聲門上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1、miR-210表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

延青 楊花榮 王娜娜

聲門上型喉癌約占喉癌的40%，是指發(fā)生于聲帶以上部位的實(shí)體腫瘤，手術(shù)結(jié)合放療或化療是其主要治療方式，但治療后患者往往存在復(fù)發(fā)等不良預(yù)后，因此，研究有效的預(yù)測生物標(biāo)記物用于聲門上型喉癌的診療及預(yù)后評估具有重要意義[1-3]。長鏈非編碼RNA（Long chain non-coding RNA, LncRNA）可作為致癌或抑癌基因參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，在喉癌診斷與治療方面的應(yīng)用成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[4，5]。作為一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（prostate cancer associated transcript-1，PCAT-1）參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由15～24 個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于真核細(xì)胞中，可參與機(jī)體多種生理和病理過程，具有作為血清標(biāo)志物的潛力[6，7]。LncRNA 與miRNA 相互作用，是喉癌研究的一個(gè)新階段，LncRNA PCAT-1 含有miR-210的結(jié)合位點(diǎn)，可能共同參與喉癌的發(fā)生發(fā)展，但其相互作用發(fā)揮調(diào)控的機(jī)制仍不清楚[5，7]。本研究通過檢測聲門上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，旨在初步探討血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平在聲門上型喉癌中的作用，為降低預(yù)后不良發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供幫助。

資料與方法

1 一般資料

選取在本院就診的聲門上型喉癌患者120 例（選取時(shí)間為2013 年12 月～2017 年12 月）為觀察組，平均年齡（57.53±5.85）歲，男/女為108/12 例，平均體質(zhì)指數(shù)（BMI）為（19.98±5.43）kg/m2，T 分期：T1期83 例，T2 期37 例。將本組患者根據(jù)預(yù)后情況分為預(yù)后不良組21 例，男19 例，女2 例，平均年齡為（57.41±6.36）歲，BMI 為（19.82±5.25）kg/m2，T 分期：T1 期5 例，T2 期16 例；預(yù)后良好組99 例，男89例，女10 例，平均年齡為（57.65±6.52）歲，平均BMI為（20.14±5.63）kg/m2，T 分期：T1 期78 例，T2 期21例。另選擇同期于本院進(jìn)行體檢的健康者120 例為對照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)喉部、頸部CT 及手術(shù)病理檢查確診為聲門上型喉癌；②患者知情且隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心力衰竭、心絞痛等心血管疾病者；②妊娠期婦女；③有家族精神病史或患有相關(guān)精神疾病的患者；④不能全程配合隨訪患者。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準(zhǔn)。

2 血清LncRNA PCAT1、miR-210 表達(dá)水平檢測

所有研究對象于術(shù)前抽取靜脈血10mL，離心（3000r/min）后提取血清。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測血清中LncRNA PCAT1、miR-210 表 達(dá) 水 平。以 美 國Invitrogen 公司的RNA 提取試劑盒（貨號15596-026）提取血清總RNA 和北京百奧萊博科技有限公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號ALH266-PTO）合成cDNA后進(jìn)行qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系共20μL：miScript SYBRRGreen Mix（貨號218073，德國QIAGEN 公司）10μL，cDNA 4.0μL，上下游引物（10 μM）各1μL，ddH2O 4.0μL。LncRNA PCAT1 以GAPDH 作為內(nèi)參，miR-210 以U6 作為內(nèi)參，引物由EXIQON 公司合成。循環(huán)條件：92℃60s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃30s，56℃30s，72℃30s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算血清中LncRNA PCAT1、miR-210 相對表達(dá)量。取3 次的平均值。

3 隨訪

所有患者均保留有完整的隨訪資料，以門診與電話相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪，平均隨訪時(shí)間36 個(gè)月，隨訪截止2020 年12 月，統(tǒng)計(jì)患者生存情況，其中生存99 例作為預(yù)后良好組，死亡21 例作為預(yù)后不良組。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 20.0 處理數(shù)據(jù)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)數(shù)資料以n 表示，采用檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；采用Logistic 回歸分析影響聲門上型喉癌患者預(yù)后的因素；采用ROC 曲線分析血清LncRNA PCAT1、miR-210 單獨(dú)及聯(lián)合對聲門上型喉癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值。

結(jié)果

1 兩組血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平比較

觀察組血清LncRNA PCAT1 水平顯著高于對照組（P＜0.05），miR-210 水平顯著低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 觀察組與對照組血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平比較（±s）

表1 觀察組與對照組血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平比較（±s）

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2 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平與聲門上型喉癌病理參數(shù)的關(guān)系

以血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平平均值為界，高于其平均值為高表達(dá)，低于其平均值為低表達(dá)。血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平均與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平與聲門上型喉癌病理參數(shù)的關(guān)系

3 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平與預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)隨訪情況將患者分為預(yù)后不良組21 例和預(yù)后良好組99 例，兩組患者年齡、性別及BMI 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），預(yù)后不良組患者血清LncRNA PCAT1 水平顯著高于預(yù)后良好組（P＜0.05），T1 期比例及血清miR-210 水平顯著低于預(yù)后良好組（P＜0.05），見表3。

表3 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平與預(yù)后的關(guān)系[（±s）或n]

表3 血清LncRNA PCAT1、miR-210 水平與預(yù)后的關(guān)系[（±s）或n]

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4 聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的影響因素

