鼻咽癌高癌家族中熱休克蛋白70 的表達(dá)及意義*

谷婷婷 陳舒華 張文章 陳艷瓊 劉湘 唐浩斌 農(nóng)應(yīng)全

中國是鼻咽癌高發(fā)區(qū)，根據(jù)國際癌癥研究所發(fā)布的全球鼻咽癌數(shù)據(jù)資料，發(fā)現(xiàn)中國鼻咽癌居全球鼻咽癌發(fā)病的高位，男性高于女性。南方省份多發(fā)，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。治療以放射治療為主，鼻咽癌治療失敗多因放化療抵抗、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。研究表明熱休克蛋白70（HSP70）與鼻咽癌的放化療抵抗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來，免疫治療是一大熱點(diǎn)，而熱休克蛋白是免疫和靶向治療的研究熱點(diǎn)，其中熱休克蛋白在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展及治療過程中機(jī)制的研究較多。本課題組前期利用雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）和質(zhì)譜分析方法，發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者>鼻咽癌高癌家系非癌成員>健康對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1]。

鼻咽癌的發(fā)病與EB 病毒感染、遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。但較少探討鼻咽癌的家族風(fēng)險(xiǎn)。鼻咽癌患者具有血緣關(guān)系的家族成員可能成為患癌的高危人群。然而，鼻咽癌家族成員的臨床研究意義尚不十分清楚。Coghill 等[2]在臺灣的一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)EBVgp350 是鼻咽癌高癌家系成員的保護(hù)因子，能降低其患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)，但gp350 抗體水平對普通人群的鼻咽癌患病率沒有明顯作用。Liu 等[3]對2010～2014 年進(jìn)行了大樣本基于人群的病例對照研究，發(fā)現(xiàn)具有一級鼻咽癌家族史（鼻咽癌病人的父母、兄弟姐妹、子女）的個(gè)體與無鼻咽癌家族史的個(gè)體相比，患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)高四倍以上，但患其他惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)無差異性，得出有鼻咽癌家族史的個(gè)體發(fā)生鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)要高得多。這些發(fā)現(xiàn)可以指導(dǎo)鼻咽癌高發(fā)人群早期檢測和臨床咨詢策略的制定。有鼻咽癌家族史的人群為患鼻咽癌的高危人群。本實(shí)驗(yàn)著重研究高癌家族史鼻咽癌患者的HSP70 蛋白的表達(dá)特征，探索HSP70 蛋白與鼻咽癌高癌家族成員患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性。

資料與方法

1 研究對象與取材

入組標(biāo)準(zhǔn)：鼻咽癌高癌家系是指患者直系親屬中有3 個(gè)以上成員確診患癌癥，其中2 個(gè)以上為鼻咽癌。設(shè)立鼻咽癌高癌家系癌患者組（高癌組）、散發(fā)鼻咽癌患者組（散發(fā)組），患者均經(jīng)病理診斷為確診未分化型非角化性鼻咽癌，并均未經(jīng)過放化療；健康對照組（正常組）為同期體檢中心健康人員。入組人員基本為佛山居民，均為在佛山市第一人民醫(yī)院頭頸放療科與佛山市第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科確診為鼻咽癌的患者，其中高癌組與散發(fā)組各為20例，正常組20 例，所有觀察者留取外周靜脈血標(biāo)本4ml 備用。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期婦女，年齡超過80 歲者，同時(shí)患有其他癌癥或有其他嚴(yán)重基礎(chǔ)病、多器官功能障礙患者，鼻咽癌復(fù)發(fā)患者。三組在年齡、性別、地域、標(biāo)本獲取時(shí)間等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2 方法

2.1主要試劑

RNA 提取試劑盒為QIAGEN 公司RNeasy mini kit74104 試劑盒。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo 公司RevertAid First strand CDNA synthesis kit#1622。real-time PCR 試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司DRR420A SYBR Premix Ex Taq。PCR 引物為奧科鼎盛生物科技有限公司合成。BCA 定量試劑盒為Solarbio。兔抗人HSP70 與兔抗人β-acin 均為Abcam 公司抗體二抗。為Thermo 公司生產(chǎn)的辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG。

2.2外周靜脈

血單個(gè)核細(xì)胞的制備：初治鼻咽癌患者入院第二天晨起用EDTA 抗凝管抽取外周血4ml，迅速顛倒混勻，防止血液凝固。4h 內(nèi)用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，-80°冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3Western blot 檢測HSP70 蛋白表達(dá)的水平

用RIPA 裂解液冰上裂解外周血單個(gè)核細(xì)胞30min 后，BCA 法檢測并計(jì)算總蛋白濃度，凝膠每孔上樣40μg 蛋白后于BIO-RAD 垂直電泳系統(tǒng)分離目的蛋白，BIO-RAD 半干轉(zhuǎn)膜儀電轉(zhuǎn)30min。以1∶3000 稀釋的HSP70 及1∶5000 稀釋的β-acin 抗體-4℃孵育過夜，以1∶5000 稀釋的HRP 標(biāo)記羊抗兔lgG（H+L）二抗結(jié)合一抗，ECL 發(fā)光液檢測蛋白相對表達(dá)量。

