紅芪多糖-1-1的分離純化及其調(diào)節(jié)抗生素誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)的最佳劑量分析

董嘉琪，張旺東，姚萬玲，薛 姣，劉瑩發(fā)，魏彥明，紀(jì) 鵬

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

胃腸道定植的微生物種類繁多、數(shù)目巨大，構(gòu)成了復(fù)雜的消化道微生態(tài)系統(tǒng)，其中，僅細(xì)菌的種類就達(dá)1 000種之多，其總量可達(dá)人類細(xì)胞總數(shù)的10倍。 它們對機(jī)體消化、能量代謝、腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育均具有重要的調(diào)節(jié)作用。在畜牧生產(chǎn)中，抗生素長期大量使用會引起腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致畜禽免疫力降低及二次感染等問題。此外，斷奶等應(yīng)激誘發(fā)的菌群失調(diào)可導(dǎo)致仔豬生長性能下降、免疫力降低，犢牛腹瀉率增加等。人類腸道菌群失調(diào)也可誘發(fā)多種疾病，有研究表明，當(dāng)機(jī)體腸道菌群失調(diào)時(shí)，會導(dǎo)致糖尿病患者病情加劇，炎癥性腸病發(fā)病率提高，腸道菌群長期紊亂還會導(dǎo)致結(jié)直腸腺瘤風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，腸道菌群失調(diào)還會影響情緒行為的調(diào)控等。為提高畜牧業(yè)生產(chǎn)力、控制腸道菌群失調(diào)相關(guān)疾病的發(fā)生，開發(fā)新型產(chǎn)品以維持和改善腸道微生態(tài)已成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)，微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等產(chǎn)品己經(jīng)在生產(chǎn)、生活中廣泛應(yīng)用。

目前研究表明，中藥也可扶植胃腸道正常菌群生長，提高機(jī)體免疫力。近年來，植物或中藥多糖對腸道菌群調(diào)節(jié)作用的研究備受國內(nèi)外關(guān)注，如香菇多糖、黃芪多糖、人參多糖等。它們可為腸道微生物的生存提供必需的營養(yǎng)素，同時(shí)糖類被微生物降解后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸也可調(diào)節(jié)腸道pH并給機(jī)體提供能量，對動(dòng)物機(jī)體健康具有重要意義。紅芪為甘肅省道地藥材，古代本草學(xué)家將紅芪統(tǒng)稱為黃芪，直到20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)紅芪中含有黃芪不具有的成分1-3-羥基-9-甲氧基紫檀烷，具有較好的抑菌作用，使得紅芪的藥效學(xué)研究引起國內(nèi)研究者的重視。1985年中國藥典將紅芪從黃芪項(xiàng)中移出，成為一味單獨(dú)的中藥。據(jù)報(bào)道，紅芪多糖具有提高免疫、抗氧化、降血糖、抗輻射、抗腫瘤等多方面的功效，但關(guān)于其調(diào)節(jié)腸道菌群的作用鮮見報(bào)道。而且不同來源的多糖因分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及純度方面的差異，對機(jī)體產(chǎn)生的效用以及作用的最佳劑量會有所不同。

本試驗(yàn)將紅芪粗多糖分別用DEAE-52和Sephadex G-100進(jìn)行分離純化得單一多糖，用來調(diào)節(jié)灌服抗生素雞尾酒(氨芐西林、萬古霉素、甲硝唑、新霉素)小鼠的腸道菌群，通過16S rDNA高通量測序技術(shù)分析不同劑量的純化紅芪多糖對腸道菌群的影響，篩選出調(diào)節(jié)腸道菌群的最佳有效劑量，以期為紅芪多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

1.1.1 主要試劑 Sephadex G-100和DEAE-52，購自美國Whatman公司；標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古羅糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、鹽酸氨基葡萄糖，購自Sigma公司；三氟乙酸和甲醇，購自ANPEL公司；氨芐西林、新霉素、萬古霉素、甲硝唑、兩性霉素B，購自上海麥克林公司。

1.1.2 主要儀器 ICS5000離子色譜系統(tǒng)，美國Thermo公司；7890A-5977B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；DZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；iMark型酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；RM2245切片機(jī)，德國Leica公司；Olympus DP-71顯微照相系統(tǒng)，日本Olympus公司。

