滇黃精多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

肖坤敏 馬佳鈺 王軍民 畢雪瓊 劉 艷 華 燕

（西南林業(yè)大學林學院，云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650233）

滇黃精（Polygonatum kingianum），百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物，主產(chǎn)于云南、四川和貴州等地區(qū)[1]。滇黃精以根莖入藥，名為黃精，具有補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎的功效[2]。滇黃精富含多糖、甾體皂苷、黃酮、生物堿、氨基酸和微量元素等活性成分[3]，其多糖作為主要活性成分，主要由中性糖和酸性糖組成[4]，具有增強免疫能力[4]、抗腫瘤[5]、抗衰老[6]、抗糖尿病[7?8]及抗炎[9]等藥理作用，可廣泛應用于新型藥物、功能性食品、化妝品和保健品中。

近年來，黃精多糖提取的方式多以熱水提取法[10]為主，微波提取、超聲提取和酶提取等輔助提取方法次之[11?13]，各提取方法提取效率不同，都存在各自優(yōu)勢和劣勢。與熱水提取法相比，超聲輔助提取法受限于設備條件，目前不能應用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)；微波輔助提取法料液比較大，后續(xù)處理程序繁瑣；酶提取法用于大規(guī)模生產(chǎn)時酶用量較大，出現(xiàn)將滅活的酶徹底清除的問題難以解決。并且黃精多糖復雜的結(jié)構(gòu)和廣泛的生物活性成為眾多科研工作者研究的熱點，但對滇黃精多糖純化前后抗氧化活性的研究較少。因此，本研究主要采用傳統(tǒng)的熱水提取法對滇黃精中的多糖進行提取，采用響應面試驗設計，優(yōu)化提取參數(shù)，獲得最佳的提取工藝，并對提取的粗多糖進行純化，開展純化前后抗氧化（ABTS+·自由基清除能力）活性研究。此方法操作簡單，安全環(huán)保，對提取設備要求不高，可應用于工業(yè)生產(chǎn)，為滇黃精資源開發(fā)利用和工業(yè)生產(chǎn)提供科學參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備

Evolution 300 紫外分光光度計（Thermo Fisher，美國）；DHG?9030A 型不銹鋼高溫干燥箱（河南馬弗爐技術(shù)開發(fā)有限公司，中國）；Heidolph Digital 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph Group，德 國）；BK?300GDE 超聲波清洗器（陜西凱德力環(huán)?？萍加邢薰?，中國）；DEAE纖維素（上海金穗，中國）；半透膜（上海生工，中國）；無水乙醇（上海源葉生物科技有限公司，中國）等。滇黃精采自云南省石屏縣龍鵬鎮(zhèn)，由昆明植物所紀運恒研究員鑒定為百合科植物滇黃精。

1.2 實驗方法

1.2.1 滇黃精的預處理

將新鮮滇黃精根莖去除表面泥土，洗凈，切片，自然風干，70 ℃干燥箱恒溫烘干，粉碎，過80目過篩備用。

1.2.2 滇黃精多糖的提取

精確稱取干燥滇黃精粉末1.003 g于150 mL錐形瓶中，加蒸餾水置于水浴鍋中水煎提取，待水浴完成，過濾，用蒸餾水洗滌，將全部濾液放入100 mL容量瓶，定容，得滇黃精多糖提取液，備用。

1.2.3 多糖含量的測定

采用苯酚?硫酸法[14]，對滇黃精多糖進行測定。精確稱取在95 ℃下烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖2.500 g，用蒸餾水溶解，定容于500 mL量瓶中，取2 mL至100 mL容量瓶，定容，即得濃度為100 μg/mL葡萄糖標準溶液。分別移取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL葡萄糖標準溶液于10 mL試管中，用蒸餾水補至2 mL，加入1 mL 5% 苯酚，再加入5 mL 98% 濃硫酸，立即振蕩搖勻，靜置30 min。以2 mL的蒸餾水做空白組，在波長490 nm條件下測定各個試管內(nèi)溶液的紫外吸光度，每組3個平行。以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A＝0.0153x?0.0149（R2=0.9995），在此濃度范圍內(nèi)（15～90 μg/mL）葡萄糖溶液濃度與吸光值呈良好的線性關(guān)系。

