沙門菌烈性噬菌體的分離鑒定、生物學(xué)特性及基因組分析

岑 鑫，陽亭亭，趙尊福，文永平，張煥容*

(1. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2成都大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，成都 610106)

沙門菌是一種無莢膜、無芽胞的革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓。迄今為止，全世界已發(fā)現(xiàn)2 600多種血清型。禽沙門菌病主要有雞傷寒、雞副傷寒、雞白痢等。沙門菌作為一種常見的食源性致病菌，可引起人和動物急性胃腸炎、食物中毒、敗血癥等。沙門菌病的流行不僅阻礙了畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對人類健康及公共衛(wèi)生安全也帶來嚴重威脅。應(yīng)用抗生素是防治沙門菌感染的主要手段之一，但抗生素的長期、廣泛和不合理使用，使沙門菌耐藥性日益增強，導(dǎo)致抗菌藥物的治療效果大大下降。尋找新型殺菌物質(zhì)替代抗生素，從而有效防治沙門菌病已成為研究熱點。

噬菌體是一種能夠特異性裂解細菌的病毒，具有嚴格的宿主特異性，能夠殺滅宿主細胞且不產(chǎn)生耐藥性，具有指數(shù)增殖、廣泛分布、研發(fā)時間短等優(yōu)點。沙門菌噬菌體不會對正常菌群產(chǎn)生影響，也不會對環(huán)境造成污染，屬于天然、安全的抑菌劑。近年來，噬菌體作為一種新型抗菌劑，在食源性病原菌感染防治、控制病原菌的傳播以及治療耐藥性細菌感染等方面都取得了巨大的進展。在耐藥菌株不斷出現(xiàn)、新型抗菌制劑研發(fā)不能滿足耐藥菌控制需要的狀況下，噬菌體防治提供了一個新的方向。地球上約有10個噬菌體，豐富度極高，在一些生態(tài)系統(tǒng)中，噬菌體的數(shù)量大約超過細菌10倍。而目前分離研究的噬菌體遠少于自然界存在的噬菌體，因此，噬菌體的研究仍存在許多未知領(lǐng)域。本研究分離鑒定禽源沙門菌噬菌體，并研究其生物學(xué)特性和基因組信息，以期為研制沙門菌特異性抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

20株沙門菌(2株卡斯特魯普和18株鼠傷寒沙門菌)，編號為1～20，由西南民族大學(xué)微生物實驗室分離鑒定。從成都市某雞場采集污水樣品用于分離噬菌體。胰蛋白胨、酵母提取物、NaCL、瓊脂粉、SM緩沖液、PEG 8000、0.22 μm無菌一次性針頭式濾器、病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司、透射電鏡(型號JEM-1400PLUS，日本電子JEOL)。

1.2 噬菌體的分離鑒定

1.2.1 噬菌體富集 將采集的污水1 000 mL混勻后靜置4 h，收集上層液體，加入CaCl至終濃度1 mol·L，7 000 ×離心15 min，取100 mL上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，得到濾液。將上述100 mL濾液加入100 mL 2×LB液體培養(yǎng)基于500 mL 的滅菌錐形瓶中混合，同時加入1 mL對數(shù)生長期的宿主菌沙門菌(濃度1×10CFU·mL)，160 r·min、 37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。

培養(yǎng)液經(jīng)6 000 ×離心15 min，取上清，0.22 μm 濾膜過濾除菌得到濾液，分別加入100 μL處于對數(shù)生長期的20株指示菌(濃度1×10CFU·mL) 混勻，160 r·min、37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。此富集過程重復(fù)3次，得到疑含噬菌體的培養(yǎng)液。

1.2.2 雙層瓊脂平板法驗證 取10 mL無菌EP管，吸取200 μL疑含噬菌體的培養(yǎng)液和100 μL指示菌(濃度1×10CFU·mL)，室溫孵育5 min， 加入6 mL的50 ℃左右的LB半固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨1 g、酵母0.5 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂0.75 g， 以100 mL培養(yǎng)基為例)，充分混勻后迅速倒入LB固體平板中，待其凝固后形成雙層瓊脂平板，倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，觀察噬菌斑的形成情況。