1.2 試驗(yàn)藥物的制備

利用實(shí)驗(yàn)室已建立優(yōu)化的紅芪粗多糖提取方法制備紅芪多糖。對紅芪粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化得到的多糖RHPS-1(Radix Hedysari polysaccharide-1，RHPS-1)，經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱進(jìn)一步純化，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測，繪制吸收曲線，收集主峰部分，冷凍干燥得多糖RHPS-1-1。

1.3 多糖含量的測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法測定。

1.4 多糖的純度鑒定及分子量測定

采用凝膠滲透色譜法測定RHPS-1-1的相對分子質(zhì)量。以市售不同分子量(1、5、10、50、150、200、400 ku)的右旋糖酐為參照建立方法。樣品完全溶解于超純水中，通過0.45 μm濾器過濾后進(jìn)樣。

1.5 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜法(high-performance anion-exchange chromatography，HPAEC)進(jìn)行單糖組成測定。

1.5.1 樣品前處理 精確稱量紅芪多糖樣品5 mg， 加入1 mL 2 mol·LTFA酸溶液，105 ℃加熱6 h，氮?dú)獯蹈伞＜尤爰状记逑?，再吹干，重?fù)甲醇清洗2～3次。加入無菌水溶解，轉(zhuǎn)入色譜瓶中待測。

1.5.2 色譜條件 采用DionexCarboPacPA10(250×4.0 mm，10 μm)液相色譜柱；進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A(0.1 mol·LNaOH)，流動(dòng)相B(0.1 mol·LNaOH，0.2 mol·LNaAc)，流速0.5 mL·min；柱溫為30 ℃；洗脫梯度：0 min A相/B相(95∶5，V/V)，30 min A相/B相(80∶20，V/V)，30.1 min A相/B相(60∶40，V/V)，45 min A相/B相(60∶40，V/V)，45.1 min A相/B相(95∶5，V/V)， 60 min A相/B相(95∶5，V/V)。

1.6 多糖的甲基化分析

1.6.1 樣品衍生化 稱取紅芪多糖樣品10 mg，加入1 mL一級水溶解，再加入1 mL 100 mg·mL碳二亞胺，反應(yīng)2 h。加入1 mL 2 mol·L的咪唑，再分別加入1 mL 30 mg·mL的NaBH和1 mL 30 mg·mL的NaBD，反應(yīng)3 h。加入100 μL冰醋酸終止反應(yīng)。透析樣品48 h，透析完成后冷凍干燥樣品，進(jìn)行甲基化處理。

1.6.2 樣品甲基化處理 凍干樣品中加入500 μL DMSO溶解。加入1 mg NaOH，孵育30 min。加入50 μL碘甲烷溶液反應(yīng)1 h。加入1 mL水和2 mL二氯甲烷，渦旋混勻，離心，棄水相。重復(fù)水洗3次。吸取下層二氯甲烷相并蒸干。加入100 μL 2 mol·LTFA，121 ℃反應(yīng)90 min。30 ℃蒸干。加入50 μL 2 mol·L氨水，50 μL 1 mol·LNaBD，混勻，室溫下反應(yīng)2.5 h。加入20 μL乙酸終止反應(yīng)，氮?dú)獯蹈桑?50 μL甲醇洗2次，氮?dú)獯蹈伞＜尤胍宜狒?50 μL，渦旋混勻，100 ℃反應(yīng)2.5 h。加入1 mL水靜置10 min。加入500 μL二氯甲烷，渦旋混勻，離心，棄水相。重復(fù)水洗3次。取下層二氯甲烷相，上機(jī)檢測。

1.6.3 色譜條件 采用Agilent氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定多糖結(jié)構(gòu)。進(jìn)樣量為1 μL，分流比為10∶1， 載氣為高純氦氣；柱溫箱的初始溫度為140 ℃保持2.0 min，以3 ℃·min程序升溫至230 ℃，保持3 min。質(zhì)量掃描范圍(m·z)： 30～600。

