汪銳 楊穎 龍國賢
(1武漢市第一醫(yī)院腫瘤科,湖北 武漢 430000;2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院腫瘤科)
鼻咽癌是一種起源于鼻咽部黏膜上皮的頭頸部惡性腫瘤,其在我國的發(fā)病率約占全球80%〔1〕。放療是鼻咽癌的首選治療方法,但因部分患者表現(xiàn)出放療抵抗導(dǎo)致其應(yīng)用受限〔2,3〕。因此,深入探討鼻咽癌患者放療抵抗機制,尋找有效提高放療敏感性的方法一直是研究熱點。微小RNA(miRNA)是一類保守的內(nèi)源性非編碼RNA,被證實在鼻咽癌放療抵抗中發(fā)揮著重要作用〔4〕。EB病毒(EBV)感染是鼻咽癌發(fā)病的重要因素,其編碼的miRNAs可通過調(diào)控病毒和宿主細胞中的基因表達,在腫瘤發(fā)生和放療抵抗過程中發(fā)揮重要作用〔5,6〕。研究指出,EBV-miR-BART6-3p可通過調(diào)控長鏈非編碼RNA(lncRNA)LOC553103/stathmin(STMN1)軸抑制鼻咽癌細胞增殖〔7〕,而STMN1在有絲分裂紡錘體形成過程中發(fā)揮著重要作用,且在腫瘤中異常高表達,可通過調(diào)控細胞增殖、凋亡和放療敏感性參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔8,9〕。本研究猜測EBV-miR-BART6-3p可能通過調(diào)控STMN1表達參與鼻咽癌細胞凋亡和放療抵抗,故開展體外細胞實驗加以驗證,旨在揭示鼻咽癌發(fā)生和放療抵抗的分子機制。
1.1材料 熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測試劑盒(貨號:BL705A,南通艾得爾);青霉素鏈霉素雙抗(貨號:15140-122,美國Gibco);脂質(zhì)體2000和Trizol試劑(貨號:11668、15596018,美國Invitrogen);兔抗人STMN1和β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(貨號:ab52630、ab179467,美國Abcam);miR-BART6-3p模擬物(貨號:M-01-S,上海吉瑪);pcDNA3.4-STMN1過表達載體質(zhì)粒(貨號:KL-ZL3152,上海柯雷生物);DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、全蛋白提取試劑盒和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(貨號:90113、T8150、BC3710、CA1020,北京索萊寶);生物顯微鏡(型號:E100,尼康);細胞培養(yǎng)箱(型號:371型,美國Thermo);流式細胞儀(型號:FACSCalibur,美國BD);凝膠成像分析系統(tǒng)、實時熒光定量PCR儀(型號:Gel Doc XR+、CFX96 Touch,美國Bio-Rad);直線加速器(型號:NMSR600,東軟醫(yī)療)。
1.2HNE2細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將購自美國ATCC的人鼻咽癌HNE2細胞接種至DMEM培養(yǎng)基(含1%青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清)中,于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),每2~3 d傳代1次。將對數(shù)生長期的HNE2細胞接種至6孔板上后,培養(yǎng)至70%融合度時,細胞分為對照組(未處理)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照)、miR-BART6-3p組(轉(zhuǎn)染miR-BART6-3p模擬物)、miR-BART6-3p+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-BART6-3p模擬物和pcDNA3.4空載體質(zhì)粒)和miR-BART6-3p+STMN1組(共轉(zhuǎn)染miR-BART6-3p模擬物和pcDNA3.4-STMN1過表達質(zhì)粒),每組設(shè)3個復(fù)孔。按照脂質(zhì)體2000說明書對HNE2細胞進行相應(yīng)轉(zhuǎn)染,48 h后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。
