綿羊經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)基因研究進(jìn)展及其應(yīng)用

李亭亭，劉秋月，李向臣*，王海濤*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動物科技學(xué)院·動物醫(yī)學(xué)院，杭州 311300；2.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京 100101)

綿羊()起源于現(xiàn)亞洲中西部的新月沃地區(qū)，是世界上最早被人類馴化的家養(yǎng)動物之一。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization of United Nations，F(xiàn)AO)的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，我國是世界上最大的羊肉生產(chǎn)國，其產(chǎn)量幾乎占世界總產(chǎn)量的三分之一。隨著人們對羊肉需求的增加，針對地方綿羊品種繁殖、生長以及抗病性狀等方面的選育越來越受到重視，育種方式也越來越多樣化。

綿羊在上萬年的進(jìn)化過程中經(jīng)歷了長期的人工和自然選擇。在不同地區(qū)和環(huán)境中的綿羊群體為了適應(yīng)自然環(huán)境或人類喜好，會對自身體型、毛色、繁殖、耐受等生理表型進(jìn)行調(diào)整，還會在基因組上留下不同印記，通過對綿羊品種中不同印記進(jìn)行檢測，就能夠?qū)游锏沫h(huán)境適應(yīng)性機制有更好的理解，同時如果能夠找到影響這些表型的遺傳變異，就能極大提升育種的效率。在綿羊上，目前研究者主要針對繁殖、生長、脂尾、抗病及抗逆等幾個與經(jīng)濟(jì)效益關(guān)聯(lián)緊密的性狀，通過家系遺傳定位、比較基因組學(xué)、候選基因關(guān)聯(lián)分析以及全基因組關(guān)聯(lián)分析等手段，先后鑒定獲得綿羊中多個包括增加排卵數(shù)、提高生長速度、增加產(chǎn)肉量以及增強抗病能力的主效基因以及致因位點，如圖1所示。其中部分基因已經(jīng)大范圍運用于綿羊育種實踐，大部分正處于動物個體水平驗證的階段。

圖1 綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀及其相關(guān)基因Fig.1 Important economic traits and related genes of sheep

隨著遺傳修飾技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，一套新的育種策略和方法已經(jīng)逐漸形成。研究者可以通過轉(zhuǎn)基因或基因編輯等方式直接對獲得的候選基因進(jìn)行體內(nèi)功能驗證，極大的縮短了大動物中候選主效基因的驗證周期。針對定位獲得的候選基因，最普遍的做法就是通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將基因進(jìn)行直接敲除，觀察動物表型以確認(rèn)基因功能；通過CRISPR/Cas9結(jié)合同源重組或供體DNA，可以在不完全破壞功能基因的前提下針對特定基因型進(jìn)行定點編輯；更進(jìn)一步，隨著單堿基編輯系統(tǒng)的開發(fā)，目前研究者在無需依賴基因組產(chǎn)生雙鏈斷裂的情況下，可以進(jìn)行高效定點的基因編輯，或者利用先導(dǎo)編輯(prime editor，PE)技術(shù)對基因進(jìn)行插入、缺失等突變體的編輯以確認(rèn)致因突變的價值。本文將目前已研究的相對清楚并影響綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)基因和應(yīng)用情況進(jìn)行了總結(jié)，為以后的綿羊分子育種工作提供參考。

1 綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀及相關(guān)基因

1.1 繁殖性狀

綿羊的繁殖性狀是影響?zhàn)B羊業(yè)最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，可體現(xiàn)在產(chǎn)羔和季節(jié)性發(fā)情兩個方面。目前在綿羊上鑒定出的重要多羔主效基因的多個突變主要集中在變異生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路的相關(guān)基因上，主要有、15、9，另外還包括近年來鑒定出的基因，它是唯一一個不屬于TGF-β信號通路的調(diào)控綿羊排卵數(shù)的基因。而對于影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的研究，鑒定出的基因主要有、1A，可通過綿羊?qū)庹盏姆磻?yīng)來調(diào)控體內(nèi)相關(guān)生殖激素的合成，從而影響發(fā)情。

1.1.1 產(chǎn)羔數(shù)性狀 產(chǎn)羔數(shù)性狀是養(yǎng)羊業(yè)經(jīng)濟(jì)性狀中最重要的生產(chǎn)性狀，受母羊排卵數(shù)、子宮容量等因素影響，其中排卵數(shù)可直接決定母羊的產(chǎn)羔數(shù)和繁殖力。母綿羊產(chǎn)羔數(shù)與排卵數(shù)的相關(guān)性達(dá)到0.96，但產(chǎn)羔數(shù)性狀的遺傳力較低，約為0.11，而排卵數(shù)性狀遺傳力相對較高，自然群體中約為0.19左右，而在選擇群體中可高達(dá)0.30。雌性綿羊在出生前，卵巢上便形成了大量原始卵泡。初情期前，卵泡雖能發(fā)育，但不能成熟排卵，當(dāng)發(fā)育到一定程度時，便閉鎖退化。初情期后，在每個發(fā)情周期中可發(fā)育的卵泡多達(dá)幾十個，但單羔品種最終能發(fā)育到成熟排卵的卵泡一般只有1～2個，其余卵泡中途閉鎖而死亡，而多羔品種則有多個卵泡能發(fā)育成熟并排卵。

