西伯利亞杏遺傳育種研究進(jìn)展

張勝利 張亞力 白玉娥 代金玲

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010019；2. 呼和浩特回民區(qū)倘不浪小學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010010）

西伯利亞杏（Armeniaca sibirica）又名山杏，薔薇科，李亞科，杏屬，灌木或小喬木，主要分布于俄羅斯遠(yuǎn)東和西伯利亞、蒙古東部和東南部，我國內(nèi)蒙古、黑龍江、吉林、遼寧、河北、甘肅、山西等地。山杏耐寒抗旱，可作為木本生物柴油原料，果實(shí)可食用，種仁富含杏仁油、杏仁苷及多種微量元素。國內(nèi)外學(xué)者圍繞西伯利亞杏開展了大量的生理生化、生態(tài)、遺傳基礎(chǔ)研究，在此將近年來西伯利亞杏的遺傳變異、轉(zhuǎn)錄組、基因組和功能基因研究、育種技術(shù)開發(fā)等進(jìn)行綜述，為遺傳育種研究相關(guān)工作提供參考。

1 種質(zhì)資源與遺傳多樣性研究

通過表型變異研究遺傳多樣性，方法簡便、成本低廉。山杏表型性狀變異豐富（表1），針對這些質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀開展了性狀變異系數(shù)計(jì)算、多性狀相關(guān)分析、主成分分析、聚類分析等[1?5]方面的研究工作。王少雄等[6]研究了多個種源種實(shí)性狀變異，出仁率與緯度、海拔、光照、溫度等地理生態(tài)因子的相關(guān)性。董勝君等[7]測定了74個無性系的15個產(chǎn)量性狀，找出影響產(chǎn)量的主導(dǎo)因子，并提出了產(chǎn)量的預(yù)測模型。Yin等[8]對內(nèi)蒙古種源杏仁的營養(yǎng)價值、氨基酸種類等進(jìn)行調(diào)查，篩選出適宜開發(fā)仁用杏品種的萬家溝種源和和林格爾種源。這些研究為掌握山杏種源地理變異規(guī)律，優(yōu)良種源和優(yōu)株選擇提供了工作基礎(chǔ)。

表1 山杏變異性狀表Table 1 Variation characters of A. sibirica

與表型變異相比，DNA分子標(biāo)記種類多而且直接表現(xiàn)DNA水平的差異，不受環(huán)境影響，用于遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)、指紋圖譜研究等方面。金玲等[9]完成山杏選優(yōu)無性系的SSR指紋圖；包文泉等[1]應(yīng)用SSR技術(shù)研究得出，內(nèi)蒙古西伯利亞杏群體內(nèi)遺傳變異高達(dá)92%，群體間存在中等遺傳分化，推測自然地理隔離和近期人類活動引起山杏生境的片段化。劉碩等[10]利用SSR標(biāo)記研究華北和東北地區(qū)西伯利亞杏野生居群遺傳變異和多樣性較中亞普通杏野生居群豐富，而西北居群呈現(xiàn)孤立結(jié)構(gòu)。Wang等[11]聯(lián)合cpDNA、cpSSR以及nSSR數(shù)據(jù)研究北方山杏譜系地理，將其明確劃分為東部組和西部組，提出導(dǎo)致遺傳分化的因素除了地理隔離還有氣候差異，主要是年降雨量和年均溫，并首次闡釋了由于末次盛冰期的影響，山杏分布區(qū)壓縮分布于東部的錦州地區(qū)和西部的燕山山脈。我國山杏群體遺傳多樣性豐富，主要遺傳變異存在于群體內(nèi)，群體間差異小，在種質(zhì)資源收集中應(yīng)注重多樣性豐富地區(qū)群體的選擇，同時采樣時也要保證群體內(nèi)差異單株的數(shù)量。

2 育種技術(shù)與良種繁育研究

2.1 常規(guī)育種技術(shù)

西伯利亞杏多半野生、野生，由于自交不親和和引種使種內(nèi)產(chǎn)生豐富的變異類型，選擇育種成為山杏的主要育種方式。遼梅（Armeniaca sibiricavar.pleniflora）現(xiàn)為珍稀重瓣杏花資源，即西伯利亞杏自然變異類型。棗莊市果樹科學(xué)研究所2006年從國家杏李資源圃（遼寧省熊岳）引種遼梅，通過試驗(yàn)確定了最佳砧木以及配套栽培技術(shù)。2011—2012年間沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)山杏課題組從俄羅斯外貝加爾邊疆區(qū)引入種子和接穗，在遼西喀左縣進(jìn)行引種試驗(yàn)，秦琳[12]計(jì)算相關(guān)遺傳參數(shù)評價了引種家系和無性系的適應(yīng)性。

