Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)的cSN50.1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響

欒海艷 譚晶 趙曉蓮 孫潔 張國(guó)艷 辛華

(佳木斯大學(xué) 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3附屬第一醫(yī)院)

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)65歲以上的糖尿病患者約為3 550萬(wàn)，占世界糖尿病老年患者的1/4，居全球首位〔1〕。老年糖尿病的特點(diǎn)是患者年齡較大、病程較長(zhǎng)，罹患慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)和病情危重程度較高，其致殘和致死率也較其他患者更高〔2〕。糖尿病腎臟病(DKD)是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，且一旦出現(xiàn)，多數(shù)將發(fā)展成終末期腎病(ESRD)，同時(shí)也是糖尿病致殘致死的重要原因〔3,4〕。因此，如何有效防治糖尿病腎臟病已成為臨床目前十分重要和急需解決的問(wèn)題。本文擬分析人工合成的多肽cSN50.1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2轉(zhuǎn)分化的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：人腎近曲小管細(xì)胞HK-2來(lái)源于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。主要試劑：細(xì)胞培養(yǎng)用試劑均來(lái)源于美國(guó)HyClone公司、浙江天杭生物科技股份有限公司、上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒和XAV939〔β-連環(huán)蛋白(catenin)抑制劑〕、甘露醇、D-半乳糖均來(lái)源于大連美侖生物技術(shù)有限公司；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)鼠抗人多克隆抗體，波形蛋白(Vimentin)、E-鈣黏蛋白(cadherin)、β-catenin、組蛋白(Histone)、β-肌動(dòng)蛋白(actin)兔抗人多克隆抗體均來(lái)源于Affinity Biosciences公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG均來(lái)源于武漢博士德生物工程有限公司；Western印跡及蛋白提取所用相關(guān)試劑均來(lái)源于上海碧云天生物技術(shù)有限公司和武漢博士德生物工程有限公司；cSN50.1多肽由吉爾生化(上海)有限公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 把HK-2細(xì)胞置于5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱，用含15%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗(100×)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至密度80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化，按1∶3進(jìn)行傳代。

1.3CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞消化后調(diào)整濃度至1.0×105個(gè)/ml，按100 μl/孔接種至96孔板，待其完全貼壁后，隨機(jī)分為0、10、30、50 μmol/L組，棄去培養(yǎng)液，分別給予相應(yīng)濃度cSN50.1進(jìn)行干預(yù)48 h，再加入CCK-8溶液10 μl/孔，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的光密度值(450 nm 波長(zhǎng))。

1.4細(xì)胞形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn) 將HK-2細(xì)胞消化后分為6組：對(duì)照組、HO組、HG組、cSN50.1各劑量組(10、30、50 μmol/L)，對(duì)照組采用正常DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，HO組采用含24.5 mmol/L甘露醇的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，HG組采用含高糖的DMEM培養(yǎng)液(25 mmol/L D-半乳糖)進(jìn)行培養(yǎng)，cSN50.1各劑量組分別采用含10、30、50 μmol/L cSN50.1的高糖培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)48 h，再于倒置顯微鏡下觀察記錄各組HK-2細(xì)胞的形態(tài)變化情況。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn) 將HK-2細(xì)胞分為5組：對(duì)照組、HO組、HG組、XAV939組和cSN50.1組。對(duì)照組、HO組、HG組培養(yǎng)條件同前，XAV939組采用含1 μmol/L的XAV939高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，cSN50.1組采用含30 μmol/L cSN50.1的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)(cSN50.1劑量由前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出)，培養(yǎng)48 h后，采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)各組HK-2細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞總蛋白采用含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液提取后用于檢測(cè)α-SMA、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)情況；采用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)胞核與胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒分別提取HK-2細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核蛋白后檢測(cè)其β-catenin蛋白的表達(dá)情況。二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)已提取蛋白的濃度，95℃5 min進(jìn)行蛋白加熱變性。按照每孔20 μg蛋白上樣，12%分離膠行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；恒流200 mA進(jìn)行濕轉(zhuǎn)；室溫條件下用5%的脫脂奶粉封閉1 h，再加入適宜比例的一抗，4℃過(guò)夜孵育。次日，用TBST洗液洗膜3次，室溫孵育相應(yīng)的二抗1 h；再次TBST洗膜3次，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)曝光、拍攝和分析。細(xì)胞中α-SMA、Vimentin和、E-cadherin蛋白和胞質(zhì)β-catenin蛋白的表達(dá)結(jié)果以目的蛋白與β-actin灰度值的比值來(lái)表示其相對(duì)含量，胞核β-catenin蛋白的表達(dá)結(jié)果以目的蛋白與Histone灰度值比值來(lái)表示其相對(duì)含量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1cSN50.1對(duì)HK-2細(xì)胞增殖的影響 與0 μmol/L組(3.72±0.03)相比，10 μmol/L組和30 μmol/L組OD值(3.73±0.06、3.77±0.11)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，而50 μmol/L組(2.34±0.24)明顯降低(P<0.05)。

