β-折疊抗菌肽的研發(fā)及應(yīng)用策略

邵長軒，黨安凱，戰(zhàn)昭含，來振衡，朱永杰，單安山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，哈爾濱150030)

近幾十年來，抗生素在畜牧業(yè)中的不合理使用已導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生和畜產(chǎn)品抗生素殘留問題，這些耐藥菌不僅造成了難以治療的畜禽疾病，還能通過動物相關(guān)食品傳播到人類，嚴(yán)重威脅人類健康，當(dāng)下新型抗生素的研發(fā)速度相比于耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生和變異的速度已趨于緩慢。早在2006年,歐盟就實(shí)行了“飼料全面禁抗”，而在2019年7月10日，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了第194號公告，公布了“全面禁止促生長類藥物飼料添加劑”的決議，因此，尋找綠色、安全、高效的抗生素替代品已經(jīng)成為當(dāng)前迫切需要解決的問題?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)是宿主先天性免疫防御系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的小分子多肽，具有廣譜抗菌、抗病毒、抗癌活性以及免疫調(diào)節(jié)功能，還可促進(jìn)上皮傷口愈合，用于人類疾病的治療。根據(jù)當(dāng)前抗菌肽數(shù)據(jù)庫(Antimicrobial Peptide Database，APD)的最新結(jié)果顯示，目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過3 000種具有多樣序列和結(jié)構(gòu)的天然AMPs，在微生物、植物、無脊椎動物、以及更復(fù)雜的兩棲動物和哺乳動物等多物種中廣泛存在，其主要的物理破膜殺菌機(jī)制使病原體不易對其產(chǎn)生耐藥性突變，因此有望成為新一代抗生素替代物。

抗菌肽的分類依據(jù)多樣，例如：根據(jù)物種來源、合成機(jī)制或分子靶標(biāo)等，但較常見的是基于結(jié)構(gòu)的差異將它們進(jìn)行劃分。如圖1所示，根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的類型，抗菌肽通常被分為4大類，分別是α-螺旋肽；不含α-螺旋和β-折疊成分但通常富含特定氨基酸(如Gly、Arg、Trp或Pro)的線性延伸結(jié)構(gòu)；由一個或多個二硫鍵穩(wěn)定的β-折疊肽；同時包含α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的肽。α-螺旋目前是AMPs中研究的最為深入和廣泛的一類二級結(jié)構(gòu)，但已有研究表明某些α-螺旋肽提取工藝復(fù)雜、細(xì)胞毒性高以及抗菌效力參差不齊，限制了它們的應(yīng)用。而β-折疊肽依靠保守的半胱氨酸殘基之間的分子內(nèi)二硫鍵維持三維結(jié)構(gòu)，在相同條件下這類肽具有更加穩(wěn)定的二級構(gòu)象甚至更強(qiáng)的抗酶解能力。有研究表明β-折疊肽與具有相同電荷和疏水性的α-螺旋肽相比，具有相近的抗菌活性和更優(yōu)異的細(xì)胞選擇性，而且，當(dāng)穩(wěn)定β-發(fā)卡或β-折疊結(jié)構(gòu)抗菌肽中的二硫鍵被破壞時，所形成的線狀多肽仍能保持其抗菌特性。由于β-折疊AMPs所含的復(fù)雜二硫鍵合成困難且成本昂貴，其研究并不廣泛，因此β-折疊抗菌肽的研發(fā)對于未來AMPs的應(yīng)用轉(zhuǎn)化十分關(guān)鍵。

A. α-螺旋結(jié)構(gòu)；B.線性延伸結(jié)構(gòu)；C. β-折疊結(jié)構(gòu)；D. 同時包含α-螺旋和β-折疊元素A. α-helical structure；B. Linear extension structure；C. β-sheet structure；D. Contain both α-helical and β-sheet elements圖1 天然抗菌肽的常見結(jié)構(gòu)類型[13-14]Fig.1 Common structural classes of naturally occurring AMPs[13-14]

