富營(yíng)養(yǎng)飲食重塑代謝性疾病易感豬關(guān)鍵組織mRNA剪接模式研究

夏博策，張凱藝，苗佳坤，彭煥祺，楊 宇，陶 聰，吳添文，王彥芳，楊述林

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

富營(yíng)養(yǎng)飲食和缺乏鍛煉引起的肥胖及相關(guān)代謝性疾病，如：2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)、代謝性脂肪性肝病、高血壓和心血管疾病等嚴(yán)重危害人類健康。動(dòng)物模型是研究人類疾病的重要手段，相比研究較多的嚙齒類動(dòng)物，豬與人類的生理特征更相似，更適宜于人類代謝相關(guān)疾病的轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究。已有研究表明，可通過高脂高糖飲食誘導(dǎo)豬模擬人類富營(yíng)養(yǎng)飲食引起的代謝性疾病發(fā)生發(fā)展過程，進(jìn)而探究其分子病理機(jī)制。

可變剪接(alternative splicing，AS)是指一個(gè)基因的pre-mRNA通過不同剪接方式形成一個(gè)或多個(gè)成熟mRNA的過程。AS類型主要包括5種，即外顯子跳躍(skipped exon，SE)、內(nèi)含子保留(retained intron，RI)、外顯子互斥(mutually exclusive exon，MXE)、5′端可變剪接位點(diǎn)(alternative 5′ splice site，A5SS)、3′端可變剪接位點(diǎn)(alternative 3′ splice site，A3SS)。AS普遍發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄過程中，研究表明哺乳動(dòng)物90%以上的基因可通過AS形成多個(gè)可變剪接體，大多數(shù)發(fā)生AS的基因存在主要可變剪接體，但次要可變剪接體可能會(huì)存在不同作用，甚至?xí)鸺膊?。已有研究表明，代謝性疾病中的重點(diǎn)基因存在AS，其中瘦素受體(leptin receptor，Lep-R)存在5種可變剪接體，其較長(zhǎng)可變剪接體-能夠結(jié)合瘦素參與能量動(dòng)態(tài)平衡，而較短可變剪接體-、-和-降解瘦素，減少瘦素信號(hào)；胰島素受體(insulin receptor，IR)在人類中存在兩種可變剪接體，可變剪接體-通常存在于胎兒階段，其增加與糖尿病和高血壓相關(guān)，可變剪接體-通常存在于成年階段，其在體重減輕時(shí)表達(dá)量增加。剪接因子(splicing factors，SFs)是一類RNA結(jié)合蛋白，參與AS的調(diào)控。代謝性疾病相關(guān)SFs可被用作疾病的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，二甲雙胍是一種用于治療T2DM的藥物，可以通過激活和下調(diào)來修飾mRNA的AS；剪接因子1可以調(diào)控外顯子跳躍，在其小分子抑制劑ABX300作用下可改變?nèi)N可變剪接體水平，從而抑制肥胖的發(fā)生。綜上表明，AS在代謝性疾病研究中具有重要意義。

目前，對(duì)于代謝性疾病的轉(zhuǎn)錄組大多數(shù)分析只停留在mRNA表達(dá)水平，然而越來越多的研究提示，AS可能是T2DM等代謝性疾病中的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)因素。對(duì)于代謝性疾病AS研究，單個(gè)基因AS研究較多，而整體AS特征研究少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期通過CRISPR/Cas9 技術(shù)將3個(gè)人源T2DM和NAFLD疾病風(fēng)險(xiǎn)基因、和3轉(zhuǎn)入巴馬小型豬內(nèi)，轉(zhuǎn)三基因豬表現(xiàn)出糖耐量受損、脂肪組織炎癥、肝炎癥、胰腺脂質(zhì)浸潤(rùn)以及胰島肥大等早期代謝性疾病特征，并且與人類代謝性疾病具有高度相似性，成功構(gòu)建了代謝性疾病易感豬模型。