準確取滇黃精多糖定容后提取液1.0 mL，于100 mL容量瓶用蒸餾水定容，搖勻，按照繪制標準曲線下操作測定其在490 nm 處的吸光值，根據(jù)回歸方程計算滇黃精多糖提取率，其計算公式為（1）。

式中：C為提取液中多糖的濃度；V為多糖提取液的總體積；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品粉末質(zhì)量。

1.2.4 單因素實驗

取干燥滇黃精粉末1 g于錐形瓶中進行各組單因素試驗。1）料液比。固定提取時間1.5 h、提取溫度70 ℃，料液比分別取1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL進行5組實驗，每組3次平行試驗。2）提取時間。固定料液比最優(yōu)的、提取溫度70 ℃，提取時間分別取0.5、1、1.5、2、2.5 h進行5組實驗，每組3次平行試驗。3）提取溫度。固定料液比最優(yōu)、提取時間最優(yōu)，提取溫度分別取50、60、70、80、90 ℃進行5組實驗，每組3次平行實驗。

1.2.5 響應面實驗

在單因素試驗結(jié)果基礎上，選取對滇黃精多糖提取效果影響較大的因素料液比、時間、溫度為自變量，記為X1、X2、X3，以多糖提取率（Y）為響應值，根據(jù)響應面 Box?Behnken 中心組合試驗設計原理，進行3因素3水平優(yōu)化試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面因素與水平Table 1 Response surface factors and levels

1.2.6 滇黃精多糖的純化

參照文獻[15]方法，對滇黃精多糖純化，操作流程如圖1所示。將用最優(yōu)條件提取滇黃精多糖提取液濃縮，回收至15 mL體積，冷卻至室溫，加入95%的乙醇至乙醇分數(shù)為65 %，進行醇沉，加入后有紊狀飄浮物出現(xiàn)，撈出，無水乙醇清洗。其余母液靜置24 h后過濾，沉淀用無水乙醇反復沖洗，合并2次所得沉淀，溶解加入Sevage試劑（氯仿，正丁醇體積比4∶1）按4∶1體積比混合，強烈震蕩30 min，用3000 r/min離心15 min，直至分層后棄去中間的蛋白質(zhì)層和下層的Sevage溶液，上層多糖溶液繼續(xù)加入Sevage試劑重復4次，直至不再出現(xiàn)蛋白層為止。合并多次的粗多糖溶液，減壓濃縮成干燥粉末，得滇黃精粗多糖，記為PKP。

圖1 滇黃精多糖純化流程圖Fig. 1 Purification flow of polysaccharides from P. kingianum

將DEAE纖維素裝入規(guī)格為3 cm × 50 cm的層析柱中，用蒸餾水沖洗多次，過夜平衡。用去離子水將脫蛋白粗多糖溶解，以粗多糖濃度為10 mg/mL上樣體積20 mL，分別用去離子水和0.5 mol/L NaCl進行洗脫，以洗脫速度2 mL/min沖洗，100 mL收集1瓶，用紫外監(jiān)測多糖含量，合并含量較高的部分，最后得到水洗脫部分（中性多糖）和鹽洗脫部分（酸性多糖）。鹽沖洗部分用去離子水透析至無鹽檢出。記為PKP?水和PKP?鹽，用于抗氧化測定。

1.2.7 滇黃精多糖抗氧化活性測定

參考文獻[16]方法，準確吸取PKP、PKP?水和PKP?鹽配制成相應質(zhì)量濃度的待測液2 mL，然后加入2 mL預先已經(jīng)混合好的ABTS反應試劑，混合均勻，避光室溫下反應5～6 min，在波長734 nm處測定各組分樣品的吸光度值（A1）。用無水乙醇2 mL代替ABTS反應劑，步驟同上，于波長734 nm處測得各組分樣品本身吸光度值（A2）。以2 mL無水乙醇與2 mL ABTS反應劑充分混合，重復同上步驟，測其在734 nm波長處的吸光度值（A0）。以同等體積蒸餾水作為參比液調(diào)零。以Vc作對照，每個分析樣品重復3次，取平均值。按公式（2）計算清除率。

1.3 分析方法

單因素試驗結(jié)果利用SPSS 20.0應用軟件，進行單因素方差分析，響應面試驗應用 Design Expert 8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同料液比對滇黃精多糖提取率的影響