本文介紹了β-折疊抗菌肽的天然來源、分子設(shè)計(jì)及主要抑菌機(jī)理，同時對其應(yīng)用的局限性以及相應(yīng)的策略進(jìn)行了綜述，全方位描述了β-折疊抗菌肽的研究進(jìn)展，為該類肽的研發(fā)與利用提供參考。

1 天然源β-折疊抗菌肽

抗菌肽來源廣泛，作為非特異性天然防御系統(tǒng)的重要組成部分，是機(jī)體抵御病原微生物入侵的第一道防線。這些廣泛來源的抗菌肽通常有著不同的結(jié)構(gòu)，β-折疊就被包括其中。根據(jù)來源，可以將β-折疊抗菌肽分為哺乳動物源、昆蟲源、植物源以及微生物源等大類，在表1中列舉了較為常見的幾種天然β-折疊抗菌肽及其主要特征。

基于半胱氨酸的含量和結(jié)構(gòu)特征，可將β-折疊抗菌肽分為兩類，分別是β-發(fā)卡抗菌肽和α-defensins肽。β-發(fā)卡是反平行β-折疊結(jié)構(gòu)的最簡單形式，由兩個β-鏈和單個二硫鍵組成的環(huán)狀區(qū)域定義。β-發(fā)卡抗菌肽尺寸小且生物活性廣泛，在實(shí)際應(yīng)用方面受到研究人員更多關(guān)注，但天然β-發(fā)卡抗菌肽并不豐富，已知的β-發(fā)卡型抗菌肽家族不僅在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能上有顯著差異，在生物合成途徑上也有顯著差異。Defensins肽跨越多個結(jié)構(gòu)類別，α-defensins是一個亞組，包括三條反向平行的β-側(cè)鏈，側(cè)鏈以“trans”排列與二硫鍵相連(即β鏈末端的兩個二硫鍵指向相反的方向，并連接兩個不同的側(cè)鏈)。α-defensins被認(rèn)為是通過基因復(fù)制而進(jìn)化的，存在于大多數(shù)哺乳動物中，具有廣譜抗細(xì)菌、真菌和病毒的活性。這些肽含有保守的鹽橋結(jié)構(gòu)，有研究表明，鹽橋?qū)τ诙嚯牡恼Ｕ郫B和蛋白水解抗性是必需的，但對抗菌活性而言不是必需的。

表1 不同來源的幾種常見β-折疊抗菌肽

1.1 哺乳動物源

哺乳動物源抗菌肽已經(jīng)廣泛在動物皮膚、腸道、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等多種生理系統(tǒng)和上皮組織表面分離鑒定，主要包括Cathelicidins、Defensins和Histatins 3大家族，研究最廣泛的為Defensins類抗菌肽。APD是一個集抗菌肽命名、分類、信息搜索、預(yù)測、設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)等多功能于一體的抗菌肽數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，截至目前APD數(shù)據(jù)庫共收錄有26種被明確鑒定為β-折疊結(jié)構(gòu)的哺乳動物源AMPs，其中牛乳鐵蛋白Lfcin B和豬源Protegrin 1的研究較為深入。

1.2 昆蟲源

昆蟲免疫防御僅依賴于先天免疫，當(dāng)微生物突破身體的第一道防線時，昆蟲的先天免疫反應(yīng)就會被激活，快速產(chǎn)生大量的AMPs，使昆蟲迅速消滅入侵病原體。昆蟲源β-折疊抗菌肽具有分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、無免疫原性等特點(diǎn)，不僅對細(xì)菌和真菌有廣譜抗菌活性，對病毒、原蟲及癌細(xì)胞也有殺傷作用。目前,研究較為深入的昆蟲源β-折疊抗菌肽是擁有廣譜抗菌活性的Thanatin，此外還有從長臂天牛體內(nèi)分離出的擁有抗真菌功能的Alo-3。昆蟲作為世界上最大的生物種群，種類繁多，分布廣泛，因此昆蟲源β-折疊抗菌肽還具有巨大的發(fā)掘潛力。