本研究將基于TG-HFHSD和TG-CD組的脂肪、肝、肌肉和下丘腦組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，鑒定AS事件和分析差異剪接基因(differential splicing genes，DSGs)富集到的功能和信號(hào)通路，并著重尋找潛在調(diào)控肝代謝相關(guān)差異AS事件的SFs，旨在為富營(yíng)養(yǎng)飲食條件下代謝性疾病早期發(fā)生機(jī)制解析提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用健康狀態(tài)、月齡和體重相同的12頭代謝性疾病易感公豬(轉(zhuǎn)、和3基因豬)作為試驗(yàn)豬，正常飼料飼喂9個(gè)月后，隨機(jī)將試驗(yàn)豬分為兩組，其中8頭試驗(yàn)豬飼喂高脂高能量飼料(37%蔗糖、53%基礎(chǔ)日糧和10%豬油)2個(gè)月作為富營(yíng)養(yǎng)飲食組(TG-HFHSD)，4頭試驗(yàn)豬飼喂正常飼料2個(gè)月作為對(duì)照飲食組(TG-CD)。試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)組平均體重較對(duì)照組平均體重高，血清學(xué)中TC等部分代謝性疾病相關(guān)指標(biāo)存在顯著差異。動(dòng)物安樂死后，收集脂肪、肝、肌肉和下丘腦組織樣本，并立即將其置于液氮中保存。本研究中的巴馬小型豬試驗(yàn)均經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可(許可證號(hào)：IAS2019-12)，單欄飼養(yǎng)，每日定時(shí)飼喂2次， 自由飲水，溫度16～28 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2 試驗(yàn)豬4種代謝相關(guān)組織RNA-seq測(cè)序

TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))法提取TG-HFHSD和TG-CD組試驗(yàn)豬脂肪、肝、肌肉和下丘腦組織總RNA后，利用NanoPhotometer spectrophotometer儀器(IMPLEN，美國(guó))和Agilent 2100 bioanalyzer儀器(Agilent，美國(guó))檢測(cè)RNA純度(OD/OD及OD/OD比值)，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性(28S、18S、5S三條帶存在，并且28S是18S的兩倍左右)。NEBNextUltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒(NEB，美國(guó))進(jìn)行cDNA文庫構(gòu)建，Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent，美國(guó))對(duì)cDNA文庫進(jìn)行質(zhì)檢，在北京諾禾致源有限公司Illumina HiSeq X 平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序序列讀數(shù)(reads)為150 bp。

1.3 試驗(yàn)豬4種代謝相關(guān)組織測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控比對(duì)和可變剪接分析

TG-HFHSD和TG-CD組試驗(yàn)豬脂肪、肝、肌肉和下丘腦組織的原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw data)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查后得到高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)(clean data)。HISAT2 v2.0.5作為基因組比對(duì)工具，將clean data比對(duì)到Ensemble數(shù)據(jù)庫豬參考基因組Sscrofa11.1(網(wǎng)址ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/sus_scrofa/)。StringTie(1.3.3b)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接，F(xiàn)PKM值作為基因表達(dá)水平單位。

rMATS v3.2.3是一種AS分析軟件，主要檢測(cè)SE、RI、MXE、A5SS和A3SS五種AS事件，可分析各組織樣品的AS事件以及對(duì)應(yīng)PSI值，并計(jì)算組間剪接差異值和矯正值。使用Draw Venn Diagram網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)組織間和組織內(nèi)AS基因進(jìn)行Venn分析，并繪制相關(guān)Venn圖。

1.4 試驗(yàn)豬4種代謝相關(guān)組織DSGs的GO和KEGG富集分析

g:Profiler網(wǎng)站(https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)基于Ensemble數(shù)據(jù)庫，使用網(wǎng)站中的g:GOSt工具可對(duì)輸入TG-HFHSD和TG-CD組脂肪、肝、肌肉和下丘腦組織組間DSGs集進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，并計(jì)算矯正值,篩選顯著富集GO條目和KEGG通路，采用矯正值小于0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)。使用Hipolt網(wǎng)站(https://hiplot.com.cn)中的氣泡圖工具繪制GO和KEGG氣泡圖。STRING網(wǎng)站(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl)分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，使用其中的Network-Analyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，連接度(degree)大于14的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是網(wǎng)絡(luò)中的樞紐節(jié)點(diǎn)。

