哺乳動物配子冷凍保存并應(yīng)用于珍稀瀕危動物保護(hù)的技術(shù)策略

高 峰，何琪富，吳盛輝，王少文，徐雪瑞，康 健，張 涌 *， 權(quán)富生*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楊凌 712100；3.陜西省動物胚胎工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100)

動物配子(精子和卵子)冷凍保存在畜牧業(yè)生產(chǎn)以及人類輔助生殖方面有較廣泛的應(yīng)用，同時被應(yīng)用于動物種質(zhì)資源保護(hù)和利用。配子冷凍保存是在超低溫情況下，使細(xì)胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)失去活力，并處于休眠狀態(tài)，新陳代謝、細(xì)胞分裂等細(xì)胞生命活動暫時停止，但是經(jīng)過解凍并恢復(fù)至正常生理溫度時，配子仍具有活性并可實(shí)施生物學(xué)功能。許多國家應(yīng)用配子冷凍保存技術(shù)建立了遺傳種質(zhì)資源庫，即“精子庫”“卵子庫”等，用于不同種類動物種質(zhì)遺傳資源的保存和利用。通過保存青年瀕危動物的配子，維持其生殖潛力，避免了動物衰老或疾病引起的生育力下降或繁殖喪失等問題，在挽救動物瀕臨滅絕和恢復(fù)動物種群中發(fā)揮作用。目前，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用配子冷凍技術(shù)有目的性地保存和改良動物基因，能有效維持生物多樣性，并提高動物的性狀與品質(zhì)、預(yù)防疾病傳播、增加輔助生殖技術(shù)的可行性和可操作性以及保護(hù)珍稀瀕危動物等，從而解決人類的健康、生活水平和環(huán)境等問題。所以進(jìn)行動物配子冷凍保存及利用研究，對有效實(shí)施動物種質(zhì)資源保存具有重要意義。

1 國內(nèi)外對精子冷凍保存和利用研究

精子冷凍是畜牧生產(chǎn)和動物種質(zhì)資源保存利用的重要方法和手段，隨著冷凍生物學(xué)技術(shù)和理論的進(jìn)步，精子冷凍技術(shù)不斷得到提升，精子的冷凍效率和冷凍-解凍后活力也不斷提高，并為種質(zhì)資源保存利用提供了有力保障。

1.1 精子冷凍保存的方法及劑型

精液的冷凍方法一般包括慢速冷凍和快速冷凍。慢速冷凍將精液樣品在一定的速率下從室溫冷卻至-80 ℃，最后放入液氮中保存，整個過程耗時2～4 h。因該技術(shù)使精子細(xì)胞的外部形成冰晶，所以對精子內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能的損傷較輕。但是冷凍速度太慢，隨著細(xì)胞外溶液濃度變大，細(xì)胞內(nèi)水分不斷滲透外泄，使精子細(xì)胞膜發(fā)生皺縮，造成化學(xué)性和物理性損傷。快速冷凍是將精子在液氮上方2 cm處熏蒸4～5 min后，置于液氮中保存，該方法能迅速制冷，操作簡單，但是凍存過程中降溫的速度不可人為控制。于是便開發(fā)了程序冷凍法，該方法是通過儀器控制噴出液氮蒸氣量來改變精子凍存過程中降溫的速率，還能監(jiān)測溫度的變化，已經(jīng)在牛冷凍精液生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。

精液冷凍劑型常見的有顆粒凍精、細(xì)管凍精。顆粒凍精是利用干冰或液氮蒸汽將精液凍成顆粒狀，隨后置于液氮中長期保存。細(xì)管凍精技術(shù)是利用直徑小、管壁薄的無毒塑料管(0.25 mL或0.5 mL細(xì)管)裝進(jìn)精液，然后通過液氮熏蒸法冷凍而成。與顆粒凍精相比，細(xì)管凍精避免了精液與液氮直接接觸，從而減少污染，并具有密閉無菌、體積固定、受凍均勻等優(yōu)點(diǎn)，大大降低疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，細(xì)管凍精技術(shù)在解凍后精子活力好，受胎率遠(yuǎn)高于顆粒凍精。