目前發(fā)現(xiàn)的多羔主效基因大部分都屬于TGF-β信號通路成員?；?fecundity booroola)是第一個被發(fā)現(xiàn)與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān)的主效基因，1994年，Montgomery等利用微衛(wèi)星標(biāo)記和遺傳連鎖的方法將與Booroola Merino綿羊多產(chǎn)相關(guān)的基因定位到綿羊6號染色體上，之后發(fā)現(xiàn)該基因?qū)嶋H為綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B型基因(bone morphogenetic protein receptor type 1B，1B)編碼區(qū)發(fā)生了A746G突變，造成其編碼的氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼?Q249R)，該位點的突變減弱了BMPR1B在BMP信號通路中的配體功能，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的加速成熟并排卵，使母羊排卵數(shù)增加。經(jīng)過大量研究證實，突變在Booroola Merino綿羊、Javanese Indonesia、小尾寒羊、湖羊、Garole綿羊和Kalehkoohi等多產(chǎn)綿羊品種中均有發(fā)現(xiàn)。TGF-β家族中分別位于綿羊X和5號染色體上的骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bone morphogenetic protein 15，15)和生長分化因子9(growth differentiation factor 9，9)基因，是由歐洲科學(xué)家利用自然突變的高產(chǎn)羔數(shù)綿羊群體，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，利用微衛(wèi)星掃描或者全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study，GWAS)定位獲得的影響綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因，二者有高度的氨基酸序列同源性，通常共同形成異源二聚體作用于BMPRⅡ型受體，并激活Smad2/3(sma- and mad-related，Smad)和Smad 1/5/8信號通路，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖及分化、卵泡發(fā)育以及增加排卵數(shù)。迄今為止，在不同綿羊品種中已識別出15基因的10個與排卵率、繁殖力相關(guān)的點突變，分別具有不同的功能，即、(終止密碼子提前使蛋白合成受損)，、(通過改變閱讀框)，(導(dǎo)致15蛋白功能喪失)，和(與9蛋白相互作用受損)，和(細(xì)胞信號活性改變)以及(未知)。與其他突變不同的是，、和的純合突變不僅不會導(dǎo)致母羊不育，反而使其具有更高的繁殖能力。在9中發(fā)現(xiàn)了11個突變，分別是G1～G8，以及、、，這些突變均可對排卵和產(chǎn)羔造成影響。目前，基因編輯技術(shù)已經(jīng)運用到大動物模型上，研究者們利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了具有g(shù).A746G點突變的綿羊，但有關(guān)這些突變羔羊繁殖能力的研究還未見報道。吳艷芳不僅獲得了突變的灘羊，而且還證明具有突變的灘羊比野生型灘羊具有更高的產(chǎn)羔數(shù)，這些研究為獲得突變的綿羊從而提高綿羊產(chǎn)羔數(shù)提供了一個新的方向。而對于15和9，可能是由于其效應(yīng)位點較多難以選擇或一些綿羊群體中存在自然突變，很少有關(guān)于其在綿羊上的報道，但是有研究人員在豬上引入15無義突變后，觀察到純合突變導(dǎo)致母豬不育，而雜合突變則可增加母豬排卵數(shù)，這一發(fā)現(xiàn)與存在自然突變的綿羊群體中觀察到的現(xiàn)象一致。

上述3個與多羔相關(guān)的主效基因中，多個突變位點的效應(yīng)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)多個綿羊品種中得到證實。近年來研究者還利用其它綿羊群體陸續(xù)在這3個基因中發(fā)現(xiàn)了新的突變，可為綿羊產(chǎn)羔性狀研究提供新的參考。另外，研究者還通過轉(zhuǎn)錄組及代謝組等分析手段，發(fā)現(xiàn)在這3個基因發(fā)生突變的個體中，與胰島素分泌、cAMP、MAPK、Smads、Hippo等相關(guān)的信號通路被顯著富集，且突變個體卵泡液中的葡萄糖6-磷酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等重要代謝物與排卵率的增加顯著相關(guān)，這些研究結(jié)果將有助于深入闡明綿羊多羔性狀的發(fā)生機制。

除TGF-β信號通路之外的產(chǎn)羔數(shù)主效基因也已有報道?；蚴欠▏r(nóng)科院Bodin等從1975到1996年間通過5個世代的選育構(gòu)建Lacaune綿羊的回交家系，又經(jīng)過基因組掃描、高通量測序以及分子生物學(xué)驗證，于2013年定位到了4GALNT2(glycosylation enzyme beta-1,4-N-acetyl galactosaminyltransferase 2)為的主效基因，可能的機制是突變導(dǎo)致了4GALNT2基因在卵泡中的異位表達(dá)，此蛋白在顆粒細(xì)胞中的高表達(dá)會使卵泡中特定靶蛋白的糖基化狀態(tài)改變，進(jìn)而引起了排卵數(shù)的改變。這一發(fā)現(xiàn)揭開了除TGF-β信號通路之外調(diào)控綿羊排卵數(shù)的全新機制。除了基因外，最新的研究也鑒定到一些新的與綿羊產(chǎn)羔相關(guān)的重要基因，并發(fā)現(xiàn)了這些基因上存在的影響產(chǎn)羔數(shù)的多個突變位點，例如、、、等基因，這些功能基因突變之后，會對繁殖相關(guān)的生物學(xué)過程產(chǎn)生影響，如可通過影響排卵過程而導(dǎo)致產(chǎn)羔數(shù)的變化，及其受體可參與卵泡的成熟和發(fā)育，影響胚胎附著和排卵過程，可能通過參與卵母細(xì)胞的發(fā)育而影響產(chǎn)羔數(shù)，則可影響綿羊卵巢和卵泡發(fā)育。另外，研究者還利用產(chǎn)羔數(shù)顯著差異的綿羊個體進(jìn)行比較生物學(xué)研究，從轉(zhuǎn)錄組和蛋白層面鑒定到了多個相關(guān)基因及信號通路，如4、1、2B、1等可分別參與晝夜節(jié)律、代謝和胰島素分泌合成等相關(guān)激素調(diào)節(jié)過程；、和1能影響GnRH活性和生殖激素的釋放；4可調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟；3與能協(xié)同促進(jìn)卵泡成熟和排卵；5可與卵泡發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用，參與卵泡生成，這些結(jié)果使研究者對影響綿羊繁殖性狀的機制多了新的認(rèn)識。