1.5 試驗(yàn)豬肝組織SFs獲取與差異分析

通過AmiGO2網(wǎng)站(http://amigo.geneontology.org/amigo/landing)和NCBI網(wǎng)站中人和豬基因組功能注釋搜索與AS調(diào)控相關(guān)基因來獲取SFs。使用DESeq2(1.16.1)軟件分析TG-HFHSD和TG-CD組試驗(yàn)豬肝組織組間差異表達(dá)SFs，計(jì)算組間基因表達(dá)差異值和矯正值。使用Hipolt網(wǎng)站(https://hiplot.com.cn)中的火山圖工具繪制基因水平SFs火山圖。

1.6 試驗(yàn)豬肝組織SFs與AS的皮爾遜相關(guān)性分析

使用R語言中皮爾遜相關(guān)性檢驗(yàn)函數(shù)cor.test計(jì)算差異TG-HFHSD和TG-CD組肝組織組間差異SFs mRNA表達(dá)水平FPKM值與組間差異AS事件PSI值的相關(guān)性，以<0.001和|r|>0.95為相關(guān)性篩選條件。Cytoscape軟件繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，使用NetworkAnalyzer功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，連接度(degree)大于14的節(jié)點(diǎn)被認(rèn)為是網(wǎng)絡(luò)中的樞紐節(jié)點(diǎn)。

1.7 試驗(yàn)豬肝組織AS事件的半定量PCR驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Ensemble上的22序列(序列號(hào)：ENSSSCT00000063346)和1序列(序列號(hào)：ENSSSCT00000029403)，利用NCBI Primer-BLAST針對(duì)其發(fā)生AS的位置設(shè)計(jì)引物U2AF2-P和THOC1-P(兩個(gè)基因引物均可產(chǎn)生兩種長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物)，引物序列見表1。以試驗(yàn)豬肝組織cDNA 為模板，利用高保真酶2×Phanta@ Max Master Mix(Vazyme，中國(guó))的50 μL體系擴(kuò)增，高保真酶反應(yīng)體系(Vazyme，中國(guó))：2×Phanta Mix 25 μL,cDNA模板2 μL，正、反向引物各2 μL,ddHO 19 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min, 95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s/kb，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。 產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將不同長(zhǎng)度片段分別切膠回收送至北京擎科生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1 試驗(yàn)豬4種代謝相關(guān)組織的AS總體分布特征

原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw data)經(jīng)質(zhì)檢后得到高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)(clean data)， 平均每個(gè)組織樣品clean data 可達(dá)8 ～11.45 GB。所有樣品平均GC含量為51.71%，平均Q30大于94%，數(shù)據(jù)過濾后的clean data可用于后續(xù)分析。利用rMATS軟件鑒定AS事件，結(jié)果在試驗(yàn)豬脂肪、肝、肌肉和下丘腦中分別鑒定到48 279、39 536、47 888和52 210個(gè)AS事件，分別發(fā)生在10 757、9 421、10 023和11 323個(gè)AS基因中，平均每個(gè)基因發(fā)生的AS事件數(shù)分別為4.49、4.20、4.78和4.61個(gè)，可以發(fā)現(xiàn)下丘腦的AS事件和AS基因最多，肝的AS事件和AS基因最少，并且每個(gè)基因平均可產(chǎn)生4個(gè)以上的AS事件。4種組織鑒定到的5種AS類型中，SE類型事件占比最高，達(dá)到77.09%～78.29%，RI、MXE、A5SS和A3SS類型分別為2.28%～2.77%、14.34%～15.26%、1.67%～1.98%、2.97%～3.40%。

通過對(duì)AS基因進(jìn)行venn分析，發(fā)現(xiàn)AS基因大部分是4個(gè)組織共有的，可達(dá)66.77%～80.25%。而各組織特有的AS基因占比較少，僅有3.41%～9.75%(圖1e)。各組織中只發(fā)生1種AS類型的基因占發(fā)生AS總基因比例為54.59%～56.97%，其中只發(fā)生SE類型的基因最多；發(fā)生2～4種AS類型的基因占比為42.61%～44.87%，其中SE和MXE類型共發(fā)生的基因最多；發(fā)生5種AS類型的基因占比為0.42%～0.56%(圖1a-d)。

a.b.c.d.肝、肌肉、脂肪和下丘腦中5種AS類型的基因Venn圖；e. 4種組織總AS基因Venn圖a.b,c,d. The Venn diagrams of the 5 AS types of genes in liver, muscle, adipose and hypothalamus, respectively; e. The Venn diagram of the AS genes of the 4 tissues圖1 AS基因的Venn分析Fig.1 The Venn analysis of AS genes