凍干精子是近幾年新研究的凍精技術(shù)，利用真空冷凍干燥，使精子保持失水干燥狀態(tài)，并且在室溫或低溫環(huán)境均能保存。有研究表明，小鼠凍干精子在4 ℃和25 ℃中保存3個月后，對其受精后胚胎的發(fā)育能力沒有影響。凍干精子具有抗破壞性、儲存所需空間小等優(yōu)點(diǎn)，有效解決了運(yùn)輸和保存等問題，但是該技術(shù)仍處于試驗(yàn)階段，對減輕精子膜損傷的研究尚未成熟，在畜禽凍精中的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究完善。

1.2 冷凍-解凍后對精子質(zhì)量的影響及補(bǔ)救措施

冷凍精子解凍后將溫度保持在37 ℃左右，通過鏡檢判斷精子是否符合質(zhì)量要求，最后再進(jìn)行利用。目前在人類輔助生殖(ART)方面，人工授精(AI)或者體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)應(yīng)用最普遍。精子冷凍-解凍過程中，其所處的外界環(huán)境會發(fā)生一系列劇烈變化，冷凍過程導(dǎo)致質(zhì)膜和線粒體膜受損，還會引起精子細(xì)胞中蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損傷和胞內(nèi)結(jié)晶，而精子細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)完整性是完成新陳代謝所必需的。因此，與新鮮精子相比，冷凍-解凍后精子質(zhì)量和活力均顯著降低，并導(dǎo)致人工授精后受孕率和產(chǎn)仔量降低。通過改變精子冷凍保存條件對其存活率和功能狀態(tài)有明顯改善，為了補(bǔ)救冷凍過程對精子的損傷，添加抗氧化劑、甘油和非滲透性冷凍保護(hù)劑均能顯著提高解凍后哺乳動物精子的質(zhì)量。據(jù)報(bào)道，在解凍溶液中添加鈣螯合劑(EDTA和EGTA)，不僅保障膽固醇從精子膜流出，還能使鈣流入精子，有效降低冷凍保存造成的損傷，此外，將精漿添加到解凍稀釋劑中能提高精子解凍后質(zhì)量和人工授精后的受孕率。

1.3 精原干細(xì)胞冷凍的意義及研究進(jìn)展

精原干細(xì)胞(SSCs)是一種重要的生殖干細(xì)胞，通過體外分離培養(yǎng)SSCs，能定向誘導(dǎo)分化成精子，也能將SSCs進(jìn)行睪丸移植恢復(fù)不育雄性動物生精能力，解決哺乳動物的生殖障礙問題。冷凍保存SSCs是保留哺乳動物種質(zhì)資源的基本材料，也是維持哺乳動物多樣性的重要資源。目前，冷凍保存SSCs已成為哺乳動物輔助生殖的必要手段，不僅能充分保留哺乳動物的遺傳物質(zhì)，還能有效保護(hù)瀕危野生動物和改良家畜品種。與精子冷凍保存相比，SSCs冷凍保存技術(shù)起步較晚，在哺乳動物方面的應(yīng)用不夠成熟。SSCs冷凍過程中會發(fā)生氧化損傷，產(chǎn)生大量的ROS破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，因此添加抗氧化劑對SSCs的冷凍保存有保護(hù)作用。通過改良冷凍-解凍速率和篩選適宜的胞內(nèi)外滲透條件等，能顯著提高SSCs冷凍-解凍后的存活率，并維持胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能完整。小鼠SSCs在冷凍-解凍技術(shù)以及自我更新和分化機(jī)制方面的研究已經(jīng)比較清楚，在大型哺乳動物上的應(yīng)用也逐漸興起，但如何將SSCs理論廣泛應(yīng)用于珍稀瀕危動物有待研究，例如：如何優(yōu)化SSCs冷凍-解凍技術(shù)、如何采用高效成熟的方法體外培養(yǎng)SSCs并誘導(dǎo)分化成可利用的精子？SSCs復(fù)原后對珍稀瀕危動物種質(zhì)資源保護(hù)的效果如何，還需要不斷完善和系統(tǒng)評估。