尹健等[13]在內(nèi)蒙古扎蘭屯調(diào)查發(fā)現(xiàn)雙雌蕊、重瓣花、紅色花絲、粉色花藥等變異，并初選晚花、耐瘠薄、豐產(chǎn)等西伯利亞杏優(yōu)良類型。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合北票市林木良繁中心選育出山杏12個豐產(chǎn)無性系、4個晚花無性系和4個抗凍無性系。尹明宇[14]選出優(yōu)良山杏種源敖漢旗、涼城、和林格爾縣3個，從產(chǎn)仁量、出仁率、粗脂肪角度篩選優(yōu)良家系，現(xiàn)實(shí)增益分別為34.86%、18.54%和2.97%。并從杏仁氨基酸和脂肪酸評選優(yōu)株，現(xiàn)實(shí)增益達(dá)到146%（高苦杏仁苷型優(yōu)良單株）～199%（高產(chǎn)型優(yōu)良單株），同時篩選抗晚霜優(yōu)株。張欣[15]檢測到16個SSR位點(diǎn)與山杏單株果質(zhì)量、單果質(zhì)量和單仁質(zhì)量等經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)，金玲[16]在此基礎(chǔ)上利用實(shí)時熒光定量PCR研究了主要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)基因在山杏果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)規(guī)律，這些研究開辟了西伯利亞杏分子標(biāo)記輔助育種的新途徑。大扁杏（Prunus armeniaca×sibirica）為人工選育出天然雜交種，是西伯利亞杏與普通杏的自然雜交后代，現(xiàn)為我國三北地區(qū)特有經(jīng)濟(jì)樹種。

雌蕊發(fā)育及花粉特性直接影響座果和雜交效率，開展相關(guān)研究對山杏雜交育種工作尤為重要。劉夢培[17]證實(shí)了山杏自交不親和特性，用薔薇科篩選和自行設(shè)計(jì)的9對S?RNase和SFB基因型鑒定引物確定了我國 90份仁用杏主栽品種或優(yōu)株的 S基因型，構(gòu)建了仁用杏雜交組合數(shù)據(jù)庫。劉明國等[18]研究山杏無性系花粉超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)花粉半不育、高度不育以及完全不育類型。這些研究為解決西伯利亞杏雌蕊敗育、提高座果以及雜交親本植株選配等提供了重要參數(shù)和理論借鑒。

2.2 良種繁育

近年來山杏育種工作取得重要進(jìn)展。河北平泉、赤峰、陜西榆林建設(shè)大面積山杏林產(chǎn)業(yè)基地?？ψ笫占叫臃N質(zhì)資源695份，建成山杏國家林木種質(zhì)資源庫。沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)選育出“山杏1號2號3號”和“甜豐”新品種。內(nèi)蒙古林木良繁中心收集了內(nèi)蒙古山杏種源12個種源600個優(yōu)良家系，國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心從中選育出高產(chǎn)抗逆食藥兩用品種“山杏家系1號”，內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)白玉娥團(tuán)隊(duì)選育出“蒙杏1號”“蒙杏2號”“蒙杏3號”，已通過內(nèi)蒙古林木品種審定委員會審定。西北農(nóng)林科技大學(xué)培育出嫁接的山杏品種“山苦2號”—山杏優(yōu)株接穗，普通杏砧木[19]。這一系列山杏品種的選育和推廣，充分發(fā)揮了西伯利亞杏的生態(tài)經(jīng)濟(jì)價值，同時也豐富了山杏的育種資源。

山杏良種以有性繁殖為主，主要是天然林、母樹林采種，播種育苗為主，亦有嫁接和根蘗育苗方式。山杏種子園鮮有報(bào)道，北票市林木良繁中心建設(shè)了山杏種質(zhì)資源圃、采穗圃和良種園，為初級種子園。萬冬梅[20]研究了粉花山杏的嫁接技術(shù)和組織培養(yǎng)體系。何炎紅等[21]建立了山杏體胚再生體系。這些探索了山杏良種的快繁技術(shù)。

