樟葉越桔葉2個新6?O?咖啡酰葡萄糖苷的分離鑒定

李楚然 李 娜, 劉 云 楊曉琴 張穎君 劉惠民 趙 平,

（1. 西南林業(yè)大學西南地區(qū)林業(yè)生物質資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 中國科學院昆明植物研究所植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201；3. 西南林業(yè)大學云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650233）

越桔屬（Vaccinium）植物為杜鵑花科（Ericaceae）灌木，全球約有450種，據(jù)報道該屬植物含有黃酮、花青素、香豆素、木脂素、環(huán)烯醚萜、甾醇、三萜等多種次生代謝產物，其中酚類物質作為主要的活性物質[1?6]，具有良好的抑制腫瘤和抗糖尿病等藥理活性[7?12]。樟葉越桔（Vaccinium dunalianum）作為越桔屬的一種多年生常綠灌木，主要分布于我國的四川、貴州、云南和西藏等地[1]。該植物全株可藥用，其葉在我國西南地區(qū)被用作治療風濕的藥物，而葉芽則作為一種民間傳統(tǒng)茶飲，具有祛風除濕、舒筋活絡的功效[1,13]。Zhao等[14]和Li等[15]發(fā)現(xiàn)樟葉越桔富含咖啡酰熊果苷類物質，先后從葉芽和葉中分離得到36個酚類化合物，其中包括10個新化合物樟葉越桔苷A?J（dunalianosides A?J），并發(fā)現(xiàn)6′?O?咖啡酰熊果苷（6′?O?caffeoylarbutin）具有良好的黑色素生成抑制活性[16]，且在樟葉越桔葉芽中的含量高達31.76%[17]。此外，還通過建立樟葉越桔的多種組織培養(yǎng)體系，開展了不同植物生長調節(jié)劑對6′?O?咖啡酰熊果苷進行生產調控等相關研究[18?21]，為樟葉越桔的后續(xù)研究工作奠定了基礎。為了進一步挖掘樟葉越桔葉中的酚苷類化學成分，本研究采用硅膠、葡聚糖凝膠LH?20、Diaion HP20等多種柱層析方法，結合NMR和MS波譜分析手段，對樟葉越桔葉中的化學成分進行研究，以期為其進一步的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樟葉越桔葉于2015年4月采自云南省武定縣，經(jīng)中國科學院昆明植物研究所楊崇仁教授鑒定，植物標本（SWFU No. 1500414）存放于西南林業(yè)大學標本館中。

甲醇（天津市大茂化學試劑廠，中國）；石油醚（云南汕滇藥業(yè)有限公司，中國）；氯仿（天津市富宇精細化工有限公司，中國）；乙酸乙酯（云南汕滇藥業(yè)有限公司，中國）；以上試劑均為化學純。

Bruker DRX?400和Burker DRX?500超導核磁共振儀（Bruker公司，德國）；API QSTAR Pular?1質 譜 儀（Applied Biosystems，美 國）；Agilent G6230 TOF 質譜儀（Applied Agilent Technologies，美國）；P?1020 旋光儀（JASCO，日本）；N?1001型EYELA旋轉蒸發(fā)儀（東京理化器械有限公司，日本）；電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫(yī)療器械廠，中國）；三用紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠，中國）；SHB?Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司，中國）；BT244S型塞特路斯萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，中國）；GF254薄層層析硅膠板（青島海浪化工廠，中國）；200～300目硅膠（青島海洋化工廠，中國）；葡聚 糖凝膠LH?20（GE Healthcare，美 國）；Diaion HP20大 孔 吸 附 樹 脂（Mitsubishi Chemical Corporation，日 本）；MCI?gel CHP20P樹 脂（Mitsubishi Chemical Corporation，日本）。