1.4 冷凍保存對精子損傷的評估研究

冷凍過程中精子膜結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)代謝的變化會造成冷凍損傷，主要包括機(jī)械性損傷和氧化損傷。國內(nèi)外對精子冷凍損傷的研究包括精子活力、形態(tài)變化以及功能等方面，冷凍-解凍后精子活力下降能直觀地評估精子質(zhì)量和受精率。精子形態(tài)變化是由于精子頭部、頸部、尾部、質(zhì)膜、頂體以及線粒體等結(jié)構(gòu)在冷凍后受損引起的。目前，通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光等試驗(yàn)手段能檢測精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并作為評估精子質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)。精子功能受損主要包括精子獲能和遺傳物質(zhì)的變化，其中，精子獲能是完成受精過程的先決條件，冷凍會造成部分精子異常獲能現(xiàn)象，從而降低凍精的受精能力。DNA是精子中重要的遺傳物質(zhì)，冷凍導(dǎo)致DNA和染色質(zhì)完整性受損，對精子的表觀遺傳修飾產(chǎn)生不利影響，所以說研究精子功能也是評估精子冷凍損傷的關(guān)鍵。

精子在冷凍-解凍過程中脂質(zhì)過氧化增加，使精子的完整結(jié)構(gòu)受損，造成精子質(zhì)量下降，從而降低體外受精效率。在正常的機(jī)體狀態(tài)下，活性氧在維持精子的正常功能方面發(fā)揮重要的作用，當(dāng)活性氧的產(chǎn)生和降解失衡時，會引起精子氧化應(yīng)激增加，使精子胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆損傷，甚至導(dǎo)致精子死亡。冷凍保存對精子形態(tài)及功能的損傷如圖1所示。

關(guān)于精子冷凍損傷對精子表觀遺傳修飾以及后代的影響目前已成為一個新的研究熱點(diǎn)，通過表觀遺傳修飾劑以及小分子的應(yīng)用，減輕冷凍對精子表觀遺傳修飾的影響，使冷凍精子的質(zhì)量和安全性得到顯著提高。

2 國內(nèi)外對卵子冷凍保存和利用研究

卵子的冷凍為家畜等動物種質(zhì)資源保存提供了卵子庫，有利于優(yōu)質(zhì)畜禽和珍稀瀕危物種的種質(zhì)資源的長期保存。目前,對卵母細(xì)胞冷凍重點(diǎn)側(cè)重于玻璃化冷凍，因?yàn)槁涯讣?xì)胞結(jié)構(gòu)功能很特殊，并且對冷凍損傷和冷凍劑毒性非常敏感，慢速冷凍對卵母細(xì)胞造成的損傷比較大，導(dǎo)致受精率低。玻璃化冷凍卵母細(xì)胞，操作方法簡單、快捷，并且受精率和妊娠率與新鮮的卵母細(xì)胞相似，成為了最有效、最實(shí)用的卵母細(xì)胞冷凍保存方法。Zhang等分別利用玻璃化冷凍和慢速冷凍對人類卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞在存活率、體外成熟率、受精率和早期胚胎發(fā)育率等方面均優(yōu)于慢速冷凍。

2.1 卵子獲取技術(shù)