3 分子生物學(xué)研究

3.1 基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

近年山杏基因組、轉(zhuǎn)錄組研究取得重要進(jìn)展。張俊環(huán)等[22]測定綠萼山杏基因組大小(273.66±4.334) Mb。Dong等[23]對山杏轉(zhuǎn)錄組測序，獲得1 243 067個高質(zhì)量序列讀取片段，單基因簇46940個，鑒定191個單基因簇參與脂肪酸代謝和生物合成，設(shè)計(jì)了9930個SSR引物對，并驗(yàn)證其有效性。Bao等[24]以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，開發(fā)72條SNP標(biāo)記，采用SNaPshot技術(shù)對70個山杏單株進(jìn)行基因分型。Niu等[25]探討了西伯利亞杏RT?qPCR內(nèi)參基因選擇，從11個候選基因中選出了3個適宜內(nèi)參基因：ACT（actins）、UBC（ubiquitin-conjugating Enzyme）和CYP（cyclophilin）。CAT（Cationic amino acid transporters）參與植物體內(nèi)氨基酸的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，劉力力等[26]分析6個CAT基因家族成員的生物信息，檢測PsCAT在果實(shí)不同發(fā)育期的動態(tài)表達(dá)水平。Niu等[27]鑒定了山杏14個PsARF基因，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序等信息，同時研究了ARF基因家族各成員在中果皮和果核發(fā)育不同發(fā)育階段的時空表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究山杏ARF家族的基因功能奠定了基礎(chǔ)。

3.2 開花調(diào)控基因

西伯利亞杏花期易受倒春寒影響，進(jìn)而影響產(chǎn)量。因此晚花變異類型的品種篩選和晚花機(jī)理、差異表達(dá)基因研究成為熱點(diǎn)。Wang等[28]鑒定了山杏早花和晚花類型差異表達(dá)基因1204個，GO分析顯示在代謝過程富集，KEGG富集分析注釋156個基因，在75條途徑有富集。正常開花山杏轉(zhuǎn)錄組中赤霉素生物合成基因、ABA下降相關(guān)基因表達(dá)均上調(diào)，生物鐘相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，開花關(guān)鍵基因的豐度差異不明顯。陳晨等[29]對山杏萌動期和盛花期花芽的轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出顯著差異表達(dá)基因6850個，KEGG富集分析顯示差異基因在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝途徑富集。特異表達(dá)基因738個，發(fā)現(xiàn)39個顯著差異表達(dá)基因涉及春化、光周期等植物開花調(diào)控相關(guān)途徑。已有研究顯示MADS-box基因調(diào)控植物開花的時間、控制花器官的形成和發(fā)育的作用明顯，陳晨等[30]對西伯利亞杏MADS-box基因進(jìn)行鑒定，分析基因結(jié)構(gòu)、染色體分布、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)模式等。這些為西伯利亞杏開花調(diào)控、花器官發(fā)育的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

3.3 油脂積累相關(guān)基因

西伯利亞杏種仁含油量高，且燃油特性符合生物柴油標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于其種仁發(fā)育過程中油脂積累的相關(guān)基因鑒定和功能研究較多。Mai等[31]分析了不同種質(zhì)山杏杏仁發(fā)育關(guān)鍵時期的含油量、脂肪酸成分等，初步了解種仁發(fā)育過程中脂類積累機(jī)制。Huo等[32]研究外源ABA使參與ABA化學(xué)途徑的關(guān)鍵基因表達(dá)量顯著上調(diào)，進(jìn)而影響脂肪酸生物合成和積累。

Deng等[33]提出山杏WRI1（PsWRI1）表達(dá)水平與油脂積累速率密切相關(guān)，推測PsWRI1可能通過調(diào)控碳進(jìn)入脂肪酸合成途徑, 尤其是油酸積累，從而調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄。鄧舒雅等[34]對山杏長鏈?；o酶A合成酶（LACS）基因進(jìn)行蛋白組成分析、進(jìn)化樹分析、保守域鑒定分析以及蛋白互作分析，同時對油脂累積速率與6個LACS基因表達(dá)做相關(guān)性分析，研究山杏LACS基因家族表達(dá)和功能。

microRNA（miRNA）能夠?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，Niu等[35]對核仁發(fā)育不同時期sRNA（small RNA）測序和miRNA轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)44個新的miRNA，其中6個對核仁發(fā)育有明確響應(yīng)，耦合mRNA、miRNA 轉(zhuǎn)錄組以及qRT?PCR檢測，鑒定出一批重要miRNAs及其靶基因（miR156?SPL、miR160?ARF18、miR164?NAC1、miR171h?SCL6、miR172?AP2、miR395?AUX22B、miR530?P2C37、miR393h?TIR1/AFB2和psi-miRn5?SnRK2A），推測參與發(fā)育和激素信號傳導(dǎo)。這些油脂積累相關(guān)基因表達(dá)和調(diào)控的研究為了解西伯利亞杏核仁發(fā)育、油脂積累過程、選育優(yōu)良生物柴油品種提供了工作基礎(chǔ)。