由圖2 可知，料液比對滇黃精多糖提取率存在極顯著差異（P<0.01）。滇黃精多糖提取率隨料液比增加而先顯著增加后趨于平緩，可能是溶劑量過多會形成稀釋效應，當多糖全部溶出，再增加溶劑也不會繼續(xù)溶出多糖，提取率先增加后趨于平緩，并且可能會溶出一些水溶性雜質(zhì)，影響多糖純度，提取率增加趨勢平緩。由于溶劑少時，多糖溶液粘稠不易操作，綜合考慮，料液比選擇 1∶50（g/mL）為宜，此時提取率為19.35%。

圖2 不同料液比對滇黃精多糖提取率的影響Fig. 2 Effects of different solid-liquid ratios on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.1.2 不同提取時間對滇黃精多糖提取率的影響

由圖3可知，滇黃精多糖提取率受提取時間因素影響（P<0.05）。多糖提取率隨提取時間先增加后降低，在提取時間為1.5 h時，多糖提取率達到最大，隨后多糖提取率降低，但差異不顯著。其原因可能是多糖在溶液中長時間處于高溫環(huán)境，多糖的糖苷鍵遭到破壞，產(chǎn)生5?羥甲基糠醛，使多糖提取率降低[17]。因此，選擇提取時間為1.5 h，此條件多糖提取率為19.73%。

圖3 不同提取時間對滇黃精多糖提取率的影響Fig. 3 Effects of different extraction time on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.1.3 不同提取溫度比對滇黃精多糖提取率的影響

由圖4 可知，提取溫度對滇黃精多糖提取率影響具有極顯著差異（P<0.01）且影響較大。溫度為50～80 ℃時，多糖提取率隨溫度的升高而增加，在提取溫度為80 ℃時，提取率高達18.73%?？赡苁且驗闇囟鹊纳哂欣诜肿訜徇\動加速[18]，從而提高多糖提取率，而溫度超過80 ℃時，溫度過高，多糖分子熱不穩(wěn)定，遭到破化，導致提取率降低[19]。因此，最佳提取溫度選擇為80 ℃。

圖4 不同提取溫度對滇黃精多糖提取率的影響Fig. 4 Effects of different extraction temperatures on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.2 響應面試驗優(yōu)化結(jié)果

以滇黃精多糖提取率作為響應值（Y），根據(jù)響應面法中的 Box?Behnken 實驗原理運用 Design Expert 8.0.6進行設計，響應面分析方案及實驗結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

對響應面優(yōu)化試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)擬合分析，得到擬合全變量二次回歸方程Y=?152.94349+0.62093X1+28.63261X2+3.48021X3?0.12444X1X2?0.00362198X1X3?0.18028X2X3?0.00266818X12?4.41070X22?0.018612X32。

對回歸模型方差分析及模型系數(shù)進行檢驗，結(jié)果表明該模型的P<0.01，達到極顯著水平，說明模型具有顯著性。失擬值P>0.05，表明失擬項不顯著，說明回歸方程擬合程度較好，可以利用該模型對滇黃精中多糖提取進行分析和預測。R2＝0.9659，＝0.9220，證明模型實際值與預測值之間相關(guān)性好；變異系數(shù)值（3.6%）較低，表明了非常高的精度和實驗值的良好可靠性。另外，模型中的1次項X1、X2，二次項X12、X22、X32和交互項X1X2、X1X3、X2X3的P值均<0.05，表明該試驗滇黃精多糖的提取率受料液比和提取溫度2個因素以及兩兩因素間的交互作用大的影響。由F值可知，各因素影響滇黃精多糖提取率的貢獻大小為X3>X1>X2。

為了直觀反應兩兩因素交互作用影響響應值變化強度，通過回歸方程繪制響應面及其等高線圖。結(jié)果如圖5～7所示。

圖5 料液比與提取時間對滇黃精多糖提取率影響的響應面和等高線Fig. 5 Response surface(a) and contour(b) of the effect of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