胚胎試驗(yàn)最常用的卵子采集技術(shù)是屠體卵巢采集卵母細(xì)胞。在屠宰場收集的動物卵巢運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，通過抽吸法、切割法和剝離法3種方法收集卵巢中的卵母細(xì)胞。但是作為珍稀瀕危動物或者家畜，除非瀕臨死亡個體，一般采用活體采卵技術(shù)收集卵母細(xì)胞，盡量減少對珍稀瀕危動物的影響。有報(bào)道，利用激素對羔羊進(jìn)行超數(shù)排卵，通過手術(shù)，用注射器進(jìn)行抽吸回收卵子，回收率較高。另外利用卵泡波理論，根據(jù)珍稀瀕危動物的生理特點(diǎn)在性成熟前、妊娠期等非繁殖期收集卵子，進(jìn)行體外卵母細(xì)胞成熟和體外受精以及胚胎體外生產(chǎn)，從而獲得更多可利用的胚胎用于保存或者移植。對于珍稀瀕危動物采集卵母細(xì)胞的方法和技術(shù)還需要不斷優(yōu)化，在盡量減少動物損傷的前提下，提高采卵效率和可利用卵的數(shù)量對珍稀瀕危動物的卵子保存非常關(guān)鍵。

圖1 冷凍保存對精子形態(tài)及功能的損傷[38]Fig.1 The damages of cryopreservation to sperm morphology and function[38]

2.2 不同成熟階段卵子玻璃化冷凍保存的差異

研究表明，卵母細(xì)胞玻璃化冷凍可顯著降低卵母細(xì)胞體外受精后胚胎發(fā)育的質(zhì)量和數(shù)量。然而，對不同成熟階段卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的研究存在爭議。Mara等認(rèn)為卵母細(xì)胞在成熟期(MⅡ)階段比處于生發(fā)泡(GV)階段的玻璃化冷凍存活率高，而Moawad等認(rèn)為玻璃化冷凍卵母細(xì)胞在GV期或生發(fā)泡破裂期(GVBD)比成熟期更有利。

在玻璃化冷凍過程中，GV期的卵母細(xì)胞缺少對冷凍損傷敏感的紡錘體，而外周的顆粒細(xì)胞導(dǎo)致抗凍保護(hù)劑難以滲透進(jìn)入卵母細(xì)胞，使卵母細(xì)胞內(nèi)仍存在大量的自由水，進(jìn)而引起胞內(nèi)形成更多的冰晶，最終造成卵母細(xì)胞死亡。然而，MⅡ期是在卵母細(xì)胞成熟分裂中期，具有獨(dú)特的中期紡錘體結(jié)構(gòu)并且染色體在赤道板上規(guī)則地排列，玻璃化冷凍會引起紡錘體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。解凍復(fù)原過程中，由于冷凍過程會造成超微結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致不同階段的卵母細(xì)胞后續(xù)成熟過程中所需的形態(tài)學(xué)和蛋白質(zhì)合成難以完成。但是目前大家普遍采用MⅡ期卵母細(xì)胞冷凍，在解凍復(fù)原后發(fā)育、體外受精以及胚胎生產(chǎn)方面具有一定的優(yōu)勢，也取得了比較滿意的移植妊娠率，在種質(zhì)資源保存中應(yīng)優(yōu)先采用。同時GV期卵母細(xì)胞的冷凍保存以及利用還需要不斷研究和改善，有可能最終取代MⅡ期卵母細(xì)胞的保存。目前，如何降低不同成熟階段的卵母細(xì)胞對玻璃化冷凍的敏感程度，成為了國內(nèi)外卵母細(xì)胞冷凍保存的研究熱點(diǎn)，還需要不斷研究和探索。

2.3 玻璃化冷凍保存對卵母細(xì)胞損傷的評估研究

迄今為止，卵母細(xì)胞冷凍保存研究取得了一系列重要進(jìn)展，但是冷凍-解凍過程對卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和質(zhì)量影響還未能有效解決。國內(nèi)外對玻璃化冷凍引起卵母細(xì)胞損傷的評估包括發(fā)育能力、形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、DNA損傷以及表觀遺傳修飾等方面，解凍后的卵母細(xì)胞經(jīng)孤雌激活或體外受精，統(tǒng)計(jì)卵裂率判定其后續(xù)發(fā)育能力，利用倒置顯微鏡直觀觀察到冷凍-解凍過程引起的卵母細(xì)胞形態(tài)變化。