1.2 實驗方法

將干燥的樟葉越桔葉（6 kg）粉碎后，用80%甲醇室溫浸泡提取5次，合并濾液，減壓濃縮干燥后得到總浸膏。總浸膏用蒸餾水混懸后依次用石油醚和乙酸乙酯進行萃取，分別得到石油醚、乙酸乙酯和水溶液部分。取水溶液部分150 g，經(jīng)Diaion HP20柱層析（60 cm×8 cm），以甲醇?水（體積比為0∶1～1∶0）溶液作為洗脫劑各1個柱體積依次進行梯度洗脫，用三角瓶每200 mL左右分別收集流出液，用氯仿∶甲醇∶水（體積比為7∶3∶0.5，6∶4∶1）展開劑對各流出液進行薄層層析后，根據(jù)樣品斑點有無熒光、1% H2SO4乙醇溶液噴霧加熱后的斑點顯色情況及其Rf值，將相同組分的樣品溶液進行合并，經(jīng)旋轉蒸發(fā)儀45 ℃下減壓濃縮后得到5個組分（Fr. 1～Fr. 5）。

Fr. 2（54.7 g）經(jīng)MCI?gel CHP20P柱 層 析（60 cm×5 cm）并以甲醇∶水（體積比為0∶1～1∶0）為洗脫劑各1個柱體積依次進行梯度洗脫后，經(jīng)薄層層析檢測合并后得到4個組分（Fr. 2?1～Fr. 2?4）。Fr. 2?3（16.1 g）經(jīng) Diaion HP20SS柱層析（60 cm×5 cm），以甲醇∶水（體積比為0∶1～1∶0）為洗脫劑各1個柱體積依次進行梯度洗脫，經(jīng)薄層層析檢測合并后進一步得到7個組分（Fr. 2?3?1～Fr. 2?3?7）。Fr. 2?3?4（9 g）經(jīng)MCI?gel CHP20P柱層析（50 cm×6 cm），甲醇∶水（體積比為0∶1～1∶0）各1個柱體積依次洗脫后，得到9個組分（Fr. 2?3?4?1～Fr. 2?3?4?9），其中Fr. 2?3?4?6經(jīng)硅膠柱（50 cm×3 cm，氯仿∶甲醇，20∶1～1∶10）和葡聚糖凝膠柱LH?20（50 cm×2 cm，甲醇∶水，體積比為0∶1～1∶0）層析后，得到化合物1（34.8 mg）和化合物2（10 mg）。

2 結果與分析

化合物1為白色不定形粉末，ESI+?MS質譜顯示其準分子離子峰m/z477 [M+Na]+，HR?ESI+?MS質譜顯示準分子離子峰m/z477.1369 [M+Na]+(calcd, 477.1367)，結合13C NMR DEPT譜顯示化合物1含有21個碳信號，其中包括1個伯碳（CH3）、3個仲碳（CH2）、12個叔碳（CH）和5個季碳（C），表明化合物1的分子量為454，分子式為C21H26O11，不飽和度為9。

化合物1的1H NMR譜顯示出一組β?D?吡喃葡萄糖基質子信號（δH4.41（1H，d，J=7.8 Hz，H?1′），4.51（1H，dd，J=10.0，1.9 Hz，H?6′b），4.33（1H，dd，J=10.0，6.4 Hz，H?6′a），3.55（1H，m，H?5′），3.38（1H，dd，J=9.0，6.8 Hz，H?3′），3.32（1H，m，H?4′），3.22（1H，dd，J=8.5，8.2 Hz，H?2′）），一組芳香環(huán)ABX偶合質子信號（δH7.04（1H，d，J=1.9 Hz，H?2″），6.94（1H，dd，J=8.2，1.9 Hz，H?6″），6.79（1H，d，J=8.2 Hz，H?5″）），和一組反式雙鍵質子信號（δ 7.56（1H，d，J=15.9 Hz，H?7″），6.28（1H，d，J=15.9 Hz，H?8″））（表1）。此外，還觀察到2個連氧CH質子信號（δH4.24（1H，m，H?3），4.81（1H，m，H?5）），兩組CH2質子信號（δH2.72（2H，m，H?2）；2.25（1H，br d，H?4b），1.66（1H，t，H?4a））和1個CH3質子信號（δH1.30（3H，d，J=6.4 Hz，H?6））的存在（表1）。