2.2 TG-HFHSD和TG-CD組4種代謝相關(guān)組織間DSGs的分布特征

以<0.05篩選TG-HFHSD和TG-CD的組間DSGs，脂肪、肝、肌肉和下丘腦中分別得到528、1 070、 570和600個(gè)DSGs。脂肪組織中鑒定到的SE、RI、MXE、A5SS和A3SS事件分別為346(65.53%)、 28(5.30%)、110(20.83%)、13(2.46%)和31(5.87%)個(gè)；肝組織中鑒定到的SE、RI、MXE、A5SS和A3SS事件分別為329(30.75%)、177(16.54%)、471(44.02%)、34(3.18%)和59(5.51%) 個(gè)；肌肉組織中鑒定到的SE、RI、MXE、A5SS和A3SS事件分別為390(68.42%)、20(3.51%)、 102(17.89%)、23(4.04%)和35(6.14%) 個(gè)；下丘腦組織中鑒定到的SE、RI、MXE、A5SS和A3SS事件分別為448(74.67%)、12(2.00%)、99(16.50%)17(2.83%)和24(4.00%)個(gè)(圖2)。各組織綜合比較顯示，除肝以MXE類型為主，其余組織都是以SE類型為主，肝中大幅增加的DSGs主要分布在RI和MXE兩種類型。

圖2 4種組織5種類型DSGsFig.2 5 types of DSGs in the 4 tissues

2.3 TG-HFHSD和TG-CD組4種代謝相關(guān)組織間DSGs的富集分析

對(duì)TG-HFHSD和TG-CD組的脂肪、肝、肌肉和下丘腦中的DSGs進(jìn)行富集分析，得出脂肪、肌肉和下丘腦的DSGs主要顯著富集在細(xì)胞內(nèi)解剖結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器等與細(xì)胞組成相關(guān)的GO條目。肝DSGs除富集到上述細(xì)胞組成相關(guān)的GO條目外，還顯著富集到代謝、可變剪接和DNA損傷修復(fù)3個(gè)方面的GO條目中。代謝相關(guān)的GO條目包括，代謝過程、基礎(chǔ)代謝過程、脂質(zhì)代謝、脂肪酸代謝過程、線粒體、過氧化物酶體、α-氨基酸代謝過程、核糖核蛋白復(fù)合物；可變剪接相關(guān)的GO條目包括，通過剪接體調(diào)控mRNA剪接、mRNA加工的調(diào)控、mRNA結(jié)合、mRNA代謝過程調(diào)控、磷酸核苷代謝過程；DNA損傷修復(fù)相關(guān)的GO條目包括，DNA損傷刺激的反應(yīng)、DNA修復(fù)調(diào)控(圖3a)。KEGG通路顯著富集到代謝、免疫及可變剪接相關(guān)的3個(gè)方面，其中代謝相關(guān)通路包括，代謝途徑、丙酮酸代謝、抗壞血酸和醛糖酸代謝、乙醛酸和二羥酸代謝、脂肪酸降解、過氧化物酶體；免疫炎癥相關(guān)通路主要是補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)等；可變剪接相關(guān)通路主要是剪接體等(圖3b)。

圖3 肝DSGs的GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of DSGs in liver

肝DSGs富集分析中，GO分析富集到代謝過程(GO:0008152)的DSGs有553個(gè)，KEGG分析中富集到代謝途徑信號(hào)通路(KEGG:01100)的DSGs有152個(gè)，兩者進(jìn)行venn分析獲得579個(gè)與代謝相關(guān)的DSGs。將579個(gè)代謝相關(guān)的DSGs進(jìn)行STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，獲得一個(gè)有327個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 114個(gè)邊的互作網(wǎng)絡(luò)，以連接度(degree)大于14篩選網(wǎng)絡(luò)樞紐(hub)基因，主要包括3個(gè)方面，一是與剪接調(diào)控有關(guān)的基因25、3B1、7、17、、；二是與代謝相關(guān)的基因、1、1、、2、1、17B4；三是與凝血和纖溶相關(guān)的基因2、2、、(圖4)。