1.3 植物源

植物中存在多種具有藥理作用的分子蛋白，β-折疊抗菌肽就是其中之一。當(dāng)各種病原體入侵時，多種β-折疊抗菌肽(如從紫花苜蓿中分離出的NCR169)能夠通過干擾細(xì)胞壁或膜脂的生物合成發(fā)揮抗菌活性。此外，植物源β-折疊抗菌肽富含保守的半胱氨酸殘基，擁有極高的穩(wěn)定性且能通過改變非半胱氨酸殘基的序列從而識別不同的靶點(diǎn)，預(yù)示著它們作為抗菌劑的巨大發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1.4 微生物源

微生物源β-折疊抗菌肽是由微生物自身分泌的用來保護(hù)自己并殺滅或抑制其他細(xì)菌、真菌的小分子多肽，其主要來源于特定細(xì)菌，通常比抗生素穩(wěn)定，可以承受高溫和極端pH，但在自然和有機(jī)環(huán)境中的生物半衰期較短，主要通過作用于靶細(xì)胞膜來發(fā)揮作用。迄今APD共收錄了15種來自細(xì)菌的微生物源β-折疊抗菌肽，在食品保鮮和微生物感染治療等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

2 β-折疊抗菌肽抗細(xì)菌機(jī)理

大部分β-折疊抗菌肽可以直接作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，但有一些抗菌肽除了引起細(xì)胞膜損傷之外，還被證實(shí)可以通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)并結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)來殺死細(xì)菌，產(chǎn)生一系列復(fù)雜的胞內(nèi)活動。如圖2所示，根據(jù)作用位點(diǎn)的不同，一般β-折疊抗菌肽的抑菌機(jī)理可以分為兩類，分別是肽與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用以及肽與胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用。

圖2 抗菌肽的抗細(xì)菌作用機(jī)理[38]Fig.2 Action mechanism of AMPs against bacteria[38]

2.1 肽與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用

β-折疊抗菌肽與細(xì)胞膜的作用過程，首先陽離子殘基與靶細(xì)胞膜陰離子表面通過靜電相互作用彼此靠近，然后肽的兩親結(jié)構(gòu)域與磷脂雙分子層之間產(chǎn)生疏水相互作用，抗菌肽插入細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲漏和死亡。目前，最為經(jīng)典的抗菌肽膜作用模型有桶壁模型、地毯模型和環(huán)形孔模型，這幾種作用機(jī)制模型并不是相互獨(dú)立的，而在細(xì)菌細(xì)胞膜被破壞過程中可能同時存在。由于β-折疊抗菌肽主要通過與細(xì)菌細(xì)胞膜相互作用，過程中不涉及特定的靶標(biāo)，這也解釋了細(xì)菌難以產(chǎn)生耐藥性的原因。Bellamy等研究發(fā)現(xiàn)，Lactoferricin B能夠與細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的磷脂和脂多糖結(jié)合并增加膜的通透性，且伴隨著溶液中鹽離子所帶正電荷的增加抑菌效果顯著降低；Sinha團(tuán)隊(duì)通過將Thanatin與DPC-d膠束相互結(jié)合闡述了Thanatin導(dǎo)致質(zhì)膜結(jié)構(gòu)擾動的機(jī)制；Mani等使用F和H自旋擴(kuò)散核磁共振技術(shù)確定了Protegrin 1(PG-1)在陰離子膜和含膽固醇中性膜中的低聚物結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證了PG-1能誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞膜快速通透從而產(chǎn)生殺菌活性。

2.2 肽與胞內(nèi)靶點(diǎn)相互作用

起初人們認(rèn)為β-折疊抗菌肽的跨膜機(jī)制是其作用的唯一模式，但是越來越多的研究提供證據(jù)表明僅出現(xiàn)膜通透性不足以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并由此發(fā)現(xiàn)了部分β-折疊抗菌肽存在細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)。例如通過抑制核酸的生物合成和代謝或抑制蛋白合成與折疊，進(jìn)而抑制和殺死病原菌，此外還有些能抑制細(xì)胞分裂和細(xì)胞壁的生物合成。Leeuw等研究發(fā)現(xiàn)α-防御素類多肽HNP1可以通過與細(xì)胞壁前體脂質(zhì)II相互作用抑制肽聚糖的合成，從而影響細(xì)胞壁合成以及膜功能導(dǎo)致細(xì)菌死亡；在海洋類動物的體腔細(xì)胞中分離出來的β-折疊類抗菌肽Arenicin-1可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的增加發(fā)揮抗真菌活性，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程；β-發(fā)卡肽Polyphemusin I通過作用于細(xì)胞內(nèi)與DNA和RNA相關(guān)的蛋白質(zhì)靶標(biāo)從而造成細(xì)胞死亡。部分β-折疊多肽還可以與細(xì)胞穿透肽結(jié)合從而進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，兩種作用模式之間會表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系使細(xì)菌對于此類殺傷機(jī)制更難產(chǎn)生突變抗性。