2.4RT-qPCR

在無菌通風(fēng)條件下按RNeasy mini kit74104 試劑盒說明書提取外周血單個(gè)核細(xì)胞中總RNA，置于冰上，美國Thermo fisher 公司的NanoDrop 2000/2000c 紫外可見分光光度計(jì)檢測總RNA。OD260/OD280 在1.9 到2.1 之間者為合格品。將不同樣品稀釋至相同濃度，取1μl 于電泳槽內(nèi)跑RNA 膠，RNA未降解樣品繼續(xù)用于逆轉(zhuǎn)錄。以500ng 總RNA 為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First strand CDNA synthesis kit#1622 說明書配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，采用隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞內(nèi)mRNA，使之成為cDNA。反轉(zhuǎn)錄完成后，用2μL cDNA 配制Real-time PCR體系，引物序列為F：TgACTgTgTTgTTTCggTTC；R：TggTTTCTCTTCTAAgCgAgg。按SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。參照說明書設(shè)置反應(yīng)條件，擴(kuò)增靶基因檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。Western blot 灰度分析時(shí)，為使不同凝膠電泳組的結(jié)果更具有可比性，統(tǒng)一將同組蛋白相對含量的最大值標(biāo)準(zhǔn)化為1，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)取=0.05，當(dāng)P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。首先用K-S 進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，Levene 方差齊性檢驗(yàn)，方差不齊，選擇基于方差不齊的Welch法,多重比較選擇基于方差不齊的Dunnett’s T3 法；方差齊，用ANOVA 法，多重比較選擇基于方差齊性的LSD 法。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

結(jié)果

1 HSP70 Real Time PCR 結(jié)果

HSP70 mRNA 在高癌組、散發(fā)組、正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞中的2-△△Ct分別為-14.071±2.408；-13.952±2.726；-13.905±1.601。差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.970）。（圖1）

圖1 患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中HSP70 mRNA 的相對定量表達(dá)

2 HSP70 蛋白在人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)

HSP70 蛋白在高癌組、散發(fā)組、正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)分別為0.648±0.292；0.490±0.314；0.395±0.165，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）。兩兩比較，高癌組與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）；散發(fā)組與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.552）；高癌組與散發(fā)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.285）。（圖2）

圖2 患者癌外周血單個(gè)核細(xì)胞中HSP70 蛋白的相對表達(dá)

圖3 外周血單個(gè)核細(xì)胞中高癌組、散發(fā)組與正常組蛋白水平變化

討論

我國南方是世界鼻咽癌高發(fā)地區(qū)，鼻咽癌發(fā)病部位隱匿，早期無明顯臨床癥狀，故臨床上容易被漏診。鼻咽癌（NPC）是一種高危頭頸癌，臨床晚期療效差，但早期療效良好，早期放化療5 年生存率可達(dá)70%以上。鼻咽癌局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因。HSP70 與放化療抵抗相關(guān)，Qi等[4]研究表明HSP 70 蛋白結(jié)合多模態(tài)MRI 可以準(zhǔn)確評價(jià)晚期宮頸癌患者的放射治療效果。HSP70 蛋白表達(dá)低表達(dá)的患者宮頸癌復(fù)發(fā)明顯減少，為宮頸癌的預(yù)防、診斷和預(yù)后評估提供了潛在的參考指標(biāo)。Wang 等[5]通過鼻咽癌數(shù)據(jù)庫比對，得出HSP70的甲基化可能與鼻咽癌預(yù)后差有關(guān)，可作為鼻咽癌預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。HSP70 蛋白的表達(dá)在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為鼻咽癌新的診斷或預(yù)后評估和候選治療靶點(diǎn)[6]。

Cai 等[7]通過免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，HSP70 在507 個(gè)鼻咽癌患者的腫瘤組織的細(xì)胞核、膜和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)不同。Kaplan-Meier 生存分析表明，不同的HSP70 表達(dá)模式也與患者預(yù)后相關(guān)。高膜性和細(xì)胞質(zhì)水平的HSP70 預(yù)測患者生存期良好。相比之下，HSP70 核豐度與低生存率相關(guān)，提出HSP70 的表達(dá)對鼻咽癌具有一定的預(yù)后預(yù)測價(jià)值，HSP70 不同的空間豐度可能暗示了其在鼻咽癌發(fā)展中的重要作用，為鼻咽癌免疫治療提供了思路。Feng 等[8]通過Kaplan-Meier 分析發(fā)現(xiàn)HSP10 和HSP70 陽性表達(dá)的鼻咽癌患者生存率顯著低于陰性表達(dá)患者，Cox回歸分析顯示HSP10 和HSP70 蛋白的陽性表達(dá)提示為鼻咽癌患者預(yù)后不良的因素。廖秋玲等[9]發(fā)現(xiàn)血清HSP70 含量在鼻咽癌組與正常對照組、鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HSP70 水平在不同TNM 分期中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,隨著TNM 分期的提高,其血清水平逐步提高，HSP70 的表達(dá)隨著鼻咽癌的發(fā)展逐漸增強(qiáng),可能反映鼻咽癌的進(jìn)展趨勢。動態(tài)檢測鼻咽癌患者血清HSP70 的水平,可作為鼻咽癌診斷的一個(gè)重要指標(biāo),有一定的臨床價(jià)值。