1.7 紅外光譜分析

用傅里葉變換紅外光譜儀以1 cm分辨率在4 000～400 cm內(nèi)掃描紅芪多糖的吸收峰。

1.8 動(dòng)物試驗(yàn)

SPF級C57BL/6小鼠90只，6～8周齡，體重18～22 g，雄性，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號：SYXK(甘)2020-0010)。試驗(yàn)過程中遵循動(dòng)物倫理福利相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。按國家標(biāo)準(zhǔn)對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在(18±2)℃，相對濕度為50%～60%，12 h光照/12 h黑暗，小鼠自由采食和飲水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將90只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、自愈組，12.5、25、50、100、200和400 mg·kg的紅芪多糖干預(yù)組，每組10只。模型組、自愈組和不同劑量紅芪多糖干預(yù)組參考文獻(xiàn)[25-27]復(fù)制模型：小鼠口腔灌服抗生素雞尾酒(由4種抗生素和1種抗真菌藥組成，將氨芐西林100 mg·kg、萬古霉素50 mg·kg、甲硝唑100 mg·kg、新霉素100 mg·kg和兩性霉素B 1 mg·kg溶于滅菌蒸餾水中，現(xiàn)用現(xiàn)配)，每天2次，每次間隔12 h，連續(xù)14 d，建立小鼠腸道菌群失調(diào)模型，正常對照組灌服等量的生理鹽水。造模結(jié)束后，將模型組小鼠處死，各紅芪多糖治療組分別灌服12.5、25、50、100、200和400 mg·kg的RHPS-1-1進(jìn)行治療，正常對照組、自愈組給予等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

1.9 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，將各組小鼠禁食12 h，眼球采血處死，取盲腸內(nèi)容物立即放入液氮中，-80 ℃儲存。取心、肝、脾、肺、腎、腦置于4%中性甲醛溶液中固定。

1.10 檢測指標(biāo)

1.10.1 小鼠體重的檢測 試驗(yàn)期間每2 d稱量每只小鼠的體重，以各組小鼠的平均體重變化率為指標(biāo)，檢測不同處理對小鼠體重的影響。

1.10.2 腸道菌群高通量測序分析 盲腸內(nèi)容物16S rDNA檢測由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成，根據(jù)說明書，使用 E.Z.N.A.Stool DNA Kit分離試劑盒從樣品中提取總DNA，選取細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行基因擴(kuò)增與測序。所用引物序列為：341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)，805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：Phusion Hot start flex 2× Master Mix 12.5 μL、Forward Primer 2.5 μL、Reverse Primer 2.5 μL、Template DNA 50 μL、ddHO 25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：98 ℃，30 s；(98 ℃，10 s； 54 ℃，30 s；72 ℃，45 s)×35次循環(huán)；72 ℃，10 min。 所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和均一化處理后，構(gòu)建測序文庫，利用Illumina NovaSeq平臺進(jìn)行高通量測序。

1.10.3 生物信息學(xué)分析 用QIIME2分析菌群α多樣性(Chao1、Shannon、Goods_coverage和Simpson)，使用R軟件vegan進(jìn)行β多樣性分析，包括主成分分析和聚類分析，<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.10.4 各臟器指數(shù) 稱量心、肝、脾、肺、腎和腦的重量，計(jì)算各臟器指數(shù)(mg·g)。

1.10.5 病理組織學(xué)觀察 取固定于4%中性甲醛溶液中的各臟器樣品進(jìn)行流水沖洗24 h，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片和HE染色，中性樹膠封片。采用Olympus DP-71顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用軟件Chromeleon處理色譜數(shù)據(jù)；用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，正常和模型組差異菌群分析比較采用LSD法，其他事后比較采用鄧肯法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，<0.01表示差異極顯著，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 RHPS-1的純化

將紅芪粗多糖過DEAE-52離子交換柱，用蒸餾水洗脫，在30～60管之間洗出現(xiàn)一個(gè)峰，合并洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得RHPS-1；將RHPS-1組分經(jīng)Sephadex G-100凝膠色譜柱純化，在18～55管之間洗出一個(gè)峰(圖1)，合并洗脫液，濃縮、冷凍干燥，得RHPS-1-1，回收率為64.98%，糖含量為99.12%。