3 β-折疊抗菌肽的分子設(shè)計(jì)

3.1 天然源β-折疊抗菌肽的改造

天然β-折疊抗菌肽由于具有二硫鍵維持三維結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性相對會更高，但是一些二硫鍵較少的天然β-發(fā)卡抗菌肽仍然會受到高濃度酶的快速降解，從而失去抑菌活性。有部分天然β-折疊抗菌肽擁有足夠的蛋白酶抗性，但缺少強(qiáng)效的抗菌活性，所以當(dāng)面臨這一系列的矛盾時，天然源抗菌肽的改造是一種有效手段。研發(fā)出具有良好抗菌活性和細(xì)胞選擇性的β-折疊抗菌肽，需要利用現(xiàn)有的生物工程技術(shù)對這些AMPs的抗菌活性、生物安全性和結(jié)構(gòu)關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)探究解析，近年來，各種優(yōu)化策略和分子設(shè)計(jì)技術(shù)的進(jìn)步為肽性能的合理改良和優(yōu)化提供了參考。目前，該方向的研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，常見的改造方法包括氨基酸替換、肽鏈修飾、肽鏈雜合等。

β-折疊抗菌肽的功能及活性往往是由結(jié)構(gòu)所決定的，研究發(fā)現(xiàn)影響這些因素的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)包括凈電荷數(shù)、疏水性、兩親性、序列長度、氨基酸組成等?？傮w帶正電荷使β-折疊抗菌肽能與微生物膜的負(fù)電荷成分產(chǎn)生靜電相互作用，疏水基團(tuán)可以幫助其更深入地滲透細(xì)菌膜，從而決定β-折疊抗菌肽的抗菌效力，兩親性構(gòu)象也是肽具有膜活性不可或缺的，然而研究表明這些參數(shù)體現(xiàn)在構(gòu)效關(guān)系上時會有各自的閾值，它們之間縱橫交錯、相互影響。因此在改造中不能盲目追求單個參數(shù)的最佳完美，而是要綜合考慮各個參數(shù)的影響，以期達(dá)到一個最優(yōu)的平衡點(diǎn)，使肽的抗菌活性和生物安全性趨向于更加合理。

3.1.1 氨基酸替代 在自然界中，許多生物體能產(chǎn)生天然β-折疊抗菌肽，利用這些肽作為起始模板對序列進(jìn)行修改，可以達(dá)到提高肽的抗菌活性和細(xì)胞選擇性的目的。氨基酸替代主要是對肽模板添加、刪除、替換一個或幾個氨基酸殘基。Benfield等設(shè)計(jì)了一種新型肽，首先對Gomesin(GM)骨架進(jìn)行環(huán)化得到一種GM類似物cGM，當(dāng)濃度高于2 μmol·L時cGM會產(chǎn)生毒性并破壞癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，后來用D-Arg取代了原本在它第4、10和18位的Arg殘基從而合成了[R/r]cGM，在保留了殺菌功能的同時蛋白酶抗性明顯提高，并且解決了毒性過大的問題，可作為靶向和抗癌藥物的輸送系統(tǒng)而不損害健康細(xì)胞。另外，Dong等將Protegrin 1(PG-1)的β轉(zhuǎn)角序列添加上幾個簡單的氨基酸重復(fù)序列，設(shè)計(jì)了一系列末端對稱肽(XR)H(RX)(=1、2；X代表I、F、W和P；H代表CRRRFC)，并利用治療指數(shù)(therapeutic index，TI)，即最小溶血濃度MHC與最小抑菌濃度MIC幾何平均值的比值，評估多肽的細(xì)胞選擇性，其中，序列為(IR)H(RI)的β-折疊結(jié)構(gòu)IR2具有最高的TI，顯示出比PG-1更高的抗微生物效力，溶血活性和細(xì)胞毒性顯著低于PG-1。在改造過程中需要注意的是，β-折疊抗菌肽是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的分子，合理地去除非必須性質(zhì)的部分肽區(qū)域可以獲得較短的活性基序，降低大規(guī)模生產(chǎn)成本和衍生物的毒性或免疫原性，但此方法需要控制在合理范圍，因?yàn)榘被峤M成的輕微改變可能會改變整個幾何構(gòu)型甚至物理化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)而會影響這些肽殺滅微生物的能力和對宿主細(xì)胞的毒性。