1.1.2 發(fā)情性狀 季節(jié)性發(fā)情是限制綿羊繁殖能力的瓶頸因素之一，經(jīng)過研究者們幾十年的探索，現(xiàn)在基本確定了哺乳動物中光照通過下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)系統(tǒng)引起季節(jié)性發(fā)情，其機制為：眼球視網(wǎng)膜接受光照刺激產(chǎn)生視神經(jīng)沖動，并由下視丘傳至下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，SCN作為動物體內(nèi)最主要的生物鐘，將信號傳至松果體，引起松果體中褪黑素(melatonin，MEL)分泌的改變，之后褪黑素通過HPGA軸進(jìn)一步引起下丘腦中促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)以及相關(guān)生殖激素的合成、釋放，最終調(diào)控動物的季節(jié)性發(fā)情活動。近年來，促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor，)基因和褪黑素受體1A(melatonin receptor 1A，1A)基因被認(rèn)為是影響綿羊季節(jié)性發(fā)情的重要調(diào)控基因，可作為改良綿羊季節(jié)性發(fā)情的重要分子標(biāo)記。

最初在狗的甲狀腺中被發(fā)現(xiàn)，之后通過對生活在不同環(huán)境下的野生和家養(yǎng)品種進(jìn)行選擇分析，發(fā)現(xiàn)在雞和綿羊的馴化過程中均受到強烈選擇，并且可通過HPGA軸通路反饋調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖活動。目前認(rèn)為的調(diào)控方式是下丘腦中的促甲狀腺激素β亞基(thyrotrophin β subunit，)可與結(jié)合，通過cAMP通路調(diào)控四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine，T)與三碘甲狀腺原氨酸(triodothyronine，T)的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而調(diào)節(jié)哺乳動物對光照周期的應(yīng)答與季節(jié)性發(fā)情。研究發(fā)現(xiàn),在Soay綿羊中光照長短能通過調(diào)節(jié)的表達(dá)從而影響綿羊的季節(jié)性繁殖活動。通過對國內(nèi)多個地方綿羊品種的重測序以及分群驗證，證實該基因的多態(tài)性與中國本土綿羊的季節(jié)性發(fā)情行為和繁殖活動顯著相關(guān)。1A基因于1996年首先在西伯利亞倉鼠中被發(fā)現(xiàn)，參與介導(dǎo)褪黑素對哺乳動物生殖活動的影響，隨后在Merinos d’Arles、Aragonesa、Sarda、小尾寒羊等綿羊品種中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)1A基因與綿羊卵巢的排卵活動和產(chǎn)羔頻率相關(guān)。目前，研究者發(fā)現(xiàn)綿羊1基因的不同突變不僅與綿羊的季節(jié)性發(fā)情和產(chǎn)羔有關(guān)，同時某些突變還對雄性綿羊的繁殖活動(如外陰嗅探、爬跨等)產(chǎn)生促進(jìn)作用，被公認(rèn)是調(diào)節(jié)哺乳動物繁殖活動的重要基因。

1.2 生長性狀

畜禽生長性能包括生長速度、活體背膘厚及飼料轉(zhuǎn)化率等，而其中生長速度可體現(xiàn)在肌細(xì)胞的增殖發(fā)育以及骨骼的生長速度兩個方面。一方面，肌肉的形成和再生需通過一個高度精密的調(diào)控過程，使成肌細(xì)胞分化和融合成多核合胞體。在胚胎發(fā)育過程中，中胚層前體細(xì)胞受到周圍組織信號的控制分化為肌源細(xì)胞，其中需要包括Pax7、MyoD和Myf5等因子的上調(diào)，增殖的前體細(xì)胞/成肌細(xì)胞停止細(xì)胞周期并誘導(dǎo)肌肉特異性基因表達(dá)，之后通過一系列高度有序的程序先發(fā)生肌細(xì)胞之間的融合形成新生的肌管，隨后募集和融合額外的成肌細(xì)胞產(chǎn)生多核肌管，最終形成成熟的肌肉纖維。另一方面，骨骼系統(tǒng)包括硬骨、軟骨、肌腱和韌帶等，共同起源于中胚層和神經(jīng)嵴產(chǎn)生的間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)一步分化為構(gòu)成特定骨骼類型的細(xì)胞，這個過程受多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，如FGF、IGF1、MAPK、PI3K/Akt通路都可參與軟骨細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控，軟骨形成后一部分作為永久性軟骨，另一部分可作為生長板形成的模板，這些模板可形成鈣化骨，成為縱向生長的骨骼，BMP信號通路在此過程中起著關(guān)鍵作用。在軟骨中，肥大的軟骨細(xì)胞產(chǎn)生Ihh(indian hedgehog)，作用于生長板增厚帶附近的軟骨膜細(xì)胞，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞成熟后，產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白，包括I型膠原蛋白和骨鈣素，使骨骼有一定的彈性和硬度。