表1 化合物1和2的1H（400 MHz）和13C（125 MHz）核磁共振波譜數(shù)據(jù)（CD3OD）Table 1 1H（400 MHz）and 13C（125 MHz）NMR spectroscopic data for compounds 1 and 2（CD3OD）

13C NMR譜除顯示出一組β?D?吡喃葡萄糖基碳信號和一組典型的反式咖啡酰基碳信號之外，還顯示有1個羰基碳（δ 173.2）、2個連氧叔碳（δc 74.9，73.2）、2個仲碳（δc 36.8，36.7）和1個甲基碳信號（δc 21.7）（表1），推測化合物1中含有1個α?吡喃酮結構單元。通過1H?1H COSY和HSQC譜分析，對上述質子信號和碳信號進行了一一歸屬，并從1H?1H COSY和HMBC相關（圖1）進一步確定化合物1的苷元為3?hydroxy?5?hexanolide。HMBC譜中顯示的β?D?吡喃葡萄糖端基質子信號（δH4.41）與α?吡喃酮C?3位碳信號（δc 73.2），以及α?吡喃酮C?3位上質子信號（δH4.24）與葡萄糖端基碳信號（δc 104.3）之間的相關，表明β?D?吡喃葡萄糖連接在α?吡喃酮的C?3位上。β?D?吡喃葡萄糖的H?6′（δH4.51，4.33）與反式咖啡酰基中的C?9″羰基碳信號（δc 169.0）的HMBC相關，表明反式咖啡?；B接在葡萄糖的C?6位上。

圖1 化合物1和2的1H?1H COSY和HMBC相關Fig. 1 Key 1H?1H COSY and HMBC correlations of compounds 1 and 2

通過進一步比較1H和13C NMR譜數(shù)據(jù)（表1），發(fā)現(xiàn)化合物1和分離自紫萁科（Osmundaceae）紫萁（Osmunda japonica）[22]和樟葉越桔[14]的類花楸酸苷[（3R，5R）?3?（β?D?glucopyranosyloxy）?5?hexanolide，parasorboside]，里白科（Gleicheniaceae）光里白（Diplopterygium laevissimum）的hymenoside X[23]和膜蕨科華東膜蕨（Hymenophyllum barbatum）的hymenoside U[24]相類似，不同之處在于化合物1比類花楸酸苷多了一組反式咖啡?；男盘?，而hymenoside X分子中反式對羥基肉桂酰基和hymenoside U中的3,4?二羥基苯乙?；髯苑謩e連接在葡萄糖的2位上?；衔?的旋光值（[α]D25=?26.2（c = 0.015，MeOH））與類花楸酸苷（[α]D20=?20.0（c=1.0，H2O））[22]、hymenoside X（[α]D18.8=?42.1（c=0.11，MeOH））[23]和hymenoside U（[α]D22=?29.0（c=2.8，MeOH））[24]進行比較，表明化合物1中C?3位和C?5位的構型也為3R和5R。因此，化合物1的化學結構確定為（3R，5R）?3?（6′?O?trans?caffeoyl?β?D?glucopyranosyloxy）?5?hexanolide（圖2），命名為樟葉越桔苷K（dunalianoside K）。

圖2 樟葉越桔苷K（1）和樟葉越桔苷L（2）的化學結構Fig. 2 Chemical structures of dunalianoside K(1) and dunalianoside L(2)

化合物2為白色無定形粉末，ESI+?MS質譜顯示其準分子離子峰m/z495 [M+Na]+，HR?ESI+?MS質譜顯示其準分子離子峰m/z495.1469 [M+Na]+（calcd，495.1473），結合13C NMR DEPT譜顯示化合物2含有21個碳信號，其中包括1個伯碳（CH3）、3個 仲 碳（CH2）、12個 叔 碳（CH）和5個季碳（C），表明化合物2的分子量為472，分子式為C21H28O12，不飽和度為8。