遺傳因素方面，Xu 等[10]發(fā)現(xiàn)在鼻咽癌患者，婚姻狀況對生存結(jié)果的影響中，只有非西班牙裔、白人和華裔鼻咽癌患者才能從已婚狀態(tài)中獲得生存利益。單身和喪偶患者被視為高危人群。Mokni-Baizig 等[11]調(diào)查了突尼斯人鼻咽癌患者及其家屬的人類白細(xì)胞抗原（HLA）譜，以及健康的突尼斯人的樣本，以確定與家族性鼻咽癌相關(guān)的特異性HLA；發(fā)現(xiàn)HLA-A*26 可能是一個(gè)誘導(dǎo)指標(biāo)，其等位基因頻率在鼻咽癌患者中明顯高于對照組（P=0.003）和鼻咽癌患者中的高危家庭成員（P=0.067）。多因素Logistic 回歸分析顯示HLA-A*26 和HLA-A*30 相互關(guān)聯(lián)，對鼻咽癌的危險(xiǎn)性有重要影響，從而得出HLA-A*26-A*30 可能是突尼斯高危家族鼻咽癌篩查的預(yù)測指標(biāo)的結(jié)論。陳舒華等[12]發(fā)現(xiàn)CAPZA1 低表達(dá)可能是高癌家系鼻咽癌高發(fā)的之一，外周血單核細(xì)胞CAPZA1 也行可作為鼻咽癌的其中一個(gè)生物標(biāo)志物。感染Epstein-Barr 病毒（EBV）的個(gè)體容易發(fā)生鼻咽癌。Liu 等[13]研究了來自臺灣的480 個(gè)NPC 患者和1291 個(gè)NPC 患者的兄弟姐妹，從調(diào)查問卷中得出了家庭內(nèi)出生順序的信息；運(yùn)用Logistic回歸模型研究了出生順序與NPC 之間的關(guān)系，觀察到，對于高發(fā)NPC 家族，年長的兄弟姐妹具有更大的患病風(fēng)險(xiǎn)。鼻咽癌的流行病學(xué)研究已經(jīng)比較深入，但有鼻咽癌家族史患者的蛋白質(zhì)方面的研究尚在起步階段。

高危家族遺傳學(xué)研究相對偏少，而遺傳易感因素是鼻咽癌發(fā)病的內(nèi)在基礎(chǔ)，通過研究遺傳相關(guān)基因，對高危人群進(jìn)行相關(guān)基因的修飾也許能改善高癌家族人群的患病風(fēng)險(xiǎn)。因此，本課題組致力于研究高癌家族人群中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。本課題組前期利用雙向凝膠電泳技術(shù)（2-DE）和質(zhì)譜分析方法，發(fā)現(xiàn)HSP70 表達(dá)在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者>鼻咽癌高癌家系成員>健康對照組, 差異有顯著性；并且發(fā)現(xiàn)鼻咽癌高癌家系氣虛體質(zhì)鼻咽癌患者組和濕熱體質(zhì)鼻咽癌患者鼻咽病灶組織存在不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，篩選鑒定了HSP70 等5 個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)[14]。而本實(shí)驗(yàn)主要研究了HSP70 在鼻咽癌高癌家系鼻咽癌患者中的表達(dá)特性，通過WB 及PCR 發(fā)現(xiàn)HSP70 蛋白在高癌組、散發(fā)組、正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞中的蛋白表達(dá)分別為0.648±0.292；0.490±0.314；0.395±0.165，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007）。兩兩比較，高癌組與正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）；HSP70mRNA 在高癌組、散發(fā)組、正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；結(jié)果提示HSP70 的表達(dá)可能主要影響中心法則中轉(zhuǎn)錄后修飾的過程，而這一過程可以做為后期靶向治療的研究方向，為鼻咽癌的治療靶標(biāo)選擇提供一定的參考。鼻咽癌相關(guān)的標(biāo)志物研究不斷進(jìn)入我們的視野，EB 病毒檢測是我國鼻咽癌篩查的主要方法，哪種標(biāo)志物能夠協(xié)同或者超越EB 病毒檢測，成為鼻咽癌的早期檢測標(biāo)志物，尚需要時(shí)間開展深入研究，希望我們的研究能為鼻咽癌未來的診斷及治療方面提供一定的參考。