生長激素(growth hormone，)基因是研究較多的促進(jìn)生長發(fā)育的基因，也是線性骨生長的主要調(diào)節(jié)劑，可通過全身和局部胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)的產(chǎn)生來刺激骨骼生長，使機體的生長速度更快。分子育種技術(shù)運用之初，就被通過轉(zhuǎn)基因的方式導(dǎo)入綿羊體內(nèi)獲得生長更快的個體，但是近年來研究較少。

肌肉生長抑制素(myostatin，)，也稱為生長和分化因子8(growth and differentiation factor 8，8)，位于綿羊2號染色體，主要表達(dá)于骨骼肌中，在肌肉分化和生長過程中起負(fù)調(diào)控作用，通過部分抑制成肌細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量，不同畜種中的“雙肌現(xiàn)象”已被證明均是基因突變的結(jié)果。研究表明，可降低肌肉發(fā)育相關(guān)基因7和的表達(dá)，阻斷成肌細(xì)胞的細(xì)胞周期，使其停滯在G1期，抑制成肌細(xì)胞分化。因此，當(dāng)基因敲除之后，蛋白功能受損，則會產(chǎn)生相反的效果，促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致雙肌性狀。迄今為止，已經(jīng)在多個物種中發(fā)現(xiàn)的突變與肌肉質(zhì)量增加相關(guān)，在不同綿羊品種中也發(fā)現(xiàn)了多個突變位點，其中大多數(shù)位于該基因的非編碼區(qū)，這表明位于編碼區(qū)之外的遺傳變異在調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育方面有重要作用。研究表明，綿羊基因3′UTR區(qū)的SNP可將其表達(dá)水平降低約三分之一，且在顯著增加肌肉占比的同時不影響肉品質(zhì)。近年來，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究者已利用原核注射或體細(xì)胞核移植的方式獲得成功敲除的綿羊個體，這些基因編輯個體與野生型綿羊相比，體重顯著增加，骨骼肌纖維肥大，具有雙肌性狀。利用基因編輯的方法能夠快速驗證候選基因在綿羊中的效應(yīng)并評價其運用效果，對綿羊產(chǎn)業(yè)的未來發(fā)展具有重要經(jīng)濟(jì)價值。

細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(suppressors of cytokine signaling，2)是SOCS家族的一員，作為GH信號通路和骨骼生長的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可通過SH2結(jié)構(gòu)域與生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)結(jié)合，對JAK/STAT5b通路起到抑制作用，影響機體的生長、骨骼發(fā)育以及新陳代謝等，表型上可對動物的骨骼線性增長和體重增加產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)2發(fā)生突變時，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能喪失，與受體的結(jié)合也被破壞，從而調(diào)節(jié)下游的GH/IGF1通路，對動物的生長產(chǎn)生促進(jìn)作用。研究表明，2小鼠體型可比野生型大30%～40%，而且這種體重增加是由于內(nèi)臟器官、骨骼長度以及身體長度的顯著增加引起的。Rupp等于2015年首次在Lacaune綿羊中定位到與綿羊體型大小、體重及產(chǎn)奶量顯著相關(guān)的QTL，區(qū)段中包含2基因，當(dāng)編碼SOCS2蛋白SH2結(jié)構(gòu)域的區(qū)段發(fā)生p.R96C點突變時，其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變，導(dǎo)致其與GHR的結(jié)合能力喪失，與野生型綿羊相比，p.R96C純合突變的綿羊的體型、體重分別增加了24%和18%。之后，Zhou等對綿羊2基因進(jìn)行單堿基編輯，將3 mRNA和sgRNA共同注射到綿羊受精卵中，實現(xiàn)了2中p.R96C的單堿基替換，獲得具有點突變的綿羊，證明該基因突變對于綿羊體重和體型有促進(jìn)作用。

除以上提到的基因以及、、基因都可以影響綿羊的生長性狀，基因與有類似的效應(yīng)，也是目前研究人員公認(rèn)的與綿羊臀部肌肉發(fā)育有關(guān)的基因，是影響綿羊肋骨數(shù)的重要分子標(biāo)記，而能夠影響綿羊的眼肌寬度、深度及面積，這些分子標(biāo)記都可對以后的綿羊育種提供重要的指導(dǎo)。