響應面坡度和等高線密集程度可直觀反應因素間交互作用對響應值影響程度的強弱[20]。響應面坡度越陡峭，說明交互作用對響應值的影響越大；等高線越密集呈橢圓形，因素間交互作用對響應值的影響越大，反之亦然[20]。由圖5可知，X1與X2交互作用等高線圖呈橢圓形，且響應面圖坡度較陡，表明這兩因素間交互作用對多糖提取率的影響極顯著（P<0.01）；由圖6可知，X1與X3交互作用等高線圖似圓形，這兩因素對多糖提取率影響顯著（P<0.05）。由圖7可知，X2與X3之間相互作用的響應面圖坡度陡峭，等高線圖橢圓形分布較密集，說明X2和X3兩兩交互作用對滇黃精多糖提取率影響顯著（P< 0.05）。綜合分析，兩兩交互作用影響大小為X1X2>X2X3>X1X3。

圖6 料液比與提取溫度對滇黃精多糖提取率影響的響應面和等高線Fig. 6 Response surface(c) and contour(d) of the effect of solid-liquid ratio and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

圖7 提取時間與提取溫度對滇黃精多糖提取率影響的響應面和等高線Fig. 7 Response surface(e) and contour(f) of the extraction time and extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides from P. kingianum

2.3 滇黃精多糖純化結(jié)果

通過采用Sevage試劑脫蛋白法和 DEAE纖維素離子交換樹脂對提取物進行初步純化，分別得到PKP、PKP?水和PKP?鹽3種類型的多糖；純度結(jié)果如圖8所示；純化后中性多糖純度是水粗提物中總多糖純度的 2.14倍，表明該方法有效可行，適于滇黃精多糖的純化。

圖8 滇黃精水提粗物、PKP、PKP?水和PKP?鹽的純度Fig. 8 The purity of crude polysaccharides extracted by water, PKP, PKP-water and PKP-salt

2.4 滇黃精多糖體外抗氧化結(jié)果

由圖9可知，PKP、PKP?水、PKP?鹽和VC都具有清除ABTS+·自由基的能力，在一定濃度范圍內(nèi)，ABTS+·自由基清除能力隨多糖濃度的增加而提升，與樣品濃度呈一定的量效關(guān)系。當濃度增加到 8 μg/mL后，VC上升的趨勢減緩。經(jīng)SPSS 20.0軟件線性擬合，其清除 ABTS+·自由基的 SC50值分別為2.442 、0.825 、0.444 mg/mL，三者與 VC的清除能力排序為VC>PKP?鹽>PKP?水>PKP表明滇黃精粗多糖粗提物和純化后精制多糖具有一定的清除能力，但它的作用效果整體還是弱于VC（SC50=1.984 μg/mL）。

圖9 PKP、PKP?水和PKP?鹽和Vc的ABTS+·自由基清除效果Fig. 9 ABTS+· scavenging effect of PKP, PKP-water, PKP-salt and Vc

3 結(jié)論與討論

在單因素實驗基礎上，通過Box?Behnken響應面實驗優(yōu)化了滇黃精多精的提取工藝，分析結(jié)果得出，最優(yōu)提取工藝：料液比為1∶30 g/mL，提取時間為1.5 h，提取溫度為80 ℃。在此條件下進行驗性證性實驗，滇黃精多糖提取率為20.70%與模型預測接近。通過抗氧化實驗可知，PKP、PKP?水和PKP?鹽對ABTS+·清除率的SC50值分別為2.442、0.825、 0.444 mg/mL，經(jīng)DEAE纖維素離子交換樹脂純化后，滇黃精多糖抗氧化能力增強，并且酸性多糖抗氧化能力強于中性多糖，說明其可作為天然的抗氧化劑。

純化后的多糖分為中性多糖和酸性多糖兩大類，抗氧化活性得到提高，最高達5.55倍，但精制多糖的純度較低，其中可能存在其他生物活性物質(zhì)，例如滇黃精中含有黃酮類、多酚和皂苷類物質(zhì)，也會產(chǎn)生一定的抗氧化活性，且?guī)缀鯖]有相關(guān)活性機制研究。因此，后期應進一步純化滇黃精多糖，和探究其他各類化合物的抗氧化活性。然而，多糖結(jié)構(gòu)的復雜程度較大，分子量較大，難以純化分離得到單體多糖，國內(nèi)外對其研究較少，因此對滇黃精多糖的深入研究還有待進一步開展，鑒于其廣泛的生物活性，具有研究開發(fā)成各種新型保健產(chǎn)品的應用前景。