3.1.2 肽鏈修飾 β-折疊抗菌肽常見的肽鏈修飾方法主要有環(huán)化、聚乙二醇修飾、膽固醇修飾、末端區(qū)域修飾(乙?；蝓０坊?等，這些肽鏈修飾策略的可行性已被廣泛證實(shí)，不僅能夠用于提高肽的活性、穩(wěn)定性和溶解性，提供更長的半衰期，也可以調(diào)節(jié)分子內(nèi)相互作用和疏水性甚至改變多肽呈現(xiàn)的二級結(jié)構(gòu)。Lei等將人α-defensin 5(HD5)的末端進(jìn)行了十四烷酸(肉豆蔻酸)修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的肉豆蔻酰化HD5在體外具有顯著增強(qiáng)的廣譜殺菌活性，并且穩(wěn)定性明顯提高；Imura等將聚乙二醇連接到β-折疊肽Tachyplesin I的N端，發(fā)現(xiàn)多肽聚乙二醇化后膜通透性并沒有改變，而且抗菌活性顯著減弱，但細(xì)胞毒性顯著降低；Chan等采用固相化學(xué)合成法合成了環(huán)狀β-折疊抗菌肽Gomesin，與天然Gomesin相比，環(huán)化提高了Gomesin的體外穩(wěn)定性，增強(qiáng)了其對癌細(xì)胞的殺傷作用以及抗瘧疾活性。相比于其他改造方法，肽鏈修飾策略能夠賦予β-折疊抗菌肽更多本身所不具備的性能，甚至定向賦予某項(xiàng)特性，更加可控與便捷，是一種性價比很高的肽設(shè)計(jì)方法。

3.1.3 肽鏈雜合 肽鏈雜合是將不同優(yōu)勢肽或優(yōu)勢肽段通過某種方式組合成新的嵌合肽的一類方法，這種方法通常將有效但毒性相對較大的肽序列與活性較低但毒性較低的肽序列融合，同樣是設(shè)計(jì)新型β-折疊肽的一種簡單有效策略，研究表明，嵌合肽活性的增加歸因于每種肽組分同時作用于細(xì)菌的獨(dú)特機(jī)制。為了優(yōu)化具有較強(qiáng)細(xì)胞特異性和抗炎活性的抗菌肽，Liu等設(shè)計(jì)了基于Progetrin 1、Bovine lactoferricin的雙發(fā)卡雜合肽，發(fā)現(xiàn)合成的雜合肽LB-PG不僅對多種微生物表現(xiàn)出較高的選擇性，細(xì)胞毒性和溶血活性變低，還能抑制LPS誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)。雖然研究表明了雜合肽比親本肽更有效，但雜合后導(dǎo)致肽鏈長度增加從而帶來的合成成本增加的問題也是不容忽視的，因此需要綜合考慮多種因素的影響。

3.2 全新設(shè)計(jì)

在抗菌肽幾十年的發(fā)展過程中，為進(jìn)一步降低抗菌肽的生產(chǎn)成本，研發(fā)活性高、序列短且組成簡單的β-折疊抗菌肽，抗菌肽的全新設(shè)計(jì)成為了研究的熱門，常見的方法有模板確立法和數(shù)據(jù)庫過濾篩選技術(shù)。

