著的促進(jìn)作用，有助于骨痂厚度提高，通過調(diào)控骨生長相關(guān)因子，促進(jìn)骨折愈合〔9,10〕。當(dāng)骨折發(fā)生，通過血液循環(huán)及破骨細(xì)胞活動(dòng)，將鈣離子釋放到血液中，導(dǎo)致骨折早期，鈣離子濃度較高，隨著患者骨折愈合時(shí)間延長，其鈣離子濃度降低〔11〕。研究指出，鈣、磷有助于維持機(jī)體穩(wěn)定，當(dāng)鈣離子濃度降低，血液中磷濃度會(huì)隨之升高，鈣磷乘積也提高，從而促進(jìn)鈣鹽沉積，骨折愈合時(shí)間縮短〔12,13〕。Runyan等〔14〕研究指出，骨基質(zhì)鈣化是骨組織修復(fù)的關(guān)鍵，在骨折愈合中鈣鹽發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，骨組織修復(fù)必須有骨基質(zhì)參與。本文研究結(jié)果提示，活血接骨膠囊能促進(jìn)家兔鈣鹽在骨折處沉積，在骨折愈合中起到一定的積極作用。

ALP水平高低在評(píng)估骨細(xì)胞功能、分化程度等方面發(fā)揮著重要作用，其也是反映成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志，ALP主要是由成骨細(xì)胞分泌，具有較高的特異性，在骨折愈合中，ALP水平高低能體現(xiàn)骨形成過程〔15〕。骨鈣素屬于一種非膠原蛋白，主要通過成骨細(xì)胞合成和分泌，在軟骨礦化過程中具有重要作用；Ⅰ型膠原水平增加對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化具有一定的誘導(dǎo)作用，加快成骨細(xì)胞骨形成，促進(jìn)骨折組織修復(fù)〔16,17〕。本研究提示活血接骨膠囊有助于增加成骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞活性提高、促進(jìn)家兔骨折快速愈合。細(xì)胞自噬主要參與的調(diào)節(jié)蛋白分子包括mTOR和PI3K，LC3是一種與酵母ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物，主要存在于哺乳動(dòng)物中，Beclin-1屬于自噬中的特異性蛋白，當(dāng)機(jī)體受到不同程度的刺激，細(xì)胞會(huì)將自噬激活，大量研究已證實(shí)骨組織受到創(chuàng)傷后細(xì)胞自噬也會(huì)發(fā)生變化〔18,19〕?；钛庸菑?fù)方膠囊在臨床中主要用于骨折、脫臼、軟組織損傷、頸肩腰腿痛等多種疾病，具有消腫祛痛、壯骨接骨等功效。三七、血竭主要功效是活血、止血，活血化瘀，促進(jìn)高凝狀態(tài)血液重新開始流通，促進(jìn)破裂血管閉合，起到止血作用〔20〕。Liu等〔21〕研究指出，通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路生物學(xué)活性，能減弱其對(duì)下游蛋白的作用，進(jìn)一步將細(xì)胞自噬激活。本研究結(jié)果提示活血接骨復(fù)方膠囊能通過對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)骨折愈合。