圖1 RHPS1-1的Sephadex G-100凝膠色譜柱洗脫圖Fig.1 Chromatographic elution on RHPS1-1 by Sephadex G-100 gel column

2.2 RHPS-1-1的純度測定及相對分子質(zhì)量分布

RHPS-1-1的重均分子量為19.420 ku；RHPS-1-1的多分散系數(shù)(Mw/Mn)為1.31，接近于1，兩級分布均為單一對稱峰，說明RHPS-1-1為均一多糖。

2.3 RHPS-1-1的單糖組成分析

高效陰離子交換色譜分析顯示RHPS-1-1主要由葡萄糖(99.20%)組成，還含有少量的阿拉伯糖(0.19%)和葡萄糖醛酸(0.21%)(圖2)。

A. 標(biāo)準(zhǔn)品離子色譜圖；B. RHPS-1-1離子色譜圖；標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸、古羅糖醛酸、D-氨基半乳糖鹽酸鹽、鹽酸氨基葡萄糖A.Ion Chromatogram of standard samples; B. Ion Chromatogram of RHPS-1-1; Standards: Fuc(Fucose); Rha(Rhamnose); Ara(Arabinose); Gal(Galactose); Glc(Glucose); Xyl(Xylose); Man(Mannose); Fru(Fructose); Rib(Ribose); Gal-UA(Galacturonic Acid); Glc-UA(Glucuronic Acid); Man-UA(Mannuronic Acid); Gul-UA(Guluronic Acid); D-GalN(D-Glucosamine hydrochloride); GluN(Glucosamine)圖2 標(biāo)準(zhǔn)品和RHPS-1-1的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of standards and RHPS-1-1

2.4 RHPS-1-1的甲基化分析

甲基化的RHPS-1-1樣品的GC-MS分析結(jié)果如表1所示。在RHPS-1-1中，以1,4-D-Glcp連接類型為主，有少數(shù)1,6-D-Glcp連接。此外，還發(fā)現(xiàn)少量的1,3,4-D-Glcp、1,2,4-D-Glcp和1,4,6-D-Glcp連接，表明存在少量的分支。根據(jù)甲基化分析的結(jié)果，可以推斷RHPS-1-1具有1,4-D-Glcp連接的葡聚糖結(jié)構(gòu)，在O-2或O-3處可能存在Glcp分支，T-D-Glcp為糖鏈末端。

2.5 RHPS-1-1的紅外光譜分析

如圖3所示，紅芪多糖RHPS-1-1在3 600～3 200、 3 000～2 800、1 400～1 200和1 200～700 cm范圍內(nèi)的吸收峰是多糖的特征吸收峰。RHPS-1-1在波數(shù)3 280 cm處都具有強(qiáng)而寬的吸收峰，是由糖環(huán)中的O—H鍵的變角振動(dòng)引起的；在波數(shù)2 930 cm處具有中等強(qiáng)度的吸收峰，是由于C—H的拉伸振動(dòng)，這些特征峰也均為典型的多糖特征峰。RHPS-1-1在1 630 cm處的吸收峰表示與水結(jié)合的峰，1 340 cm處的吸收峰表示C—O的拉伸振動(dòng)。在990.0 cm處的吸收峰表示D-葡萄吡喃糖的非對稱環(huán)伸縮振動(dòng)。在843 cm處的吸收峰表示RHPS-1-1是α構(gòu)型糖苷鍵。上述吸收峰為植物多糖的特殊吸收峰。

圖3 RHPS-1-1的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum diagram of RHPS-1-1

2.6 紅芪多糖對各組小鼠體重的影響

試驗(yàn)過程中各組小鼠體重變化率均呈逐漸上升趨勢(圖4A)。第22和28天各組小鼠體重變化率組間差異顯著(<0.05)，其余天數(shù)各組之間無顯著性差異(>0.05)。與正常對照組相比，自愈組小鼠體重變化率在第22和28天時(shí)均顯著下降(<0.05)， 經(jīng)RHPS-1-1治療后，除RHPS-1-1 200 mg·kg組小鼠體重變化率在22 d時(shí)顯著上升(<0.05)， 其他組在第22和28天時(shí)小鼠體重變化均上升，但差異不顯著(>0.05)。