圖4 肝代謝相關(guān)DSGs的STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 STRING protein interaction network analysis of DSGs related to liver metabolism

2.4 TG-HFHSD和TG-CD組肝組織組間差異SFs的分析

SFs是調(diào)控AS的重要基因。通過AmiGO2網(wǎng)站和NCBI網(wǎng)站中人和豬基因功能富集和注釋查詢到355個(gè)SFs。在TG-HFHSD和TG-CD組肝RNA-seq數(shù)據(jù)中，通過<0.05和|log(FC)|>1篩選得到56個(gè)組間mRNA水平差異表達(dá)的SFs，其中上調(diào)SFs有46個(gè)，下調(diào)SFs有10個(gè)，其中40B上調(diào)倍數(shù)最高和3下調(diào)倍數(shù)最低(圖5a)；通過<0.05篩選得到49個(gè)組間AS水平差異的SFs。將56個(gè)mRNA水平差異的SFs與49個(gè)AS水平差異的SFs進(jìn)行Venn分析，存在11個(gè)mRNA水平和AS水平都差異的SFs(圖5b)，這些兩個(gè)水平均差異的SFs可能既可以對(duì)其他基因進(jìn)行剪接調(diào)控，又可以對(duì)其自身進(jìn)行剪接調(diào)控。

a.SFs的火山圖，圖中已標(biāo)注出|log2(Fold Change)|>2的基因名稱；b.SFs基本特征:DSG_SF指AS水平差異SFs，DEG_SF指基因水平差異SFsa. The volcano map of SFs, and the gene names with |log2(Fold Change)| > 2 are marked in the figure; b. Basic characteristics of SFs: DSG_SF refers to the differential SFs at AS level, and DEG_SF refers to the differential SFs at mRNA level圖5 肝中SFs的mRNA水平和AS水平分析Fig.5 Analysis of mRNA level and AS level of SFs in liver

2.5 TG-HFHSD和TG-CD組肝組織組間差異SFs與組間差異AS的皮爾遜相關(guān)性分析

將TG-HFHSD和TG-CD組肝組織56個(gè)組間mRNA水平表達(dá)差異SFs對(duì)應(yīng)的FPKM值與579個(gè)代謝相關(guān)組間DSGs對(duì)應(yīng)AS事件的PSI值進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，以|r|>0.95和<0.001篩選極顯著相關(guān)關(guān)系，構(gòu)建了12個(gè)重要SFs和222個(gè)差異AS事件的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，其中剪接因子11和是相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)樞紐基因，11和能夠分別與222個(gè)AS事件中的119和115個(gè)存在相關(guān)性，在222個(gè)AS事件中，49個(gè)事件上調(diào)，173個(gè)事件下調(diào)(圖6a)。12個(gè)SFs中的、1、2AF2、25、5、3H13、2A、1、4、1發(fā)生了AS，其中2AF2、25、2A、1發(fā)生差異剪接。SFs與AS事件的相關(guān)性示例中，2、7和2是圖4中STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的hub基因(圖6b)，說明SFs可能會(huì)通過影響關(guān)鍵基因來改變肝整體代謝。

a.SFs與AS事件相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖:中間菱形圖代表SFs，周圍圓形圖代表AS事件;SFs與AS事件之間的連接線，紅色代表正相關(guān)，綠色代表負(fù)相關(guān)。b.SRSF11和SREK1與AS事件C4BPB-RI、CPB2-MXE、SRSF7-SE和AGXT2-MXE的相關(guān)性散點(diǎn)圖:一個(gè)AS事件由基因名稱和AS事件類型組成，例如“C4BPB-RI”中，“C4BPB”為基因名稱，“RI”為AS類型a. Network diagram of the correlation between SFs and AS events: the middle diamonds graph represent SFs, and the surrounding circles represent AS events; the connecting line between SFs and AS event, red represents positive correlation, green represents negative correlation. b. Scatter plot of the correlation between SRSF11 and SREK1 and AS events C4BPB-RI, CPB2-MXE, SRSF7-SE and AGXT2-MXE: An AS event consists of gene name and AS event type, for example, in "C4BPB-RI", "C4BPB" is the gene name, and "RI" is the AS type圖6 肝中SFs與代謝相關(guān)AS的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of SFs and metabolism-related AS in liver