1.2.3 噬菌體的純化 采用雙層瓊脂平板法純化初次分離的噬菌體。選取形狀規(guī)則、透亮、邊緣整齊的單個噬菌斑，用接種環(huán)挑取并浸泡于500 μL的SM緩沖液中，4 ℃過夜，次日取出10 μL浸出液適當(dāng)稀釋，采用雙層瓊脂平板法得到第一代純化后的噬菌體。重復(fù)以上方法進行連續(xù)多次培養(yǎng)，待瓊脂板上的噬菌斑透亮，形態(tài)、大小一致，純化6代以上，得到純化的噬菌體。

1.3 噬菌體生物學(xué)特性研究

1.3.1 噬菌體裂解譜測定 以雙層平板噬斑法檢測噬菌體對20株不同血清型的禽源沙門菌的裂解情況。取10 mL無菌EP管，吸取200 μL噬菌體裂解液和100 μL宿主菌菌液(濃度1×10CFU·mL)，室溫孵育5 min，加入6 mL的50 ℃左右的LB半固體培養(yǎng)基，充分混勻后迅速倒入LB固體中，待其凝固后倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)8～10 h，觀察有無噬菌斑形成。

1.3.2 噬菌體效價測定 取純化后的噬菌體裂解液100 μL10倍連續(xù)稀釋，加入100 μL宿主菌菌液混合均勻，混合物接種雙層瓊脂平板后培養(yǎng)8 ～ 10 h，測定噬菌斑數(shù)量，根據(jù)公式計算噬菌體效價。每個稀釋度重復(fù)3次。噬菌體效價(PFU·mL)=噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。

1.3.3 噬菌體透射電鏡觀察 取噬菌體懸液10 μL (1×10PFU·mL)滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min， 立即用濾紙吸干，用2 %磷鎢酸溶液染色5 min， 濾紙吸去染液，待其自然干燥后，置于透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)。

1.3.4 噬菌體熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性測定 取裝有130 μL噬菌體裂解液(1×10PFU·mL)EP管分別于30、40、50、60、70、80 ℃水浴中作用30和60 min，水浴結(jié)束后，立即將EP管冰浴冷卻至室溫，進行適當(dāng)稀釋，采用雙層瓊脂平板法，測定噬菌體效價，評價噬菌體對溫度的耐受性。試驗重復(fù)3次。

用鹽酸(1 mol·L)和氫氧化鈉溶液(1 mol·L) 調(diào)節(jié)LB液體培養(yǎng)基的pH分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13，然后分別吸取100 μL 噬菌體裂解液(約10PFU·mL)加入900 μL不同pH的LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫水浴鍋中作用1 h。作用完畢，將混合液進行10倍連續(xù)稀釋，用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價，評價噬菌體的pH穩(wěn)定性。試驗重復(fù)3次。

1.3.5 最佳感染復(fù)數(shù)測定 將細菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約1×10CFU·mL)，用平板計數(shù)法測定菌液濃度，重復(fù)3次取其平均值。將噬菌體裂解液和菌液，按感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000的比例混合，混合液置160 r·min、37 ℃搖床培養(yǎng)6 h。用0.22 μm的濾器過濾除菌后得到噬菌體，采用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價。以噬菌體效價最高的比例為最佳感染復(fù)數(shù)。試驗重復(fù)3次。

1.3.6 一步生長曲線測定 按最佳MOI 0.000 1，加入500 μL的菌液和500 μL的噬菌體裂解液，混勻后，在37 ℃條件下，靜置孵育15 min，6 800 ×離心5 min，棄上清，用LB液體培養(yǎng)基洗滌兩次；6 800×離心5 min，棄上清，加入5 mL 37 ℃預(yù)熱LB液體培養(yǎng)基重懸沉淀，37 ℃恒溫搖床160 r·min振蕩培養(yǎng)；從0～100 min每間隔5～10 min取樣，每個時間點重復(fù)3次取平均值。以感染時間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價為縱坐標(biāo)，繪制一步生長曲線；計算出噬菌體的潛伏期、暴發(fā)期和裂解量，裂解量=暴發(fā)末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度。