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T 分期為T2 期、LncRNA PCAT1 高表達(dá)、miR-210 低表達(dá)均是影響聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表4。

表4 影響因素分析結(jié)果

5 ROC 曲線分析血清LncRNA PCAT1、miR-210 對聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的預(yù)測價(jià)值

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，血清LncRNA PCAT1預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后的曲線下面積為0.899（95% CI：0.784～1.000）（P＜0.001），截?cái)嘀禐?.601，敏感度為81.0%，特異性為98.0%。血清miR-210 預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后的曲線下面積為0.764（95% CI：0.678～0.849）（P＜0.001），截?cái)嘀禐?.902，敏感度為90.5%，特異性為60.6%。血清LncRNA PCAT1、miR-210 聯(lián)合預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后的曲線下面積為0.925（95% CI：0.832～1.000）（P＜0.001），敏感度為81.0%，特異性為99.0%，見圖1。

圖1 ROC 曲線分析血清LncRNA PCAT1、miR-210對聲門上型喉癌患者預(yù)后的預(yù)測價(jià)值

討論

聲門上型喉癌是指發(fā)生在聲門上區(qū)（如會厭、室?guī)А㈣紩掫诺龋┑暮戆?，發(fā)展較快，癥狀不明顯，給患者和社會帶來了巨大的健康負(fù)擔(dān)，診治可提高患者的生存率，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素[8，9]。LncRNA 是一類非編碼蛋白RNA 分子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮復(fù)雜的生物功能。研究顯示LncRNA 在喉癌等多種腫瘤中都存在異常表達(dá)或功能異常，有望成為喉癌診斷或評估預(yù)后的新型生物標(biāo)志物[10，11]。LncRNA PCAT1 首先發(fā)現(xiàn)于前列腺癌中，參與機(jī)體基因組印記、轉(zhuǎn)錄激活與干擾等多種細(xì)胞生理過程，其表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系[10，12]。李艷莉等[12]研究表明，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PCAT1 表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織。Hu 等[13]研究指出，PCAT1 可能是喉癌中一種新的癌基因，其表達(dá)水平在喉癌組織中明顯上調(diào)。本研究中，聲門上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1 水平較對照組高，且預(yù)后不良組血清LncRNA PCAT1 水平顯著高于預(yù)后良好組，說明LncRNA PCAT1 可能參與腫瘤的發(fā)生以及進(jìn)展，進(jìn)而在聲門上型喉癌的病情進(jìn)展過程中發(fā)揮作用。

本研究顯示血清LncRNA PCAT1 高表達(dá)是影響聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清LncRNA PCAT1 可能作為預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的有效指標(biāo)。本研究另繪制了ROC曲線，發(fā)現(xiàn)血清LncRNA PCAT1 預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的曲線下面積為0.899，截?cái)嘀禐?.601，敏感度為81.0%，特異性為98.0%，也進(jìn)一步表明血清LncRNA PCAT1 水平對聲門上型喉癌患者預(yù)后不良具有一定評估價(jià)值。

miRNA 是一類保守的非編碼RNA，廣泛參與機(jī)體細(xì)胞增殖、分化、生存和凋亡等調(diào)節(jié)過程，與腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有希望成為臨床上監(jiān)測病情和預(yù)后的標(biāo)志物[14，15]。miR-210 是一種研究廣泛的miRNA，定位于人染色體11p15.5，與多種腫瘤患者的病情有關(guān)[15]何丹等[16]研究指出，miR-210 能夠參與喉癌多藥耐藥的調(diào)控機(jī)制，其可通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)影響喉癌的多藥耐藥性。研究表明，LncRNAs 可通過miRNA 調(diào)控途徑在調(diào)節(jié)潛在活性和剪接事件中起著多種作用[11]。Hu 等[13]研究指出LncRNA PCAT-1 含有miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)，喉癌組織中miR-210-3p 與LncRNA PCAT1 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，LncRNA PCAT1/miR-210-3p 軸可能參與喉癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中，聲門上型喉癌患者血清miR-210 水平較對照組低，且預(yù)后不良組血清miR-210 水平顯著低于預(yù)后良好組，表明血清miR-210 作為重要的調(diào)控因子可能在聲門上型喉癌致病機(jī)制中承擔(dān)重要角色。本研究結(jié)果顯示，血清miR-210 低表達(dá)與聲門上型喉癌患者預(yù)后不良有關(guān)，且ROC 曲線結(jié)果顯示，血清miR-210 預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后的曲線下面積為0.764，評估預(yù)后有一定價(jià)值。另本研究聯(lián)合血清LncRNA PCAT1、miR-210 預(yù)測聲門上型喉癌患者預(yù)后不良的曲線下面積為0.925，敏感度為81.0%，特異性為99.0%，提示二者聯(lián)合檢測對聲門上型喉癌患者預(yù)后評估價(jià)值更高。推測LncRNA PCAT1、miR-210 可能通過影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程共同參與聲門上型喉癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，今后需補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，聲門上型喉癌患者血清LncRNA PCAT1 水平升高，血清miR-210 水平降低，均對評估聲門上型喉癌患者預(yù)后具有一定的價(jià)值，有望成為評估聲門上型喉癌患者預(yù)后的潛在參考指標(biāo)。但LncRNA PCAT1、miR-210 在聲門上型喉癌發(fā)生發(fā)展的作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，由于本研究的局限性，其具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。