2.6 試驗(yàn)豬肝組織AS事件的驗(yàn)證

通過半定量PCR驗(yàn)證代謝性疾病易感豬肝組織中2AF2和1的AS事件(圖7a)，DNA雙向測(cè)序結(jié)果顯示，2AF2存在外顯子2跳躍事件(圖7b)，1存在內(nèi)含子13保留事件(圖7c)，分別存在兩個(gè)可變剪接體。

a.擴(kuò)增U2AF2和THOC1兩個(gè)可變剪接體以及內(nèi)參基因18S的瓊脂糖凝膠圖；b.U2AF2兩個(gè)可變剪接體反向測(cè)序結(jié)果；c.THOC1兩個(gè)可變剪接體正向測(cè)序結(jié)果a. Agarose gel image of amplified U2AF2 and THOC1 alternative isoforms and the reference gene 18S; b. Reverse sequencing results of two alternative isoforms of U2AF2; c. The results of forward sequencing of the two alternative isoforms of THOC1圖7 肝AS的PCR驗(yàn)證Fig.7 PCR verification of AS in liver

3 討 論

目前為止，AS已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)40多年，基因通過AS產(chǎn)生多個(gè)可變剪接體，使蛋白呈現(xiàn)多樣性，這個(gè)過程幾乎參與了機(jī)體所有的生理活動(dòng)。近幾年AS相關(guān)研究表明，AS與免疫、肥胖和代謝性疾病之間也存在重要聯(lián)系。為探討富營(yíng)養(yǎng)飲食在代謝性疾病發(fā)生過程中對(duì)AS和SFs的影響，本研究以代謝性疾病易感豬為材料，進(jìn)行為期12周的高脂高能量飲食誘導(dǎo)，分析了脂肪、肝、肌肉和下丘腦組織的AS事件，結(jié)果顯示4種組織AS總體特征是相似的，SE在總AS事件中占比最高，這與之前豬和雞的研究結(jié)果一致；也發(fā)現(xiàn)每個(gè)基因平均可發(fā)生4個(gè)以上的AS事件，要高于之前豬睪丸AS研究中的3.67個(gè)，可能是因?yàn)橐赘胸i體內(nèi)代謝性疾病高風(fēng)險(xiǎn)基因效應(yīng)增加了單個(gè)基因的AS事件。在發(fā)生AS的基因中，大多數(shù)基因是4種組織共有的，而各組織特有的AS基因占比較少，也與之前研究一致；發(fā)生多種AS事件的基因占比接近一半，并且在多AS事件的基因中SE和MXE共發(fā)生的基因占比較多，這可能預(yù)示著SE和MXE的發(fā)生機(jī)制存在某種關(guān)聯(lián)性。AS差異分析發(fā)現(xiàn)，肝在DSGs特征上與其他組織明顯不同，肝組織總AS事件最少，但DSGs最多，并且是以MXE為主，不同于其他3種組織以SE為主的特征，RI也較其它組織顯著增加。