A. 整個(gè)試驗(yàn)過程中各組小鼠的體重變化率；B. 第22天各組小鼠的體重變化率；C. 第28天各組小鼠的體重變化率。NC. 正常對照組；SH. 自愈組；M. 模型組；R1T-12.5、R1T-25、R1T-50、R1T-100、R1T-200和R1T-400分別代表劑量為12.5、25、50、100、200和400 mg·kg-1 RHPS-1-1給藥組。相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同A. Body weight change of mice in each group throughout the experiment; B. The body weight change of mice in each group on day 22; C. The body weight change of mice in each group on day 28. NC. Normal control group; SH. Self-healing group; M. Model group; R1T-12.5, R1T-25, R1T-50, R1T-100, R1T-200 and R1T-400 respectively represent 12.5, 25, 50, 100, 200 and 400 mg·kg-1 of RHPS-1-1 treatment groups. The same letter means no significant difference (P>0.05), different letters mean significant difference (P<0.05). The same as below圖4 各組小鼠的體重變化率Fig.4 Change rate of body weight in each group

2.7 正常對照組和模型組腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.7.1 正常和模型組腸道菌群分布 通過分類學(xué)分析，共鑒定出10個(gè)門。正常對照組所有樣本中的最優(yōu)勢菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)，變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的豐度占比次之，另外，其他一些豐度較低的門也被檢出；模型組樣本菌群較為單一，幾乎為變形菌門(Proteobacteria)(圖5A)。為進(jìn)一步驗(yàn)證分類學(xué)差異，本研究對top5的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)正常對照組所有樣本中_unclassified占比較大，而模型組所有樣本中克雷伯菌屬()占比較大(圖5B)。

A. 門水平的腸道菌群分布相對豐度；B. 屬水平的腸道菌群分布相對豐度。NC-1～5. 正常對照組小鼠編號；M-1～5. 模型組小鼠編號A. Relative abundance of intestinal flora at phylum level; B. Relative abundance of intestinal flora at genus level; NC-1-5. The number of mice in normal control group; M-1-5. The number of mice in model group圖5 正常對照組和模型組門和屬水平的腸道菌群分布Fig.5 Intestinal flora distribution at phylum and genus levels in normal control and model groups

2.7.2 正常對照組和模型組差異菌群分析 在門水平上，與正常對照組相比，模型組擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度極顯著降低(<0.01)，放線菌門顯著降低(<0.05)，變形菌門極顯著升高(<0.01)(圖6A～D)。在屬水平上，與正常對照組相比，模型組_NK4A136_group相對豐度極顯著降低(<0.01)，克雷伯菌屬極顯著升高(<0.01)(圖6E～F)。

A. 擬桿菌門；B. 厚壁菌門；C. 變形菌門；D. 放線菌門；E. 克雷伯菌屬；F. Lachnospiraceae_NK4A136_group。*. P<0.05； **. P<0.01A. Bacteroidetes; B. Firmicutes; C. Proteobacteria; D. Actinobacteria; E. Klebsiella; F. Lachnospiraceae_NK4A136_group. *. P<0.05； **. P<0.01圖6 正常對照組和模型組門和屬水平差異菌群分析Fig.6 Analysis of differential flora at phylum and genus levels in normal control and model groups

2.8 除模型組外的腸道菌群多樣性分析

2.8.1 Alpha多樣性分析 由圖7可知，與正常對照組相比，自愈組小鼠腸道菌群Chao1指數(shù)顯著降低(<0.05)，經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組顯著升高(<0.05)，R1T-50、R1T-200、R1T-400組均顯著降低(<0.05)，其余各組無顯著性變化(>0.05)(圖7A)；與正常對照組相比，自愈組小鼠腸道菌群Shannon指數(shù)無顯著變化(>0.05)，經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-200、R1T-400組Shannon指數(shù)顯著下降(<0.05,圖7C)，其余各組無顯著性變化(>0.05)；Goods_coverage和Simpson指數(shù)各組之間差異不顯著(>0.05,圖7B、7D)。