1.4 噬菌體分離株生物信息學(xué)分析

1.4.1 噬菌體增殖培養(yǎng)、濃縮及基因組提取 按最佳MOI加入4 mL沙門菌菌液和10 mL噬菌體裂解液，于400 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)18 h。增殖培養(yǎng)后將培養(yǎng)液于4 ℃、6 800 ×的條件下離心20 min，取上清；加入 NaCl使其終濃度為1 mol·L，待其溶解后冰浴1 h，使噬菌體顆粒和細菌碎片分離；培養(yǎng)物在4 ℃、 6 800×的條件下離心20 min，將上清液移至滅菌的錐形瓶中，按10%的比例加入PEG 8000，上下顛倒使其充分溶解，注意動作輕緩，過夜冰浴使噬菌體顆粒充分形成沉淀；次日，將培養(yǎng)物在10 000×、 4 ℃條件下離心10 min回收噬菌體顆粒，棄上清后，將離心管倒置流干多余液體，加入2 mL SM緩沖液重懸沉淀；噬菌體液經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后，按1∶1的比例加入2 mL氯仿緩慢震蕩1 min， 在蛋白質(zhì)與氯仿充分作用后在4 ℃、960 ×條件下離心15 min，此步驟重復(fù)操作2～3次，除去噬菌體裂解液中的蛋白質(zhì)，最后得到噬菌體濃縮液，用于噬菌體基因組的提取。用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取噬菌體基因組，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取基因組純度，且用于測序的基因組含量≥2 μg。

1.4.2 全基因組測序及生物信息學(xué)分析 委托賽默百合生物科技有限公司對提取的噬菌體基因組進行全基因組測序，并對噬菌體基因組進行拼接，得到完整的基因組序列。應(yīng)用EditSeq對全基因組組分分析；采用tRNAscan-SE 預(yù)測全基因組中的tRNA； 使用ORF finder預(yù)測噬菌體的ORF，用Smart Blast對預(yù)測的ORF進行驗證并注釋，進行堿基序列相似性比對及編碼基因的注釋。最后將基因組上傳至 NCBI獲得序列號。選擇噬菌體全基因組序列中的末端大亞基酶基因序列在NCBI中進行比對，用MEGA7.0軟件構(gòu)建進化樹，和其他同源性較高噬菌體的末端大亞基酶核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，選取親緣性較近的9個沙門噬菌體的內(nèi)溶素基因序列，在移除終止密碼子后，使用ClustalW進行比對；比對結(jié)果導(dǎo)入Datamonkey，根據(jù)官網(wǎng)推薦選擇FEL方法，在分支選擇時選擇所有，最后計算每個密碼子的KaKs均值，檢測選擇位點。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體的分離鑒定及生物學(xué)特性

2.1.1 噬菌體分離純化結(jié)果 采用雙層瓊脂平板法，以20株沙門菌為指示菌，從污水樣本中分離出1株噬菌體。純化6代后,在雙層瓊脂平板上形成形狀規(guī)則、邊緣整齊、大小相近的透明噬菌斑，直徑約為1.5 mm(圖1)，將分離得到的噬菌體命名為S5。

圖1 噬菌體S5噬菌斑Fig.1 Plaque of phage S5

2.1.2 噬菌體裂解譜 噬菌體S5可成功裂解20株沙門菌中的15株，包含2株卡斯特魯普和13株鼠傷寒沙門菌。表明噬菌體S5能裂解兩種不同血清型的沙門菌，裂解率達到75%(15/20)，其裂解譜較廣，屬于寬裂解譜噬菌體。

2.1.3 噬菌體效價 噬菌體S5純化6代后，將噬菌體裂解液10倍連續(xù)稀釋，通過雙層瓊脂平板法測得噬菌體S5效價為8×10PFU·mL。

2.1.4 噬菌體透射電鏡觀察結(jié)果 噬菌體負染后透射電鏡觀察，結(jié)果如圖2所示，噬菌體S5頭部呈正二十面體對稱，直徑為50 nm，具有一長度為200 nm的尾部。根據(jù)國際病毒分類委員會分類規(guī)則，該噬菌體屬于有尾噬菌體目、長尾噬菌體科的成員。