1.3 脂尾性狀

綿羊尾部脂肪是肥尾綿羊儲存能量的重要組織，反映了綿羊?qū)毫雍蜆O端環(huán)境的適應(yīng)性，尾部堆積的大量脂肪不僅可以增強綿羊在極端環(huán)境下的耐寒能力，也可作為遷徙和食物缺乏期間維持機體所需的重要能量來源，對于人類來說，它還可以在干旱和饑荒期間為人類提供高能量的食物。脂肪細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，尾部脂肪的沉積過程包括脂肪細(xì)胞的增殖、分化和成熟階段。間充質(zhì)干細(xì)胞首先分化為前體脂肪細(xì)胞，再轉(zhuǎn)化為具有脂質(zhì)運輸和合成、分泌脂肪細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)等功能的成熟脂肪細(xì)胞，之后沉積在內(nèi)臟器官、皮下或尾部，可為機體維持正常的生命活動提供能量。這些過程由復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)之間相互協(xié)調(diào)，涉及PPAR、MAPK、Wnt/β-catenin、BMP/SMADs、胰島素/IGF1等相關(guān)通路，多與脂質(zhì)形成和代謝相關(guān)。然而，近幾十年來，隨生活水平的提高和飲食習(xí)慣等的改變，綿羊大脂肪尾巴作為能量儲備的優(yōu)勢逐漸減少，生產(chǎn)者和消費者對低脂肉類更感興趣，形成相同質(zhì)量的尾部脂肪比生成等量的肌肉組織需要付出更大的飼養(yǎng)成本，且相同質(zhì)量的肥尾的價格遠(yuǎn)低于瘦肉價格，肥尾還會對母羊繁殖能力產(chǎn)生負(fù)面影響，過多的尾部脂肪沉積極大的降低了養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。因此，探索調(diào)節(jié)綿羊尾部脂肪沉積和發(fā)育的候選基因及遺傳分子機制對培育尾脂較少的綿羊品種具有重要意義。

通過基因組學(xué)方法，已經(jīng)定位到數(shù)個與綿羊尾部脂肪沉積相關(guān)的候選基因，研究較多的為血小板衍生生長因子D(platelet derived growth factor D，)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，2)基因，在不同的綿羊脂尾相關(guān)研究中被多次提到，證明2和基因是影響綿羊肥尾表型的主要因素。其中在全世界不同尾型的綿羊中選擇信號最強，通過激活PDGFRβ來調(diào)節(jié)PPARγ2和C/EBPα的表達(dá)，抑制白色脂肪細(xì)胞分化，也可以通過促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞的形成或增殖來影響脂質(zhì)代謝(如脂質(zhì)合成)，造成綿羊尾部的脂肪沉積。2是脂肪發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子，不僅能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，還可能有助于將能量儲存分配到內(nèi)臟和皮下脂肪組織中。Zhu等的研究表明,2的錯義突變(Ala>Val)與綿羊肥尾表型直接相關(guān)，并參與尾部脂肪沉積。最新研究也表明,2和基因的SNP可能與阿勒泰綿羊的尾脂沉積相關(guān)，但這些基因的具體作用機制還不清晰，后期可作為重要的候選基因繼續(xù)研究和驗證。

近年來有多項全基因組關(guān)聯(lián)研究通過利用地方綿羊品種定位到了多個影響脂尾性狀的候選區(qū)域，其中，1、、1CC、101117953等基因在綿羊尾型性狀中受到強烈選擇。1作為促脂肪因子，可能在胎兒發(fā)育過程中對中胚層細(xì)胞的分化起關(guān)鍵作用，并影響綿羊尾部的脂肪沉積；(也稱為)參與脂肪的發(fā)育和功能，是控制脂肪生成、分化和發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細(xì)胞分化的早期階段就已開始發(fā)揮作用；1CC位于2附近，與2有很強的相關(guān)性，101117953為1的反轉(zhuǎn)錄本(-PPP1CC)，但由于大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄拷貝被認(rèn)為是沒有功能的，所以猜測其可能與1相似，通過影響上游的2來發(fā)揮作用。目前,對綿羊脂尾性狀的研究仍主要集中在2和兩個基因上，研究者們也逐漸發(fā)現(xiàn)了其他有效應(yīng)的突變位點，但還需進(jìn)一步對其進(jìn)行功能驗證和作用機制的探索。除此之外，一些新的相關(guān)基因和通路也逐漸被發(fā)現(xiàn)，也可作為研究其作用機制的參考。

1.4 抗病性狀

在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中，疫病常為養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。而在綿羊中，感染源通常包括細(xì)菌、病毒、寄生蟲等，防治辦法通常有添加抗生素、疫苗預(yù)防或治療，但都會存在相應(yīng)的問題，比如產(chǎn)生耐藥株及疫苗失效等。不同品種的綿羊在對疾病的抵抗力方面存在差異，一旦通過現(xiàn)代基因組學(xué)方法找到與某些疾病抗性相關(guān)的主效基因以及確定相關(guān)突變，就可以更深入地了解與抗性相關(guān)的分子基礎(chǔ)和遺傳變異，結(jié)合現(xiàn)代基因操作技術(shù)就有可能獲得穩(wěn)定的綿羊抗病新品系。動物的抗病性狀的是病原體在與宿主免疫系統(tǒng)對抗過程中被打敗的結(jié)果，其抗性基因的定位大多也集中在病原體識別、免疫因子的分泌、抗感染及相關(guān)通路方面。