對(duì)DSGs進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)，脂肪、肌肉和下丘腦中DSGs主要顯著富集在細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的GO條目，肝DSGs除富集到與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的GO條目外，GO和KEGG還富集到可變剪接及mRNA代謝、脂質(zhì)代謝、DNA損傷及修復(fù)、補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)等過程。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖飲食能夠引起肝DNA損傷，而DNA損傷反應(yīng)可調(diào)節(jié)AS，一些錯(cuò)誤AS產(chǎn)生的錯(cuò)誤可變剪接體可被無義介導(dǎo)降解而未被降解,可變剪接體可能被翻譯從而引起疾病。補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)可參與免疫炎癥過程。將肝中代謝相關(guān)DSGs進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，獲得樞紐基因。這些樞紐基因中，25、3B1、7、17、、是與AS調(diào)控有關(guān)的基因。2、2、、與凝血和纖溶相關(guān)，2是一種凝血酶激活的抗纖溶羧肽酶，2是一種凝血因子，是一種纖溶酶原蛋白，是一種纖維蛋白原。、1、1、、2與線粒體相關(guān)，其中可參與催化線粒體脂肪酸β氧化的第一步，也有研究表明其參與肝損傷機(jī)制；1是一種線粒體定位的酶，與脂質(zhì)代謝、T2DM和體重減輕恢復(fù)相關(guān)。1和17B4與脂肪酸代謝相關(guān)，其中1是脂肪酸β氧化途徑的第一個(gè)酶，失調(diào)會(huì)導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重的微囊性肝脂肪變性和的持續(xù)激活，其可變剪接體1b比1a能更有效的調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)，與甘油三酯在肝細(xì)胞中積累也有一定關(guān)系。結(jié)果表明，12周富營(yíng)養(yǎng)飲食誘導(dǎo)的代謝性疾病易感豬肝組織AS發(fā)生了顯著變化，其中DSGs參與了剪接調(diào)控、脂代謝、DNA損傷、代謝性疾病以及補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)相關(guān)過程。

SFs在AS調(diào)控中起著重要作用，在人類胰島素抵抗肥胖患者肝和輕度或晚期代謝性脂肪性肝病患者中都檢測(cè)到SFs表達(dá)量的改變。本研究在富營(yíng)養(yǎng)飲食誘導(dǎo)下的代謝性疾病易感豬肝中也發(fā)現(xiàn)了mRNA水平表達(dá)差異的SFs。參照文獻(xiàn)中SFs與AS事件皮爾遜相關(guān)性分析的方法，構(gòu)建出mRNA 水平差異SFs與代謝相關(guān)DSGs相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)。篩選到的重要SFs中，1是一種可自我調(diào)節(jié)自身AS的基因，并且與糖酵解有關(guān)；1與膽固醇代謝調(diào)節(jié)相關(guān)；1表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致線粒體功能和DNA損傷增加，也可參與促炎過程；3在非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)患者發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用；13參與脂質(zhì)代謝和高血脂癥相關(guān)的代謝綜合征發(fā)病；2與肝細(xì)胞發(fā)育成熟有關(guān)，并且與酒精性脂肪肝炎(SAH)相關(guān)；-1ɑ與脂質(zhì)代謝、肥胖、胰島素抵抗和NASH相關(guān)；4缺失加劇了高脂誘導(dǎo)的代謝性脂肪性肝病小鼠的肝脂肪變性、胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)，相反，肝4過表達(dá)顯著減輕了兩種不同代謝性脂肪性肝病模型的病理改變?？梢钥闯?，這些SFs與糖脂代謝、代謝性疾病之間有一定關(guān)系，本研究在相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)中篩選到的SFs可能會(huì)是調(diào)控肝AS并影響肝早期異常代謝的潛在基因。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)富營(yíng)養(yǎng)飲食條件下代謝性疾病易感豬脂肪、肝、肌肉和下丘腦的AS分布特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)4種組織都可發(fā)生AS事件的改變，其中肝改變最顯著，主要是RI型和MXE型的改變；富集分析顯示，肝DSGs主要與剪接調(diào)控、脂代謝、DNA損傷以及補(bǔ)體與凝血級(jí)聯(lián)過程相關(guān)；肝差異表達(dá)的SFs也會(huì)影響糖脂代謝和代謝性疾病發(fā)生。綜上表明，AS在富營(yíng)養(yǎng)飲食引起的肝代謝性疾病中具有重要作用，轉(zhuǎn)錄組層面的研究應(yīng)該關(guān)注重要SFs通過調(diào)控肝AS導(dǎo)致代謝異常的機(jī)制，尤其是重要DSGs不同可變剪接體在肝代謝性疾病發(fā)生過程中的作用，將為肝代謝性疾病早期發(fā)生機(jī)制研究提供參考。