A. Chao1 指數(shù)；B. Goods_coverage； C. Simpson指數(shù)；D. Shannon指數(shù)A. Chao1 index; B. Goods_coverage; C. Simpson index; D. Shannon index圖7 除模型組外的各組小鼠腸道菌群alpha多樣性分析Fig.7 Alpha diversity analysis of intestinal microflora in mice of each group except model group

2.8.2 Beta多樣性分析

2.8.2.1 主成分分析：由圖8可知，正常對照組和自愈組完全分離，菌群結(jié)構(gòu)差異較大；R1T-25組和正常對照組重合度最高，菌群結(jié)構(gòu)差異較小，其余各治療組均與正常對照組菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

圖8 除模型組外的各組小鼠腸道菌群PCA分析Fig.8 PCA analysis of intestinal flora of mice in each group except model group

2.8.2.2 各組小鼠腸道菌群UPGMA聚類樹分析：通過各組小鼠門和屬水平的聚類分析圖(圖9)可得出，正常對照組與自愈組間樣本的距離較大，表明兩組間腸道菌群結(jié)構(gòu)有較大差異；經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組與正常對照組間樣本的距離最小，表明兩組間腸道菌群結(jié)構(gòu)有高度的相似性。該結(jié)果與PCA的聚類結(jié)果較為紊合。

A. 門水平；B.屬水平A. Phylum level; B. Genus level圖9 除模型組外的各組腸道菌群UPGMA聚類樹分析Fig.9 UPGMA clustering tree analysis of intestinal flora in each group except model group

2.9 除模型組外的腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.9.1 門和屬水平腸道菌群分布 在門水平上，厚壁菌門和擬桿菌門是小鼠腸道菌群中最主要的優(yōu)勢菌門，其相對豐度在所有樣本中占比最大(圖10A)。在屬水平上，_unclassified是腸道微生物中的絕對優(yōu)勢菌(圖10B)。與正常對照組相比，自愈組中_unclassified增加。與自愈組相比，各治療組_unclassified減少。

A. 門水平；B.屬水平A. Phylum level; B. Genus level圖10 除模型組外的各組小鼠門和屬水平的腸道菌群分布Fig.10 Intestinal flora distribution at phylum and genus levels in mice of each group except model group

2.9.2 門和屬水平差異菌群分析 在門水平上，與正常對照組相比，自愈組擬桿菌門相對豐度顯著升高(<0.05)，厚壁菌門相對豐度顯著降低(<0.05)，二者比值(擬桿菌門/厚壁菌門)也顯著升高(<0.05)；RHPS-1-1治療后，各劑量組的擬桿菌門相對豐度和二者比例均顯著降低(<0.05)，厚壁菌門相對豐度除R1T-200組無顯著變化外，其余各劑量組均顯著升高(<0.05)。與正常對照組相比，R1T-12.5、25、50、100組的擬桿菌門差異不顯著(>0.05)；除R1T-200組的厚壁菌門顯著降低外(<0.05)，其余差異不顯著(>0.05)；各治療組的擬桿菌門/厚壁菌門差異不顯著(>0.05)(圖11A～C)。

A.擬桿菌門；B. 厚壁菌門；C. 擬桿菌門/厚壁菌門；D. Muribaculaceae_unclassified；E. Ruminococcaceae_UCG-014；F. Clostridiales_unclassifiedA.Bacteroidetes; B. Firmicutes; C. Bacteroidetes/Firmicutes; D. Muribaculaceae_unclassified; E. Ruminococcaceae_UCG-014; F. Clostridiales_unclassified圖11 除模型組外的各組小鼠門和屬水平差異菌群分析Fig.11 Differential flora analysis at phylum and genus levels of mice in each group except model group

在屬水平上，與正常對照組相比，自愈組_unclassified相對豐度顯著升高(<0.05)，_UCG-014和_unclassified相對豐度顯著降低(<0.05)。經(jīng)RHPS-1-1治療后，各劑量組_unclassified均顯著降低(<0.05)；R1T-12.5和R1T-25組_UCG-014相對豐度顯著升高(<0.05)，其余各劑量組均無顯著性變化(>0.05)；R1T-12.5、R1T-100和R1T-200組_unclassified相對豐度無顯著性變化(>0.05)，其余各劑量組均顯著升高(<0.05)。與正常對照組相比，R1T-12.5組的_unclassified相對豐度顯著升高(<0.05)；R1T-12.5和25組的_UCG-014相對豐度差異不顯著(>0.05)，其余各組差異顯著(<0.05)；R1T-25、50、100和400組的_unclassified相對豐度差異不顯著(>0.05)，其余各組差異顯著(<0.05,圖11D～F)。