線蟲是寄生蟲的一種，而胃腸道線蟲(gastrointestinal nematode，GIN)是對綿羊產(chǎn)業(yè)危害最大的一種線蟲，胃腸道線蟲病是影響全球畜牧生產(chǎn)系統(tǒng)的主要健康問題，動物感染之后可在死亡率、生產(chǎn)力和治療成本方面給全世界造成重大經(jīng)濟(jì)損失，澳大利亞綿羊產(chǎn)業(yè)中每年約有4.3億美元用于與線蟲感染相關(guān)的生產(chǎn)損失和治療成本，是世界各地綿羊和其他放牧反芻動物的最重要的健康疾病之一。在過去的幾十年中，養(yǎng)羊業(yè)越來越依賴驅(qū)蟲藥物作為一種控制寄生蟲病的方法，然而，這種方式不僅花費巨大又通常不是很有效，還會導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)。該病對反芻動物的影響主要反映在體重減輕、腹瀉、厭食、貧血和死亡等方面，而幼齡羔羊又特別容易受到線蟲感染，這是影響綿羊生產(chǎn)的主要經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，大多數(shù)關(guān)于GIN抗性的QTL逐漸被定位出來。Al Kalaldeh等使用GWAS發(fā)現(xiàn)位于綿羊2號染色體上的、6基因與寄生蟲抗性之間存在很強的關(guān)聯(lián)，2、32也被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)部胃腸道線蟲感染的抗性相關(guān)。另外，綿羊?qū)€蟲的抗性及恢復(fù)能力也可能與介導(dǎo)病原體識別(、和基因家族)、先天免疫反應(yīng)(、、、20R)以及對感染的適應(yīng)性反應(yīng)(、2R、-)方面的基因有關(guān)，這些結(jié)果都可為研究綿羊抗胃腸道線蟲感染提供參考。

布魯氏菌病由布魯氏菌()感染所致，它是對反芻動物養(yǎng)殖和人類健康危害極大的人畜共患病，該病主要對動物的生殖系統(tǒng)造成危害，不僅能造成母羊流產(chǎn)、不孕不育，也會造成雄性動物生殖障礙，嚴(yán)重影響牲畜生產(chǎn)性能?？蒲腥藛T對于布魯氏菌病的抗性基因也進(jìn)行了很多的挖掘，目前也有一些收獲。Li等通過構(gòu)建褪黑素合成酶(acetylserotonin O-methyltransferase)基因過表達(dá)載體，成功獲得具有抗布病的轉(zhuǎn)基因綿羊，并證明基因過表達(dá)綿羊可能通過影響免疫相關(guān)的信號通路和腸道微生物群來增強對布魯氏菌病的抵抗力。另一團(tuán)隊通過全基因組重測序分析，確定了4種與綿羊布魯氏菌病易感性相關(guān)的重要途徑以及相關(guān)的候選基因，即粘附小帶(3、3和)、細(xì)胞粘附分子(1、、1和)、唾液分泌(101102109、1和2)和Hippo信號通路(3、1、3)，這些基因與細(xì)胞粘附過程密切相關(guān)，可能有助于機體發(fā)揮免疫功能的第一道屏障。

目前，病原菌疾病相關(guān)的研究很少是在建立動物模型的基礎(chǔ)上來開展的，大多數(shù)仍然是在群體中通過抗病個體來尋找可能的相關(guān)基因，或直接在發(fā)病個體或細(xì)胞水平研究其致病機制，從而來研制治療方法，原因可能是目前大家對這些疾病深入的致病機制仍不清晰，導(dǎo)致即使想要構(gòu)建動物疾病模型卻無從下手。

1.5 羊毛性狀

綿羊毛作為一種天然的蛋白纖維在綿羊養(yǎng)殖業(yè)和紡織業(yè)中都占有重要的經(jīng)濟(jì)地位，也是毛用綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，其品質(zhì)和質(zhì)量可體現(xiàn)在羊毛的長度、細(xì)度、強度等方面。毛發(fā)生長發(fā)生在毛囊發(fā)育的生長期，始于真皮乳頭部周圍的基底膜干細(xì)胞，隨著細(xì)胞系分化的開始而停止分裂，之后細(xì)胞的形狀和位置停止變化，纖維細(xì)胞系開始合成角蛋白(keratin，K)，皮層逐漸角質(zhì)化，非角蛋白細(xì)胞成分逐漸分解，在上層的毛囊中，被皮脂腺和汗腺包裹的富含油脂的纖維從體表長出，形成毛發(fā)。羊毛纖維主要是由角蛋白組成的角質(zhì)層，羊毛角蛋白包括含量較穩(wěn)定的角蛋白中間絲蛋白(intermediate filament proteins，IFPs)和影響羊毛特性的角蛋白聯(lián)合蛋白(keratin associate proteins，KAPs)兩種，而角蛋白基因的表達(dá)可影響羊毛的彎曲、粗細(xì)、重量等重要經(jīng)濟(jì)特征。

綿羊的羊毛性狀是受遺傳、環(huán)境和營養(yǎng)等因素影響的復(fù)雜生理生化特性，許多信號通路和相關(guān)因素都參與到這些經(jīng)濟(jì)特征的調(diào)節(jié)中。成纖維細(xì)胞生長因子是一系列在促進(jìn)和調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞生長中起重要作用的因子，其中成纖維細(xì)胞生長因子5(fibroblast growth factor 5,5)基因已被證實是毛發(fā)生長的抑制劑，沉默5基因的表達(dá)會延長毛發(fā)周期的生長期VI期，導(dǎo)致極長毛發(fā)的表型，而通過靶向使5功能喪失可抑制真皮細(xì)胞的活化和毛發(fā)纖維的合成，促進(jìn)羊毛的生長和增加羊毛產(chǎn)量。除了5基因，影響綿羊毛色的刺鼠信號蛋白(agouti signaling protein，)基因也是影響羊毛質(zhì)量的重要基因，在哺乳動物中可抑制黑色素皮質(zhì)素受體1(melanocortin 1 receptor，1R)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和黑色素的產(chǎn)生，調(diào)控毛發(fā)的顏色，Zhang等利用基因編輯技術(shù)破壞其功能，使綿羊的毛色發(fā)生改變。另外，角蛋白相關(guān)蛋白基因的表達(dá)及其多態(tài)性對綿羊羊毛直徑、韌性、彎曲程度的影響也已在多項研究中被報道。