3.2.1 基于模板的設(shè)計(jì) 經(jīng)過幾十年的發(fā)展，抗菌肽模板的研究已經(jīng)越來越全面。模板序列可以通過比較已知的天然肽序列并篩選出對功能重要的參數(shù)獲得，與傳統(tǒng)的序列修飾方法相比，該方法的優(yōu)點(diǎn)是其減少了為獲得理想結(jié)果而需要合成的肽的數(shù)量，從而在保持序列信息的同時降低研發(fā)成本。Shao等使用一種預(yù)測算法設(shè)計(jì)了最簡單的反平行β-發(fā)卡抗菌肽模板RWYXYZZRWYXY-NH，由兩條含有陽離子(X=Arg、Lys、His)和疏水殘基(Y=Val、Ile、Leu、Phe)的非共價鍵β-側(cè)鏈，通過剛性轉(zhuǎn)向區(qū)域(ZZ=Pro-Gly、D-Pro-Gly、Asn-Gly)連接而成，研發(fā)出的WKF-PG(RWFKFPGRWFKF-NH)和WRF-NG(RWFRFNGRWFRF-NH)可以通過直接的抗菌效果和抑制機(jī)體炎癥來治療細(xì)菌感染。Wu等設(shè)計(jì)了基于(XYXY)為模板的一系列肽，發(fā)現(xiàn)兩個β-折疊結(jié)構(gòu)的水溶性多肽(IKIK)-NH和(IRIK)-NH對包括真菌在內(nèi)的多種微生物表現(xiàn)出強(qiáng)殺滅作用，同時保持低毒并具有中和內(nèi)毒素的能力，是真菌性角膜炎藥物的理想候選者。

3.2.2 數(shù)據(jù)庫過濾篩選 數(shù)據(jù)庫過濾篩選技術(shù)是一種利用數(shù)據(jù)庫對具有某種特定功能多肽的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行多步篩選，從而最終設(shè)計(jì)出具有目標(biāo)活性、性能更優(yōu)的全新肽的方法(圖3)。與傳統(tǒng)的設(shè)計(jì)方法相比，該方法可以在最短的時間內(nèi)篩選出最優(yōu)序列，不僅節(jié)省大量成本,還可以用來預(yù)測或進(jìn)一步增強(qiáng)多肽的抗菌活性。隨著近年來大數(shù)據(jù)和人工智能技術(shù)的發(fā)展，基因組、蛋白質(zhì)組和功能信息的數(shù)據(jù)庫已逐漸成為抗菌藥物研發(fā)不可或缺的工具。Cherkasov等迭代構(gòu)建了兩個由9個氨基酸組成的隨機(jī)大型肽庫，通過Artificial Neural Networks(一種強(qiáng)大的機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù))隨機(jī)預(yù)測超過10萬條虛擬肽的活性，篩選出的肽比目前最先進(jìn)的臨床候選抗菌肽更加有效，并且能有效殺滅超級耐藥細(xì)菌；Fjell等使用遺傳算法的啟發(fā)式搜索方法生成候選肽序列，它在識別新型高抗菌能力多肽方面有很大提高。盡管這種方法被認(rèn)為是有效的，但目前仍沒有明確的研究使用該方法設(shè)計(jì)全新β-折疊抗菌肽。

圖3 數(shù)據(jù)庫過濾篩選技術(shù)[69]Fig.3 Database filtering technology[69]

4 β-折疊抗菌肽的應(yīng)用策略

抗生素一直是人類抗擊致病菌最重要的武器，但由于無節(jié)制的使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題愈發(fā)嚴(yán)重，每年都有數(shù)以萬計(jì)的人和動物因耐藥菌感染而死亡，因此世界上許多國家對抗生素的使用提出了嚴(yán)格限制。由于優(yōu)良的生物學(xué)活性、低毒性、豐富的化學(xué)多樣性和天然來源的可得性，抗菌肽成為抗生素的理想替代品。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，抗菌肽已逐漸應(yīng)用到畜牧、食品、化學(xué)、醫(yī)藥等許多行業(yè)。為使β-折疊抗菌肽得到更加合理的應(yīng)用，切實(shí)有效的策略是必不可少的，以下論述針對目前的研究熱點(diǎn)，從現(xiàn)實(shí)角度出發(fā)，介紹了β-折疊抗菌肽能夠在未來應(yīng)用轉(zhuǎn)化的兩個候選方向，分別是肽與納米載體的結(jié)合、肽與抗生素的協(xié)同應(yīng)用。