綜上，從門和屬的總體水平上可以看出，R1T-25組菌群的回調(diào)效果最好。

2.10 紅芪多糖對各組小鼠臟器的影響

與正常對照組相比，自愈組小鼠肝臟指數(shù)顯著下降(<0.05)，經(jīng)25 mg·kgRHPS-1-1治療后，顯著上升(<0.05)。心臟、脾臟、肺臟、腎臟和腦指數(shù)3組間均無顯著性差異(>0.05，表2)。

表2 RHPS-1-1對腸道菌群失調(diào)小鼠主要器官指數(shù)的影響(Mean±SD)

正常對照組、自愈組和25 mg·kgRHPS-1-1治療組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常；胞核清晰呈橢圓形，著色較淺，位于肌纖維的中央，肌纖維間無炎性細(xì)胞浸潤(圖12A～C)，且3組間無顯著變化；肝小葉結(jié)構(gòu)完整，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索和肝血竇向周圍呈放射狀排列；肝細(xì)胞形態(tài)清晰，核大而圓，居中，胞漿豐富(圖12D～F)，且3組間無顯著變化；脾組織結(jié)構(gòu)完整，紅、白髓區(qū)界限清晰，小梁結(jié)構(gòu)正常，脾索和脾竇結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞排列緊密、結(jié)構(gòu)完整(圖12G～I(xiàn))，且3組間無顯著變化；肺泡結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核明顯，肺泡無塌陷及破裂，肺泡充盈適度，無滲出液及炎癥細(xì)胞浸潤(圖12 J～L)，且3組間無顯著變化；腎單位結(jié)構(gòu)清晰，腎皮質(zhì)迷路結(jié)構(gòu)明顯，腎小體結(jié)構(gòu)完整，腎小球位于小體中央且結(jié)構(gòu)完整，囊腔大小正常，腎小管上皮細(xì)胞排列規(guī)律(圖12M～O)，且3組間無顯著變化；腦海馬區(qū)細(xì)胞排列整齊、密集，核圓而大，核仁清晰，膠質(zhì)細(xì)胞無增生，間質(zhì)無水腫現(xiàn)象(圖12Q～R)，且3組間無顯著變化。

A～C.心；D～F.肝；G～I(xiàn).脾；J～L.肺；M～O.腎；P～R.大腦A-C. Heart; D-F. Liver; G-I. Spleen; J-L. Lung; M-O. Kidney; P-R. Brain圖12 各組小鼠主要臟器組織病理變化(HE染色，400×)Fig.12 Histopathological changes of main organs of mice in each group(HE staining, 400×)

3 討 論

本研究分離純化所得的RHPS-1-1的重均分子量為19.420 ku，其單糖組成主要為葡萄糖，主鏈連接方式為1,4-D-Glcp，這與陳同強(qiáng)和石義凱從紅芪中提取的多糖在單糖組成和主鏈連接方式上均相似，但分子量存在差異，而本研究獲得的RHPS-1-1支鏈較少，易溶解，能較好地進(jìn)入細(xì)胞，從而發(fā)揮生物學(xué)作用，表明本研究所提取的RHPS-1-1具有較高的生物活性。

本研究用RHPS-1-1對抗生素雞尾酒法建立的小鼠腸道菌群失調(diào)模型進(jìn)行菌群調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門幾乎耗竭，而變形菌門豐度比例顯著上升，表明小鼠腸道菌群嚴(yán)重失調(diào)，造模成功。自愈組相比正常對照組Chao1指數(shù)顯著降低，說明抗生素可降低腸道菌群的多樣性，且不能自行恢復(fù)，這與Kaur等的研究結(jié)果相一致。經(jīng)不同劑量RHPS-1-1治療后，RIT-25組Chao1指數(shù)提高程度最大，且PCA和UPGMA聚類分析結(jié)果表明，R1T-25組的腸道菌群組成與正常對照組最接近。提示以25 mg·kgRHPS-1-1給藥對腸道菌群紊亂小鼠的調(diào)控效果最佳，這可能與多糖濃度有關(guān)，在適量濃度下多糖可作為能源物質(zhì)為微生物提供營養(yǎng)，但當(dāng)濃度過高時(shí)，會導(dǎo)致部分菌群細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生物理性滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)水分流失，導(dǎo)致死亡。綜上，說明25 mg·kgRHPS-1-1為調(diào)節(jié)小鼠菌群失調(diào)的最佳劑量。