1.6 抗逆性狀

極端氣候地區(qū)的動物品種通過長期的自然選擇及人工選擇，在生理、生化、形態(tài)等方面獲得了穩(wěn)定的遺傳特征，以適應(yīng)高海拔、低氧、寒冷、干旱或高溫等惡劣環(huán)境。因此，極端環(huán)境中具有特殊環(huán)境適應(yīng)性的物種是挖掘抗逆機制以及候選基因的資源寶庫，如果能在全基因組水平上了解其遺傳基礎(chǔ)并闡明這些分子標(biāo)記，解析動物不同適應(yīng)性表型的遺傳基礎(chǔ)，可為未來氣候環(huán)境變化背景下制定適當(dāng)?shù)挠N計劃提供方向。

1.6.1 高海拔適應(yīng)性狀 生活在高海拔地區(qū)的動物為了適應(yīng)低氧帶來的挑戰(zhàn)，在生理、細(xì)胞水平都發(fā)生了適應(yīng)性變化，比如機體通過降低代謝活性、增加呼吸速率和紅細(xì)胞總量來維持氧氣運輸，以滿足動物維持其正常生長、發(fā)育和繁殖所需的組織氧氣水平。此外，高原動物還會啟動線粒體氧化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起一系列的生理變化，使動物能夠在缺氧條件下生存，而缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)通路及相關(guān)因子在這其中發(fā)揮了重要的作用。藏羊是一種耐低氧物種，生活在極其荒涼的高海拔環(huán)境中，與低海拔地區(qū)相比，該地區(qū)紫外線輻射強、溫度低、氧分壓低。藏羊除了提供優(yōu)質(zhì)的羊毛和肉類外，還具有抗粗飼和適應(yīng)高海拔缺氧等優(yōu)點，可作為一種對極端環(huán)境具有較強適應(yīng)性的模型，從中發(fā)掘一些有助于指導(dǎo)育種實踐的關(guān)鍵基因。目前已有大量關(guān)于高海拔適應(yīng)性的研究報道，例如藏獒(1、1)、牦牛(17、2和3)、藏羚羊(、12和3)和藏野豬(1、42和7)等，這些基因功能涉及缺氧、能量代謝、血管生成、Ca代謝、促進(jìn)紅細(xì)胞生成等方面。

利用高原上的低氧來完成正常的生理功能，這是機體在低氧的惡劣環(huán)境中生存的一種有效方式。近些年的研究報道了許多與低氧適應(yīng)性相關(guān)的候選基因，其中研究最為透徹的基因是1和1，這兩個候選基因都是在HIF通路上游起作用的關(guān)鍵基因。1(endothelial PAS domain protein 1，1)，又稱為2α，通過對不同海拔地區(qū)的山羊進(jìn)行外顯子組測序和基因分型分析，發(fā)現(xiàn)1多態(tài)性在藏絨山羊中顯示出強烈的選擇信號，而Q579L突變對藏絨山羊適應(yīng)高海拔環(huán)境起了關(guān)鍵作用。在綿羊上，Wei等發(fā)現(xiàn)，1基因3′UTR的一個SNP與藏綿羊適應(yīng)高海拔、促進(jìn)紅細(xì)胞生成有關(guān)，另外，該研究也發(fā)現(xiàn)了一些與代謝相關(guān)的基因，如4能維持葡萄糖穩(wěn)定性，參與糖酵解過程；與磷脂代謝相關(guān)；1可激活A(yù)TP生成并減少線粒體ROS的產(chǎn)生。綿羊的靶基因1以及位于7號染色體的7基因在高海拔地區(qū)的綿羊群體中受到顯著的選擇，可能參與高海拔條件下細(xì)胞環(huán)境中可用氧的調(diào)節(jié)或其他調(diào)節(jié)。對于1基因，在綿羊中還未見到有關(guān)其與高海拔適應(yīng)性相關(guān)的報道。

高海拔地區(qū)的生物除了要面對高海拔帶來的缺氧和寒冷問題之外，還要應(yīng)對紫外線強度對身體帶來的損傷，因此紫外線信號通路扮演著重要的角色。在哺乳動物中，高強度的紫外線輻射可誘導(dǎo)大量ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞凋亡、組織損傷和癌癥，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。Zhang等對藏雞的研究發(fā)現(xiàn)，與炎癥和免疫反應(yīng)以及與紫外輻射導(dǎo)致的DNA損傷刺激和DNA修復(fù)過程相關(guān)的基因受到選擇。在對綿羊的研究中，發(fā)現(xiàn)藏羊的和基因、印度肥尾羊的3和3基因受到紫外線照射方面的選擇。從以上研究可以看出，目前參與高強度紫外線輻射適應(yīng)性的研究較少，發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因也有限，并且相互之間的相似性很低。