卵母細(xì)胞在正常情況下超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出完整均勻的分布，而經(jīng)過冷凍-解凍后會出現(xiàn)破損并且分布不均現(xiàn)象。玻璃化冷凍引起卵母細(xì)胞中線粒體、皮質(zhì)顆粒、透明帶、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架和微絨毛等其他超微結(jié)構(gòu)的損傷，而這些超微結(jié)構(gòu)對卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精具有重要的功能(圖2)，目前，常采用透射電子顯微鏡采集圖像評估卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷程度。卵母細(xì)胞冷凍保存時，要面臨惡劣的超低溫環(huán)境和冷凍保護(hù)劑的毒性作用，引起卵母細(xì)胞核內(nèi)DNA和染色質(zhì)受損，導(dǎo)致DNA片段化，彗星電泳實(shí)驗(yàn)是檢測DNA損傷的重要技術(shù)，卵母細(xì)胞經(jīng)裂解液處理，其細(xì)胞膜和核膜等膜結(jié)構(gòu)被破壞，使胞內(nèi)小分子物質(zhì)擴(kuò)散至電解液中，核DNA因分子量較大難以進(jìn)入凝膠內(nèi)，而斷裂的DNA能進(jìn)入凝膠中并向陽極遷移，因此，DNA受損越嚴(yán)重向陽極遷移的DNA碎片越多，形成的“彗星拖尾”現(xiàn)象越明顯。

圖2 玻璃化冷凍對卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及功能的影響Fig.2 The effects of vitrification on the ultrastructure and function of oocytes

近年來，本課題組進(jìn)行了玻璃化冷凍對卵母細(xì)胞表觀遺傳修飾的影響及調(diào)控研究，發(fā)現(xiàn)冷凍卵母細(xì)胞解凍復(fù)蘇后，總體基因組甲基化水平下降，其受精卵早期胚胎的印記基因也發(fā)生變化，影響了后續(xù)胚胎的發(fā)育和妊娠率，也存在發(fā)育異常的風(fēng)險(xiǎn)。

3 配子冷凍在珍稀瀕危動物保種中的應(yīng)用策略

目前，人為或者自然因素導(dǎo)致珍稀瀕危動物滅絕已經(jīng)成為一個嚴(yán)峻的全球性問題，為了保護(hù)這些物種，需要對珍稀瀕危物種的地理分布、棲息環(huán)境、生物和生態(tài)習(xí)性、遺傳資源和種群自身生存能力等進(jìn)行系統(tǒng)研究，并制定科學(xué)有效的保種、擴(kuò)群方案，來拯救這些物種。迄今為止，配子冷凍技術(shù)是保護(hù)珍稀瀕危物種的重要方法之一，并進(jìn)行了多方面的研究(圖3)，為動物種質(zhì)資源的保護(hù)保存提供技術(shù)支撐和保障。但是，仍然存在許多問題需要逐步解決，如何優(yōu)化配子冷凍技術(shù)和利用技術(shù)，并合理應(yīng)用于珍稀瀕危動物擴(kuò)群和保護(hù)，使配子冷凍對瀕危動物的保護(hù)貢獻(xiàn)率不斷提高，需要技術(shù)的不斷進(jìn)步和人們不懈地努力。