本研究結(jié)果顯示，在門水平上，自愈組相比正常對照組擬桿菌門相對豐度顯著升高，厚壁菌門顯著降低，擬桿菌門與厚壁菌門的豐度比(擬桿菌門/厚壁菌門)也顯著升高，這與Rodrigues等研究相一致。厚壁菌門和擬桿菌門是人體內(nèi)的優(yōu)勢菌門。有研究報(bào)道，厚壁菌門能幫助機(jī)體有效地吸收食物中的熱量，并逐漸轉(zhuǎn)化為脂肪，還可調(diào)控能量貯存基因的表達(dá)；而擬桿菌門擅長分解碳水化合物，使人和動(dòng)物不易肥胖。因此，本研究中自愈組小鼠在22和28 d體重下降，可能與擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低，兩者豐度比值升高有關(guān)。另外，兩者比值升高還與一些疾病相關(guān)，例如糖尿病、結(jié)腸腺瘤性息肉、腦出血等。本研究所復(fù)制的菌群失調(diào)模型，是否有相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)還有待進(jìn)一步研究。經(jīng)RHPS-1-1治療后，各劑量組的擬桿菌門相對豐度和二者比例均顯著降低，厚壁菌門顯著升高，說明RHPS-1-1對抗生素造成的腸道菌群失調(diào)具有調(diào)節(jié)作用。在屬水平上，自愈組_UCG-014和_unclassified相對豐度相比正常對照組顯著降低，這與Park等和Cho等研究結(jié)果一致。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，自愈組中有害菌_unclassified相對豐度增多。經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組_UCG-014和_unclassified相對豐度顯著升高，_unclassified顯著降低。有研究報(bào)道瘤胃菌屬的_UCG-014和梭菌科的_unclassified屬于腸道益生菌，可抑制有害菌的生長。同時(shí)梭菌科的某些細(xì)菌可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，維持大腸的正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞的形態(tài)和功能。因此，RHPS-1-1調(diào)節(jié)腸道菌群可能是促進(jìn)了腸道有益菌的生長，抑制了有害菌的生長。

另外，腸道菌群失調(diào)后還會導(dǎo)致細(xì)菌和內(nèi)毒素移位，進(jìn)而引起內(nèi)源性感染和內(nèi)毒素血癥，造成多器官衰竭。本研究發(fā)現(xiàn)，器官指數(shù)在自愈組相比正常對照組只有肝臟指數(shù)顯著下降，其他臟器無變化；進(jìn)一步的組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，各主要組織器官無明顯的病理損傷。有文獻(xiàn)報(bào)道，腸道菌群失調(diào)會誘發(fā)肝硬化等肝疾病，至于本研究中所建立的抗生素雞尾酒致菌群失調(diào)模型是否在分子水平和代謝水平上對肝及其他臟器造成影響還有待進(jìn)一步深入研究。經(jīng)RHPS-1-1治療后，R1T-25組的肝臟指數(shù)顯著上升，說明RHPS-1-1具有一定的保護(hù)肝的作用或通過其他途徑恢復(fù)了肝組織的功能。

4 結(jié) 論

本研究純化所得RHPS-1-1為一種植物葡聚糖，且給藥劑量為25 mg·kg時(shí)，對抗生素雞尾酒誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群紊亂，在提高腸道菌群穩(wěn)定性和多樣性、促進(jìn)腸道益生菌增殖、有效抑制有害菌過度繁殖等方面具有顯著調(diào)節(jié)作用；同時(shí)此劑量的RHPS-1-1可以回調(diào)由抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)所致的肝臟指數(shù)下降。