圖2 噬菌體S5透射電鏡圖Fig.2 Transmission electron micrograph of phage S5

2.1.5 噬菌體熱穩(wěn)定性 溫度對噬菌體S5的影響結(jié)果如圖3所示，在30～60 ℃，噬菌體S5活性基本保持穩(wěn)定，具有較好的耐熱性。當(dāng)溫度高于60 ℃時，噬菌體效價隨著溫度的升高而降低，作用的時間越長則效價越低；當(dāng)作用溫度高達70和80 ℃時，噬菌體失活。

圖3 噬菌體S5的熱穩(wěn)定性測定Fig.3 Determination of thermal stability of phage S5

2.1.6 噬菌體對酸堿的耐受性 噬菌體的活性隨不同的酸堿環(huán)境發(fā)生變化。由圖4可知，噬菌體S5經(jīng)不同pH作用1 h后，在pH 4.0～11.0時酸堿度對其活性影響不大，在pH 9.0～11.0時噬菌體活性達到最高，為最適pH；當(dāng)在pH 1.0～3.0和pH 13.0時，噬菌體活性完全喪失，結(jié)果顯示噬菌體S5對酸堿耐受性較好。

圖4 噬菌體S5的pH穩(wěn)定性測定Fig.4 Determination of pH stability of phage S5

2.1.7 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù) 最佳感染復(fù)數(shù)測定結(jié)果顯示，當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.000 1時，噬菌體效價最高，達到2.5×10PFU·mL。當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.000 1時，噬菌體S5感染宿主菌后噬菌體效價增殖倍數(shù)為4.16×10(噬菌體增殖倍數(shù)=增殖噬菌體數(shù)÷最初噬菌體數(shù))。因此噬菌體S5的最佳感染復(fù)數(shù)為0.000 1。

2.1.8 噬菌體一步生長曲線 按照MOI為0.000 1的比例繪制的一步生長曲線,如圖5所示。噬菌體感染宿主菌后5 min內(nèi)(潛伏期)效價基本保持不變；在感染宿主菌后5～100 min內(nèi)，噬菌體大量增殖，暴發(fā)期約為95 min，平均裂解量為50 PFU·cell。

圖5 噬菌體S5的一步生長曲線測定Fig.5 One-step growth curve determination of phage S5

2.2 噬菌體生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 提取的噬菌體基因組 提取的噬菌體基因組進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，1%的瓊脂糖凝膠檢測片段>5 000 bp(圖6所示)。

M. DL5000相對分子質(zhì)量標(biāo)準；1.噬菌體DNAM. DL5000 marker; 1. Phage DNA圖6 噬菌體基因組電泳鑒定結(jié)果Fig.6 ElectropHoresis identification results of phage DNA

2.2.2 噬菌體全基因組生物信息學(xué)及編碼氨基酸的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 經(jīng)全基因組測序及生物信息學(xué)分析，噬菌體S5基因組序列全長為72 519 bp。堿基分布為A(29.84%)、T(30.71%)、G(19.53%)、C(19.91%)，GC 平均含量為39.45%，核酸類型為線型dsDNA。將噬菌體全基因組核酸序列提交GenBank，獲取的登錄號為OM908766。根據(jù)BLASTn比對，與沙門菌噬菌體phage FSL SP-058(72 394 bp， KC139517.1)和沙門菌噬菌體phage FSL SP-076(72 098 bp，KC139520.1)相似性較高，分別為95.88%、95.93%，覆蓋率均為93%。Blastn結(jié)果顯示，該噬菌體為有尾噬菌體目、長尾噬菌體科。用tRNAscan-SE在線軟件預(yù)測tRNA，發(fā)現(xiàn)噬菌體基因組上含有9個編碼tRNA的序列，分別轉(zhuǎn)運Arg(精氨酸)、Asn(天冬酰胺)、Ser(絲氨酸)、Ile(異亮氨酸)、Met(蛋氨酸)、Ser(絲氨酸)、Tyr(酪氨酸)、轉(zhuǎn)運Pro(脯氨酸)。預(yù)測的結(jié)構(gòu)如圖7所示。噬菌體基因組中的tRNA能彌補宿主菌中缺少的tRNA，使得噬菌體可以提高翻譯裂解酶等蛋白質(zhì)的效率。有研究表明，裂解性噬菌體比溫和性噬菌體含有更多的tRNA，tRNA越多噬菌體的裂解性越強。因此，噬菌體S5是一株烈性噬菌體。