3.1 珍稀瀕危動物精子冷凍保存和利用策略

為了提高珍稀瀕危動物精液冷凍保存和解凍復(fù)蘇后的質(zhì)量，在稀釋液中添加冷凍保護(hù)劑，不僅能降低精子內(nèi)外液體的冰點(diǎn)，還能透過細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中生物成分相互作用以及在精子外周形成保護(hù)層。優(yōu)化冷凍方法，摸索最佳冷凍速率，將程序化冷凍技術(shù)應(yīng)用于珍稀瀕危動物精子保存中。在精液冷凍和解凍復(fù)蘇過程中補(bǔ)充抗氧化劑，以保護(hù)精子。研究表明，精液冷凍保存時，在冷凍稀釋液中添加褪黑素可以顯著降低精液中的ROS含量，并減輕精子的冷凍損傷。在珍稀瀕危動物中獲取精子的難度較大，所以對精子凍存和利用的要求嚴(yán)格，改進(jìn)冷凍技術(shù)對提高冷凍-解凍復(fù)蘇后精子的存活率和受精率非常重要。當(dāng)然，對于極度珍稀的精子應(yīng)采用腹腔鏡輸精或者卵母細(xì)胞單精子注射技術(shù)(ICSI)，以減少精子使用量完成人工授精或者卵母細(xì)胞體外受精。

圖3 配子冷凍技術(shù)在保護(hù)珍稀瀕危物種的應(yīng)用(以優(yōu)良種質(zhì)的牛為例)Fig.3 Application of gamete freezing technology in the protection of rare and endangered species (Take cattle with excellent germplasm as an example)

3.2 珍稀瀕危動物卵子冷凍保存和利用策略

為了提高珍稀瀕危動物卵母細(xì)胞玻璃化冷凍和解凍復(fù)原的質(zhì)量，在玻璃化冷凍前可用生物活性物質(zhì)預(yù)處理卵母細(xì)胞。研究表明，利用甘氨酸、含膽固醇的β甲基環(huán)糊精和抗凍蛋白預(yù)處理可以減輕玻璃化冷凍的GV期卵母細(xì)胞細(xì)胞膜損傷，提高其成熟率以及隨后的胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能。高滲性玻璃化冷凍保護(hù)劑對細(xì)胞毒性較大，所以要減少處理時間，相反，若處理時間過短，就無法使卵子內(nèi)的水分被置換，冷凍時就會形成冰晶。因此，要控制好冷凍保護(hù)劑處理卵母細(xì)胞的時間；活體采集年輕珍稀瀕危動物卵母細(xì)胞用于玻璃化冷凍，隨著母體年齡的增加，冷凍的成功率就越低；選擇冷凍速率高、攜帶冷凍保護(hù)劑少的冷凍載體，比如：封閉式拉長細(xì)管(CPS)、冷凍環(huán)(cryoloop)等冷凍載體。

迄今為止，本課題組在提高卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效率方面取得了重要研究進(jìn)展，通過在冷凍液中添加白藜蘆醇、Vc等物質(zhì)，使卵母細(xì)胞和胚胎的表觀遺傳修飾得到改善，提高了胚胎發(fā)育率和后代出生率，將這些最新的研究成果應(yīng)用于珍稀瀕危動物卵子和胚胎的冷凍保存將會發(fā)揮積極的作用。

3.3 配子冷凍在瀕危珍稀動物活體保種中的應(yīng)用策略

動物種質(zhì)資源的保護(hù)和保存利用，是一項(xiàng)利國利民的系統(tǒng)工程，也是一項(xiàng)長期任務(wù)。需要從行政-業(yè)務(wù)部門-基層進(jìn)行通力合作，摸清家底，了解珍稀瀕危動物的種類和數(shù)量。將配子冷凍保存和活體保種同步進(jìn)行，同時注重動物種質(zhì)資源的開發(fā)利用，尤其對具有地方特色的珍稀瀕危畜禽品種，進(jìn)行資源功能挖掘，通過開發(fā)、擴(kuò)繁和利用的手段，緩解活體保種的壓力，使珍稀瀕危動物種質(zhì)資源在利用中得到有效保護(hù)。