4 展望

綜合以上近年來學(xué)者對與西伯利亞杏的遺傳基礎(chǔ)和育種技術(shù)研究可見：山杏種質(zhì)資源研究較多。但資源收集的不夠系統(tǒng)，少有全面系統(tǒng)的資源收集調(diào)查，即是由于相關(guān)研究的局限性，也是由于很多地區(qū)有性起源的山杏灌木林與譜系不清的人工林混雜，為資源收集帶來困難。因此，目前首要是根據(jù)現(xiàn)有研究成果，確定種質(zhì)資源的重點(diǎn)保護(hù)區(qū)，積極收集，保護(hù)野生資源，可以考慮在多點(diǎn)建立多個種質(zhì)資源庫，基因庫也不宜過大，強(qiáng)調(diào)不同地區(qū)根據(jù)資源豐富度建立適宜大小的種質(zhì)資源庫，要保證基因庫建設(shè)的質(zhì)量，以及后期運(yùn)營管理的技術(shù)支撐。另一問題也是考慮如何整合現(xiàn)有遺傳多樣性研究成果，減少重復(fù)研究，深入開展創(chuàng)新工作。

常規(guī)育種技術(shù)仍然是主要育種手段，更廣泛地開展山杏育種工作。山杏天然群體變異豐富，選擇育種簡便高效，配合開展雜交育種，根據(jù)生產(chǎn)需求定向選育晚花型、甜仁型、抗凍型、觀賞型、豐產(chǎn)型等新品種。如山杏資源中的綠萼類型、重瓣類型和菊花等變異類型就具有很高的觀賞價值，育種目標(biāo)多樣化能夠更充分實(shí)現(xiàn)山杏良種的生態(tài)、社會和經(jīng)濟(jì)價值。加快遺傳理論研究的基礎(chǔ)上，深入開展山杏分子育種研究。

山杏遺傳基礎(chǔ)研究還很薄弱，應(yīng)在基因組和轉(zhuǎn)錄組測序迅速開展的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享，廣泛開展基因功能分析、表達(dá)調(diào)控分析，從轉(zhuǎn)錄組水平篩選更多的功能基因和關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，構(gòu)建山杏基因時空表達(dá)信息共享平臺。結(jié)合現(xiàn)實(shí)育種目標(biāo)，開展分子輔助育種研究，實(shí)現(xiàn)遺傳理論和育種實(shí)踐的統(tǒng)一，利用品種收益促進(jìn)基礎(chǔ)研究，實(shí)現(xiàn)育種工作的良性循環(huán)。作為生物柴油屬性的相關(guān)研究逐漸增多，杏仁油脂積累相關(guān)基因研究目前已經(jīng)開展，己知miRNA的數(shù)量和功能分析方面滯后，而且核仁發(fā)育是受到多因素共同調(diào)控，含油量、氨基酸含量等性狀為數(shù)量性狀，由微效多基因控制，其生理過程和關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控尚不明晰，可參考作物育種工作開展QTL定位和全基因組關(guān)聯(lián)分析。目前基因結(jié)構(gòu)、功能的理論研究與生產(chǎn)實(shí)踐還有距離，應(yīng)更多發(fā)掘經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)基因或位點(diǎn)，篩選主要貢獻(xiàn)基因，與分子輔助育種實(shí)踐加強(qiáng)聯(lián)系。

加速良種繁殖技術(shù)的研究。在資源收集、保護(hù)的同時，積極建立母樹林，可解決短期內(nèi)生產(chǎn)用種問題，在母樹林基礎(chǔ)上改建種子園，提高種子遺傳品質(zhì)。并系統(tǒng)地開展遺傳測定，為營建高世代種子園提供基礎(chǔ)材料和基本信息。建設(shè)采穗圃和苗圃，提供嫁接、扦插用苗木以及種子園建園材料。山杏組織培養(yǎng)尚未應(yīng)用于實(shí)踐，應(yīng)加強(qiáng)提高組培苗生根率研究，實(shí)現(xiàn)苗木工廠化生產(chǎn)。