1.3實時熒光定量PCR檢測HNE2細胞中miR-BART6-3p和STMN1 mRNA表達水平 采用Trizol法提取HNE2細胞總RNA后行逆轉(zhuǎn)錄;以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。以U6或β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算HNE2細胞中miR-BART6-3p和STMN1 mRNA表達水平。實驗重復(fù)3次。由上海英捷公司合成的引物序列如下:miR-BART6-3p上游引物5′-GGTCACGGGCA CTCCTTGGATAGGTACC-3′,下游引物5′CCCAGTGAGCTCCACCATCAAA-3′;U6上游引物5′-CTCGC TTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCAC GAATTTGCGT-3′;STMN1上游引物5′-CCTCTGTTTGGCGCTTTTGTGCG-3′,下游引物5′-GGCACGCTTCTCCAGTTCTTTCACC-3′;β-actin上游引物5′-CACCATGAAGATCAAGATCATTGC-3′,下游引5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGC-3′。
1.4流式細胞儀檢測HNE2細胞凋亡 胰蛋白酶消化收集待檢測的HNE2細胞后,使用磷酸鹽緩沖液漂洗細胞2次。以結(jié)合緩沖液重懸細胞,先后加入Annexin V-FITC和PI,避光15 min后,采用流式細胞儀在60 min內(nèi)檢測HNE2細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。
1.5克隆形成實驗檢測HNE2細胞放射敏感性 胰蛋白酶消化收集待檢測的HNE2細胞,調(diào)整細胞密度后根據(jù)X射線照射劑量接種至6孔細胞板上;培養(yǎng)達80%融合度時,分別以0、2、4、6、8 Gy劑量的X射線照射,且每個照射處理設(shè)置3個復(fù)孔;照射結(jié)束后,將細胞置于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 w左右;待有肉眼可見菌落出現(xiàn)時,終止培養(yǎng);磷酸鹽緩沖液洗滌細胞后,以4%多聚甲醛固定15 min;經(jīng)吉姆薩染色20 min后,采用顯微鏡觀察HNE2細胞克隆數(shù),計算HNE2細胞存活分數(shù);采用單擊多靶模型擬合細胞存活曲線。實驗重復(fù)3次。
1.6Western印跡檢測HNE2細胞中STMN1蛋白表達水平 提取HNE2細胞總蛋白,采用二喹啉甲酸法定量蛋白濃度;將變性后的蛋白樣品行電泳分離后,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上;經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后,加入1∶1 000稀釋的一抗室溫孵育過夜;再以1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育2 h,用化學(xué)發(fā)光劑于暗室內(nèi)顯影曝光;β-actin為內(nèi)參,凝膠成像系統(tǒng)分析HNE2細胞中STMN1蛋白表達水平。實驗重復(fù)3次。
1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。
2.1各組HNE2細胞中miR-BART6-3p表達水平比較 miR-NC組HNE2細胞中miR-BART6-3p表達水平與對照組(1.02±0.11 vs 0.98±0.07)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.531,P=0.623);而miR-BART6-3p組HNE2細胞中miR-BART6-3p表達水平顯著高于miR-NC組(24.58±3.26 vs 1.02±0.11,t=12.510,P=0.000)。
2.2miR-BART6-3p對HNE2細胞凋亡的影響 miR-NC組HNE2細胞凋亡率與對照組(7.96±1.03 vs 8.62±1.25)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.706,P=0.519);而miR-BART6-3p組HNE2細胞凋亡率顯著高于miR-NC組(20.25±3.10 vs 7.96±1.03,t=6.516,P=0.003)。見圖1。
2.3miR-BART6-3p對HNE2細胞存活分數(shù)的影響 對照組、miR-NC組和miR-BART6-3p組HNE2細胞存活分數(shù)均呈X射線照射劑量依賴性降低(P<0.05);相同劑量X射線照射后miR-NC組中HNE2細胞存活分數(shù)與對照組無明顯改變(P>0.05);而2、4、6、8 Gy miR-BART6-3p組HNE2細胞的存活分數(shù)顯著低于miR-NC組(P<0.05),且增敏比SER為1.56。見表1。
圖1 流式細胞儀檢測HNE2細胞凋亡
表1 各組HNE2細胞存活分數(shù)比較