動物種質(zhì)資源保護(hù)和瀕危動物的拯救，需要多學(xué)科的合作，將基礎(chǔ)應(yīng)用研究和實(shí)際生產(chǎn)、保種過程相聯(lián)系，圖4展示了珍稀瀕危動物的保種和擴(kuò)群技術(shù)策略。生物信息學(xué)對收集、管理和分析珍稀瀕危物種的大型數(shù)據(jù)集具有重要作用，通過系統(tǒng)生物學(xué)研究珍稀瀕危物種的復(fù)雜機(jī)制，以促進(jìn)其繁殖和擴(kuò)群。利用與珍稀瀕危物種相關(guān)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ腿ヌ剿?，?yàn)證成功的條件下立即運(yùn)用于珍稀瀕危物種，來更好地完成其擴(kuò)群和保種。

圖4 珍稀瀕危動物擴(kuò)群工作的研究方法Fig.4 Research methods of expansion of rare and endangered animals

在活體保種成本高、難度大的情況下，精子、卵子、胚胎以及體細(xì)胞冷凍保存是重要的種質(zhì)資源保存策略，對其不斷進(jìn)行研發(fā)和創(chuàng)新，具有非常重要的意義。通過吸收和借鑒國內(nèi)外相關(guān)冷凍生物學(xué)的最新研究成果，進(jìn)行冷凍技術(shù)、冷凍工藝等方面的突破，加強(qiáng)技術(shù)創(chuàng)新和集成，使冷凍配子、胚胎等遺傳物質(zhì)的質(zhì)量和解凍后活力有保障，并應(yīng)用于挽救和復(fù)原已經(jīng)滅絕或?yàn)l臨滅絕的動物種質(zhì)資源保護(hù)中，造福于子孫后代。

在動物種質(zhì)資源保護(hù)過程中，根據(jù)珍稀瀕危動物的等級、種類和配子的易獲性等，確定相應(yīng)的配子冷凍保存和利用策略。同時將冷凍保存與國家、地方種質(zhì)資源庫建設(shè)相結(jié)合，通過聯(lián)動協(xié)同，進(jìn)行科研和收集保存胚胎、配子以及體細(xì)胞等遺傳資源，深度開發(fā)利用并向全社會開放，實(shí)現(xiàn)動物種質(zhì)資源和信息的共享。設(shè)立相關(guān)開放課題，提倡全國性或者國際性的合作，使保存的種質(zhì)資源得到充分利用。

建立完善的動物種質(zhì)資源庫，從不同地域尺度布局活體動物保護(hù)，并對胚胎、配子以及體細(xì)胞等遺傳物質(zhì)進(jìn)行保存和更新利用。建立從保護(hù)區(qū)、保種場、資源庫的多級、多樣化種質(zhì)資源保護(hù)、保存機(jī)制，應(yīng)保盡保，使我國的動物種質(zhì)資源得到充分保護(hù)和有效利用，以保證種質(zhì)資源不丟失、不退化和永續(xù)利用。

根據(jù)活體保種的情況，結(jié)合胚胎、配子等遺傳資源的利用，補(bǔ)充活體保種的群體家系數(shù)量，減緩活體保種群近交系數(shù)的上升。同時通過種質(zhì)資源庫保存的遺傳物質(zhì)復(fù)原利用，對建立的保種系統(tǒng)進(jìn)行科學(xué)評價(jià)和修正，使活體保種和種質(zhì)資源庫保存有機(jī)結(jié)合，按照應(yīng)保盡保的原則，多層面、多維度實(shí)現(xiàn)我國種質(zhì)資源的有效保護(hù)和利用。

同時注重種質(zhì)資源庫的更新利用，定期對冷凍保存的精子、卵子等遺傳物質(zhì)的完整性、超微結(jié)構(gòu)以及活力進(jìn)行全面檢測和評價(jià)，并補(bǔ)充新的冷凍精子和卵子等，以保證珍稀瀕危動物種質(zhì)庫的長期安全保存，為我國動物種質(zhì)資源現(xiàn)在和未來的開發(fā)利用提供保障。