化合物2的1H NMR和13C NMR譜數(shù)據(jù)與化合物1的非常相似，同樣表明了6?O?咖啡酰?β?D?葡萄吡喃糖基的存在，同時還觀察到1個甲基（δH0.98（3H，d，J=6.4 Hz，H?6）；δc 21.6（d，C?6））、2個CH2（δH2.36（1H，dd，J=14.2，6.3 Hz，H?2a），2.29（1H，dd，J=14.5，6.5 Hz，H?2b）/δc 43.2（t，C?2）；δH1.70（1H，m，H?4a），1.45（1H，m，H?4b）/δc 43.3（t，C?4）]、2個連氧CH[δH4.02（1H，m，H?3）/δc 76.8（d，C?3）；δH3.80（1H，m，H?5）/δc 65.2（d，C?5））和1個羰基信號（δC179.7）的存在。與化合物1相比，化合物2僅是苷元部分的信號與化合物1不同，且化合物2比化合物1多18個質量數(shù)，并少1個不飽和度，推測化合物2的苷元為α?吡喃酮開環(huán)的鏈狀結構。通過1H?1H COSY和HSQC譜分析，對化合物2的所有質子信號和碳信號進行了一一歸屬，并從1H?1H COSY和HMBC相關（圖1）進一步確定化合物2的苷元為α?吡喃酮開環(huán)的鏈狀結構。在HMBC譜中（圖1），β?D?吡喃葡萄糖端基質子信號δH4.42（1H，d，J=8.0 Hz，H?1′）與苷元中的C?3位碳信號（δc 76.8）之間的相關，表明β?D?吡喃葡萄糖連接在苷元的C?3位上。β?D?吡喃葡萄糖6位上的質子信號δH4.35（1H，br d，J=11.5 Hz，H?6′b）和δH4.23（1H，dd，J=11.5，6.5 Hz，H?6′a）與反式咖啡酰基中的C?9″羰基碳信號（δc 169.1）的HMBC相關，表明反式咖啡?；B接在葡萄糖的C?6位上。

通過進一步比較1H和13C NMR譜數(shù)據(jù)（表1），發(fā)現(xiàn)化合物2與分離自光里白的hexanoside A[23]和華東膜蕨的methyl?（3R，5R）?5?hydroxy?（β?D?glucopyranosyloxy）?hexanoate[24]的結構相似。通過對比化合物2（[α]D25=?48.3（c=0.01，MeOH））與 上 述 二 者（[α]D24=?27.8（c=1.15，MeOH）；[α]D19.1=?38.5（c=0.10，MeOH））的旋光值，表明化合物2的C?3位和C?5位的構型也為3R和5R。因此，確定化合物2的化學結構確定為（3R，5R）?3?（6′?O?trans?caffeoyl?β?D?glucopyranosyloxy）?5?hydroxy?hexanoic acid（圖2），命名為樟葉越桔苷L（dunalianoside L）。

3 結論與討論

本研究進一步從樟葉越桔葉中分離鑒定了2個新的6?O?咖啡酰葡萄糖苷，即樟葉越桔苷K（1）和樟葉越桔苷L（2），2個化合物僅苷元結構不同，化合物2的苷元為化合物1中α?吡喃酮開環(huán)的鏈狀結構。有文獻報道認為(3S，5S)?5?hexanolide在 甲 醇 中 容 易 形 成methyl?(3S，5S)?hydroxy?hexanoate[25]，但在本研究中化合物2是以游離羧酸的形式存在，因此化合物1和2為樟葉越桔葉中的天然產物。從化合物1和2的化學結構上來看，二者與樟葉越桔葉芽和葉中分離得到的咖啡酰熊果苷類化合物[14?15]均屬6?O?咖啡酰葡萄糖苷衍生物，提示樟葉越桔葉芽和葉中含有豐富的葡萄糖：6?O?咖啡?；D移酶基因家族成員[26]，開展該基因家族成員的基因克隆與功能分析等相關研究，將有助于闡明6?O?咖啡酰葡萄糖苷衍生物的生物合成機制。此外，有文獻報道發(fā)現(xiàn)類花楸酸苷和methyl?(3S，5S)?5?hydroxy?(β?D?glucopyranosyloxy)?hexanoate對黃蝴蝶幼蟲具有顯著的昆蟲拒食活性[22]，而結構相似的化合物1和2是否也具有類似的生物活性，值得開展進一步的相關研究。