A.編號1預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；B.編號2預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；C.編號3預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；D.編號4預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；E.編號5預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；F.編號6預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；G.編號7預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；H.編號8預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)；I.編號9預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)A. Predicted Id1 tRNA structure; B. Predicted Id2 tRNA structure; C. Predicted Id3 tRNA structure; D. Predicted Id4 tRNA structure; E. Predicted Id5 tRNA structure; F. Predicted Id6 tRNA structure; G. Predicted Id7 tRNA structure; H. Predicted Id8 tRNA structure; I. Predicted Id9 tRNA structure圖7 噬菌體S5基因組中預(yù)測的tRNA結(jié)構(gòu)Fig.7 Structure of the predicted tRNA in the phage S5 genome

2.2.3 預(yù)測的噬菌體基因組ORF及其功能注釋結(jié)果 將噬菌體S5基因組預(yù)測的ORF在NCBI中進行比對，預(yù)測ORF的起始位置、片段具體長度和功能(詳見OSID開放科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容)。根據(jù)基因組序列共預(yù)測出109個ORF，最長的ORF編碼10 788 aa，最短的ORF編碼79 aa。根據(jù)其功能注釋可將其分為5個模塊：裂解模塊、DNA包裝模塊、結(jié)構(gòu)組成模塊、假定蛋白模塊和核酸復(fù)制與調(diào)控模塊。DNA包裝模塊主要包括protease(ORF23)，噬菌體結(jié)構(gòu)組成模塊主要包括tailspike protein(ORF20、ORF21)、major coasid protein(ORF33)、domain-containing protein(ORF48)，這些蛋白組成了噬菌體的頭部、頸部和尾部，尾部纖維蛋白有助于噬菌體吸附宿主菌，尾部附著催化劑還能在細胞壁上形成空洞，把遺傳物質(zhì)注入宿主細胞內(nèi)。核酸代謝與復(fù)制模塊包括virion RNA polymerase(ORF39)、single-standed DNA binding protein(ORF46)、AAA family ATPase(ORF47)、putative flavin-dependent thymidylate synthase(ORF51)、ATP-dependent DNA helicase dda(ORF56)、Serine/threonine-protein phosphatase(ORF59)、Deoxyuridine 5′-triphosphate nucleotidohydrolase(ORF73)等。與噬菌體裂解功能相關(guān)的基因有l(wèi)ysis protein(ORF26)、endolysin(ORF27)等。其中,內(nèi)溶素(endolysin)是噬菌體編碼的一類能夠裂解細菌的細胞壁水解酶，在噬菌體感染細菌的后期發(fā)揮重要作用，它能從細菌內(nèi)部迅速裂解細菌細胞壁，幫助子代噬菌體釋放到胞外。內(nèi)溶素具有快速和獨特的作用方式、殺滅病原體的高度特異性、細菌耐藥性發(fā)展的低概率和蛋白質(zhì)性質(zhì)。其中,還有85個假定蛋白未知其功能，還需要進一步研究證實，其可視化基因組注釋圖譜如圖8所示。

圖8 噬菌體S5基因組注釋圖譜Fig.8 Genome annotation map of phage S5

2.2.4 噬菌體S5的同源性分析結(jié)果 選取噬菌體裂解蛋白的末端大亞基酶(terminase large subunit)基因序列，和其他同源性較高的噬菌體的末端大亞基酶序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，找出親緣性較近的噬菌體。結(jié)果如圖9所示。從圖中可以看出，噬菌體S5與phage FSL SP-076親緣關(guān)系最近，且在同一分支上，可能是因為其宿主菌相同且都屬有尾噬菌體目、長尾噬菌體科。