除了以上提到的相關(guān)基因外，高海拔適應(yīng)相關(guān)的5、、和3基因也受到強烈選擇，但還需要進(jìn)一步的研究和功能驗證。

1.6.2 抗寒冷性狀 由于中國北方高海拔地區(qū)有著漫長而嚴(yán)酷的高寒冬季，綿羊經(jīng)常出現(xiàn)體溫過低的情況，因此，抵御寒冷的能力對其生存至關(guān)重要。為了在處于低溫環(huán)境時維持體溫，綿羊必須增加機體的產(chǎn)熱(生熱)，這包括顫抖生熱(shivering thermogenesis，ST)和非顫抖生熱(non-shivering thermogenesis，NST)，一是通過骨骼肌的快速收縮水解ATP釋放熱量，二是通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放去甲腎上腺素，激活棕色脂肪細(xì)胞表面的受體或募集富含解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein，UCP1)的產(chǎn)熱脂肪細(xì)胞分解甘油三酯產(chǎn)生熱量。據(jù)報道，同一品種內(nèi)不同品系的綿羊抗寒能力存在差異，而綿羊抗寒能力增強的遺傳力約為0.27。

在與抗寒相關(guān)的研究中，UCP家族通常受到強烈選擇。該家族主要包括1、2和3，三者之間有高度同源性，1主要存在于線粒體內(nèi)膜中，是棕色脂肪的標(biāo)志物，2在全身各個組織中均有表達(dá)，3主要分布于骨骼肌和心組織中。先前的報道稱，該家族基因與不同家畜的寒冷適應(yīng)性有關(guān)，存在于綿羊15號染色體上的1基因參與寒冷誘導(dǎo)的非顫抖產(chǎn)熱，2和3基因在綿羊骨骼肌中的表達(dá)對于其適應(yīng)寒冷發(fā)揮著重要作用。通過將印度的一種高海拔綿羊品種Changthangi與分布在平原地區(qū)的綿羊品種相比較，15號染色體基因家族存在最顯著信號，說明該基因可能是參與綿羊適應(yīng)寒冷氣候環(huán)境的重要分子標(biāo)記。

1.6.3 耐高溫性狀 從春季到夏季，氣溫和環(huán)境濕度均升高的綜合影響會導(dǎo)致農(nóng)業(yè)動物的熱應(yīng)激。熱應(yīng)激對動物的飼料消耗、生長速度和繁殖效率影響比較明顯。據(jù)統(tǒng)計，熱應(yīng)激對全球畜牧生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)影響超過12億美元。研究認(rèn)為，熱應(yīng)激會誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，可造成DNA和蛋白質(zhì)的損傷，而ROS的產(chǎn)生被認(rèn)為是誘導(dǎo)熱休克蛋白基因(heat shock protein，)表達(dá)的關(guān)鍵因素。熱應(yīng)激對動物健康有嚴(yán)重影響，它可能導(dǎo)致牲畜的多器官衰竭，降低其生產(chǎn)力和繁殖效率，嚴(yán)重時可造成死亡，但是在沙漠地區(qū)的炎熱氣候下，仍有保持正常生長的綿羊品種，這表明在綿羊上存在耐熱性的遺傳基礎(chǔ)。

目前發(fā)現(xiàn)，與綿羊熱應(yīng)激相關(guān)的基因大多都是屬于家族或相關(guān)成員。熱休克蛋白，也被稱為分子伴侶，可由各種應(yīng)激誘導(dǎo)表達(dá)，被認(rèn)為是細(xì)胞應(yīng)激的保護(hù)劑，可以介導(dǎo)降解受損細(xì)胞內(nèi)的蛋白折疊，這種保護(hù)機制使細(xì)胞能夠在高溫條件下生存。此外，也能促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，而且還和免疫功能相關(guān)。的激活主要是通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factor 1，HSF1)實現(xiàn)的，HSF1是一種響應(yīng)熱應(yīng)激而被激活的轉(zhuǎn)錄因子。白綿羊中發(fā)現(xiàn)，90AA1(HSP90伴侶)基因的多態(tài)性可有效克服熱應(yīng)激并保持正常的生產(chǎn)性能，8基因中的T177P多態(tài)性也與Arabi 綿羊?qū)ρ谉釟夂虻母叨饶蜔徇m應(yīng)性有關(guān)。另外，多浪羊與中國本土其他綿羊品種遺傳距離較大，具有良好的抗逆性和耐熱性，Wang等發(fā)現(xiàn)5(dnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B5)基因多態(tài)性可能參與多浪羊的熱應(yīng)激，5為DNAJ熱休克蛋白40家族伴侶蛋白的一個成員，在免疫細(xì)胞的熱應(yīng)激耐受性中起著至關(guān)重要的作用。

2 總結(jié)與展望

很久以前人們就觀察到某一性狀在不同個體中的差別，但是由于當(dāng)時技術(shù)的局限性，只能通過傳統(tǒng)的雜交育種方式獲得所想要的性狀，而對其背后隱藏的生物學(xué)機制發(fā)掘進(jìn)展緩慢。隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，基于基因組重測序以及GWAS等遺傳定位研究方法的普遍運用，針對綿羊經(jīng)濟(jì)性狀主效基因的研究也較之前有較大進(jìn)展。目前，鑒定出的部分綿羊經(jīng)濟(jì)性狀主效基因及效應(yīng)影響如表1所示，其中部分基因的作用機制已比較明晰，也成功構(gòu)建了動物模型對其功能進(jìn)行驗證。另外通過遺傳定位的方式獲得了一些候選基因，但還需要進(jìn)一步闡明機制和驗證其功能。再加上近年來基因編輯技術(shù)的迅猛發(fā)展，這為快速建立基于基因編輯的動物模型，驗證候選基因在個體水平的效應(yīng)提供了解決方案，也為未來建立具有優(yōu)良性狀的綿羊新品系提供參考。