2.4miR-BART6-3p對HNE2細胞中STMN1表達的影響 miR-NC組HNE2細胞中STMN1 mRNA和蛋白表達水平與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而miR-BART6-3p組中STMN1 mRNA和蛋白表達水平顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖2和表2。
1~3:對照組、miR-NC組、miR-BART6-3p組圖2 Western印跡檢測STMN1蛋白表達
表2 各組細胞中STMN1 mRNA和蛋白表達 水平比較
2.5STMN1過表達逆轉(zhuǎn)miR-BART6-3p對HNE2細胞存活分數(shù)及凋亡率的影響 miR-BART6-3p組細胞凋亡率〔(20.83±2.32)%〕顯著高于miR-NC組〔(7.16±1.05)%,P<0.05〕,且放射增敏比SER為1.48;miR-BART6-3p+STMN1組HNE2細胞中STMN1 mRNA和蛋白表達水平顯著高于miR-BART6-3p+pcDNA組,細胞凋亡率顯著低于miR-BART6-3p+pcDNA組(P<0.05)。miR-BART6-3p+pcDNA 組和miR-BART6-3p+STMN1組細胞存活分數(shù)均呈X 射線照射劑量依賴性降低(P<0.05);而miR-BART6-3p+pcDNA 組細胞存活分數(shù)顯著低于 miR-BART6-3p+STMN1組(P<0.05)。且放射增敏比SER為0.75。見圖3、圖4和表3,表4。
1,2:miR-BART6-3p+pcDNA組,miR-BART6-3p+STMN1組圖3 Western印跡檢測STMN1蛋白表達
圖4 流式細胞儀檢測細胞凋亡
表3 STMN1過表達后HNE2細胞存活分數(shù)比較
表4 STMN1過表達后HNE2細胞凋亡率比較
EBV BART miRNA(EBV-miR-BART)在鼻咽癌EBV編碼的miRNA中表達量最高〔10〕,與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔11~13〕。李劍飛等〔14〕指出,鼻咽癌中異常高表達的EBV-miR-BART4和EBV-miR-BART8-3p可作為鼻咽癌診斷防治的潛在標(biāo)志物。Lin等〔15〕研究指出,EBV-miR-BART8-3p在鼻咽癌中呈高表達,可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和Erk1/2通路靶向RNF38誘導(dǎo)鼻咽癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化并促進其轉(zhuǎn)移。Wu等〔16〕報道指出,EBV-miR-BART4在鼻咽癌中表達上調(diào),且其表達水平的改變與患者臨床分期、淋巴結(jié)腫大程度和分化程度有關(guān),而下調(diào)miR-BART4表達可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移,促進細胞凋亡并增強細胞的放射敏感性。
miR-BART6-3p是EBV-miR-BART中的一員,可通過調(diào)控腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移在鼻咽癌中發(fā)揮著抑癌作用〔17〕,本研究結(jié)果表明,miR-BART6-3p過表達可誘導(dǎo)鼻咽癌HNE2細胞凋亡并增強其放射敏感性。STMN1是一種與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的微管解聚蛋白,可通過調(diào)控微管動力,在細胞分裂、增殖和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用〔18〕。Hsu等〔19〕研究指出,STMN1在鼻咽癌中呈高表達,且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。汪文利等〔20〕研究指出,沉默STMN1表達可通過抑制SHH信號通路活化促進鼻咽癌細胞凋亡,增強腫瘤細胞對順鉑的敏感性。Sun等〔9〕研究指出,下調(diào)STMN1表達可增強鼻咽癌細胞的放射敏感性。可見,STMN1與鼻咽癌發(fā)病及放療抵抗密切相關(guān)。Wang等〔7〕研究指出,miR-BART6-3p在鼻咽癌中可通過靶向吸附LOC553103間接調(diào)控STMN1表達;猜測miR-BART6-3p可能通過調(diào)控STMN1參與鼻咽癌細胞凋亡和放療抵抗過程。本研究結(jié)果提示在鼻咽癌中miR-BART6-3p促凋亡及放射增敏作用可能與其調(diào)控STMN1表達有關(guān)。本研究結(jié)果表明,miR-BART6-3p可通過下調(diào)STMN1表達促進HNE2細胞凋亡并增強細胞放射敏感性。
綜上,miR-BART6-3p與鼻咽癌發(fā)病及放療抵抗密切相關(guān),其可通過下調(diào)STMN1表達誘導(dǎo)鼻咽癌HNE2細胞凋亡并增強細胞的放射敏感性。