圖9 噬菌體S5進化樹Fig.9 Phylogenetic tree of phage S5

2.2.5 噬菌體S5內(nèi)溶素基因的選擇壓力分析結(jié)果 利用NCBI選取與噬菌體S5親緣性較近的9株沙門菌噬菌體，將Endolysin基因序列移除終止密碼子以后，使用ClustalW進行比對；比對結(jié)果導(dǎo)入Datamonkey，根據(jù)官網(wǎng)推薦選擇FEL方法，選擇所有分支，最后計算出每個密碼子的KaKs均值。

將噬菌體S5的內(nèi)溶素基因的序列經(jīng)Datamonkey檢測分析可知，沒有正向選擇位點和中性選擇點數(shù)，計算出輸入序列的240個密碼子的KaKs值，根據(jù)≤0.1過濾，得到62個氨基酸位點。所有位點都受到負選擇壓力，其結(jié)果表明，內(nèi)溶素(endolysin)是噬菌體編碼的一類能夠裂解細菌的細胞壁水解酶，在噬菌體功能基因中非常重要，在感染細菌的后期發(fā)揮著重要作用，不會發(fā)生可能影響蛋白質(zhì)功能的非同義突變。

3 討 論

本研究分離的1株效價較高的寬裂解譜沙門菌烈性噬菌體S5，其溫度及酸堿耐受能力強于趙影等、Ahiwale等分離的沙門菌噬菌體。若作為噬菌體制劑，基本不會受胃酸的影響，也可以抵抗較高的環(huán)境溫度。噬菌體S5的最佳MOI為0.000 1，表明該噬菌體在較低濃度下就能起到高效的殺菌作用。MOI是研究噬菌體投入與產(chǎn)出量效關(guān)系的重要指標(biāo),較低的感染復(fù)數(shù)會降低應(yīng)用成本，利于噬菌體產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。噬菌體S5潛伏期約為5 min，表明噬菌體的復(fù)制效率高，裂解細菌的速度快。其暴發(fā)期約為95 min，平均裂解量為50 PFU·cell。與楊心怡等和王杰等分離出的噬菌體相比，S5潛伏期短，暴發(fā)期更長，裂解量大，能夠在較短時間內(nèi)殺死大量沙門菌，對沙門菌噬菌體的應(yīng)用有積極意義。

用于生物防治的烈性噬菌體必須遺傳背景清楚、殺菌能力強且不攜帶有害基因，否則可能造成有害基因在細菌間水平轉(zhuǎn)移。本研究對沙門菌噬菌體S5進行全基因組生物信息學(xué)分析，預(yù)測到109個ORF，其中ORF27為編碼內(nèi)溶素(endolysin)的基因，內(nèi)溶素是裂解酶的一種，噬菌體感染初期利用裂解酶降解細菌細胞壁肽聚糖從內(nèi)部裂解宿主菌。本研究分離鑒定的噬菌體S5基因組上含有9個編碼tRNA的序列，是一種強裂解性噬菌體。有研究表明，擁有tRNA基因的噬菌體，其宿主范圍較廣，而不是簡單地感染一個特定的宿主，噬菌體S5能裂解卡斯特魯普和鼠傷寒兩種不同血清型的沙門菌也證實了這一結(jié)論。噬菌體S5未發(fā)現(xiàn)攜帶任何已知的溶源性相關(guān)基因，如編碼整合酶(integrase)或阻遏蛋白(repressors)等的基因，利用ResFinder預(yù)測噬菌體S5基因組中無抗生素抗性基因，利用ViruG lenceFinder預(yù)測噬菌體S5基因組中不存在毒力基因，該結(jié)果從遺傳背景上證實噬菌體S5應(yīng)用于菌體治療應(yīng)該是安全的。

4 結(jié) 論

分離鑒定了1株寬譜高效價的沙門菌烈性噬菌體，具有較寬的溫度以及酸堿耐受范圍、繁殖活性強的特性。全基因組序列測定結(jié)果表明，該噬菌體攜帶9個編碼tRNA的基因序列，且未發(fā)現(xiàn)攜帶任何編碼抗生素耐藥因子、細菌毒力因子等有害產(chǎn)物的基因，具有較高的應(yīng)用安全性，為進一步開發(fā)沙門菌噬菌體制劑提供了科學(xué)依據(jù)。