4.1 肽與納米載體的結(jié)合

無論是天然還是人工合成的β-折疊抗菌肽，大多數(shù)都具有廣譜抗菌活性。傳統(tǒng)觀點(diǎn)通常認(rèn)為抗菌肽所擁有的抗菌譜越廣，其應(yīng)用范圍就會越大，其實(shí)不然。當(dāng)一些活性較強(qiáng)的β-折疊抗菌肽應(yīng)用到機(jī)體尤其是被動物采食進(jìn)入胃腸道之后，除了起到殺滅病原微生物的功效以外，還可能會不分青紅皂白地殺死體內(nèi)益生菌，造成機(jī)體菌群失調(diào)，甚至破壞健康微生物區(qū)系和免疫系統(tǒng)之間的動態(tài)平衡。此外，當(dāng)β-折疊抗菌肽進(jìn)入體內(nèi)后，盡管分子內(nèi)二硫鍵的存在會使它們的穩(wěn)定性有所提高，但仍然需要面臨唾液、胃黏膜、血液和組織中存在的鹽離子和蛋白酶等影響，使其生物半衰期降低。而且，β-折疊抗菌肽在體內(nèi)的擴(kuò)散率也有限，運(yùn)輸效率相對較差，致使大多數(shù)給藥方法都需要高劑量。所以如果有一種能夠更加穩(wěn)定地將肽靶向運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)特定病原體附近而又不會殺滅益生菌的方法，將會極大緩解這些問題，無疑會更好地加速β-折疊抗菌肽的應(yīng)用進(jìn)展。

近年來，傳遞和釋放生物分子的納米生物技術(shù)得到快速發(fā)展。目前，已有的肽遞送納米載體材料提供了一種有效方法，這些納米載體材料往往尺寸小、比表面積大、靶向能力強(qiáng)、毒性低，它們通過包裹、持續(xù)釋放和延長活性來穩(wěn)定以及更好地保護(hù)β-折疊抗菌肽不受酶降解的影響，利用載體固有的靶向特點(diǎn)將β-折疊抗菌肽運(yùn)送至特定目標(biāo)以防止對有益菌造成殺傷。因此β-折疊抗菌肽結(jié)合納米材料后在體內(nèi)可能會具有長效的抗菌活性、更低的毒性和更高的穩(wěn)定性。一些納米顆粒(如納米纖維)，它們有很大的接觸面，可以攜帶幾個單層或多層抗菌肽并將其引導(dǎo)到特定的目標(biāo)，是β-折疊抗菌肽制劑理想的輸送系統(tǒng)。此外，一些無機(jī)納米材料(如金屬納米顆粒、磁性納米顆粒)以及一些有機(jī)納米材料(如脂質(zhì)體納米材料、聚合物納米材料等)，均可作為β-折疊抗菌肽良好的遞送載體。直徑<10 nm的顆粒會通過腎迅速代謝排出體外，>70 nm的顆粒在體內(nèi)滯留時間較長，最終會到達(dá)脾被吞噬細(xì)胞清除，因此納米顆粒的尺寸范圍也極大地降低了這些顆粒從體內(nèi)清除時所帶來的風(fēng)險。

新的納米制劑策略的有效性仍受到生產(chǎn)技術(shù)、苛刻溶劑的使用以及肽的各種物理化學(xué)性質(zhì)的限制。而且，用于生產(chǎn)這種納米載體的材料要求必須無毒、生物兼容、在加工過程中穩(wěn)定且適合與肽一同使用，因此，尋找用作納米載體的新型材料也是一項(xiàng)需要克服的任務(wù)。

4.2 肽與抗生素的協(xié)同應(yīng)用

很長一段時間來，研究人員對抗菌肽的研究主要集中在提純和鑒定抗菌肽、闡明各種肽的作用機(jī)制、生產(chǎn)類似的合成肽并檢測其生物物理特性以及對合成的抗菌肽進(jìn)行修飾來獲得具有更強(qiáng)殺菌性能的多肽等方面，但目前抗菌肽的商業(yè)化仍然存在許多障礙。在對抗菌肽研究中出現(xiàn)的一個新理念是抗菌肽與常規(guī)抗生素的協(xié)同作用。雖然許多肽本身具有顯著的抗菌活性，但要使肽在體內(nèi)發(fā)揮有效的活性往往需要更高的濃度。多肽與抗生素的混合物被發(fā)現(xiàn)能夠極大地提高抗微生物效果，而且導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌出現(xiàn)的概率更低，這樣就同時避免了肽的大量使用和抗生素的高劑量使用，從而降低了成本并減少了耐藥性產(chǎn)生，因此肽與抗生素之間的協(xié)同作用備受關(guān)注。目前，這一策略在β-折疊抗菌肽領(lǐng)域已經(jīng)有了成功的例子，Kim等設(shè)計(jì)了一種序列為FKVKFKVKVK-NH的β-折疊肽，他們將肽固定在聚乙二醇-聚苯乙烯樹脂上合成了多肽-樹脂結(jié)合物，當(dāng)該結(jié)合物與萬古霉素和四環(huán)素混合使用時，發(fā)現(xiàn)溶液對金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌的殺滅效果顯著增強(qiáng)；劉又銘等將LfcinB分別與土霉素、慶大霉素和阿莫西林聯(lián)合使用，驗(yàn)證了LfcinB和阿莫西林聯(lián)合作用的協(xié)同效應(yīng)最強(qiáng)，而與土霉素協(xié)同效應(yīng)最差，同時發(fā)現(xiàn)LfcinB與抗生素的協(xié)同作用對于革蘭陰性菌的抑制效果要優(yōu)于革蘭陽性菌。

目前，要完全放棄使用抗生素是不現(xiàn)實(shí)的，但可以將抗菌肽或擬肽類藥物與抗生素的優(yōu)勢結(jié)合起來，相輔相成。在未來，β-折疊抗菌肽與抗生素優(yōu)勢的結(jié)合可能會成為對抗耐藥細(xì)菌的有效手段，在減少細(xì)菌耐藥性降低成本方面發(fā)揮更大的作用。

5 小 結(jié)

過去幾十年，抗生素的過度和不當(dāng)使用導(dǎo)致了藥物殘留和細(xì)菌耐藥性問題出現(xiàn)，構(gòu)成了嚴(yán)重的全球健康問題，隨著各國政府一系列禁抗法令的頒布，給畜牧生產(chǎn)等行業(yè)造成極大沖擊，迫切需要尋求新的抗生素替代物質(zhì)?？咕囊?qū)Χ喾N細(xì)菌、真菌、原生動物和包膜病毒具有廣泛的活性，受到了越來越多的關(guān)注。盡管結(jié)構(gòu)上的一些優(yōu)勢讓β-折疊抗菌肽被認(rèn)為是很有前途的飼用抗生素替代品，但是動物體內(nèi)環(huán)境高濃度的蛋白酶、生理濃度鹽離子等因素仍會造成一些短鏈β-發(fā)卡抗菌肽快速失活，此外β-折疊抗菌肽還面臨著活性差異大、生產(chǎn)成本高等問題，阻礙其在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。目前的方法，一方面可以通過對天然β-折疊抗菌肽進(jìn)行改造或者全新設(shè)計(jì)解決β-折疊抗菌肽活性低、毒性和成本高等問題，另一方面可通過與納米載體的結(jié)合或與抗生素的協(xié)同來提高其應(yīng)用潛力。這些研究進(jìn)展對于促進(jìn)β-折疊抗菌肽的應(yīng)用起到了一定的推動作用，但關(guān)于β-折疊抗菌肽在動物體內(nèi)的應(yīng)用方法和應(yīng)用效果均有待進(jìn)一步探究。相信隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和各學(xué)科的交叉融合，在不遠(yuǎn)的將來，β-折疊抗菌肽會成為替代抗生素的新一代飼料添加劑，為畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供新的動力。