2.2cSN50.1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組和HO組均呈“鋪路石”樣的典型上皮樣細(xì)胞形態(tài)；無(wú)明顯差異；HG組細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，且大小和形態(tài)不一；給予cSN50.1干預(yù)后，10、30、50 μmol/L組長(zhǎng)梭形細(xì)胞均明顯減少，但50 μmol/L組細(xì)胞數(shù)量有所減少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)(×100)

2.3cSN50.1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中α-SMA、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，HO組細(xì)胞中α-SMA、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05)，HG組α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)均明顯增高，而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。給予XAV939干預(yù)后，與HG組相比，XAV939組α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)均明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)；給予cSN50.1干預(yù)后，與HG組相比，cSN50.1組細(xì)胞中α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)均明顯降低、E-cadherin蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖2。

表1 各組細(xì)胞中α-SMA、Vimentin、E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞中α-SMA、Vimentin和 E-cadherin蛋白表達(dá)

2.4cSN50.1對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中胞核內(nèi)外β-catenin蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，HO組胞質(zhì)和胞核中β-catenin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)，而HG組表達(dá)均明顯增高(P<0.05)。與HG組相比，給予XAV939干預(yù)后，胞質(zhì)和胞核中β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；而給予cSN50.1干預(yù)后，β-catenin蛋白表達(dá)在胞質(zhì)中無(wú)明顯變化(P>0.05)，但在胞核中明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖3。

圖3 各組細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá)

3 討 論

腎小管間質(zhì)纖維化(TIF)是早期糖尿病腎臟病的病理變化之一，當(dāng)糖尿病患者尿白蛋白排泄率還處于正常范圍內(nèi)時(shí)，作為早期腎小管間質(zhì)病變的敏感生物標(biāo)志物的腎損傷分子(KIM)-1就已經(jīng)顯著升高，且增高程度與腎小管病變程度呈正相關(guān)〔5〕。腎小管間質(zhì)纖維化不但在糖尿病腎臟病的發(fā)病時(shí)間和機(jī)制上均具有獨(dú)立性〔6，7〕，還是所有腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同特征之一。且其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)是腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)，此時(shí)的小管上皮細(xì)胞已喪失了黏附特性，其表皮黏附分子E-cadherin的表達(dá)降低〔8〕，而間充質(zhì)細(xì)胞表型蛋白α-SMA和Vimentin的表達(dá)則上升〔9〕，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)大量堆積，細(xì)胞因子出現(xiàn)異常表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞中的α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)增高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，與相關(guān)研究報(bào)道一致〔10〕。

β-catenin是一種細(xì)胞骨架蛋白，是Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵性分子，在多種病因誘發(fā)的腎間質(zhì)纖維化中均發(fā)揮重要作用〔11～13〕。β-catenin可與E-cadherin在細(xì)胞膜上結(jié)合形成細(xì)胞黏附連接復(fù)合體，通過(guò)介導(dǎo)同型細(xì)胞之間的黏附，來(lái)維持正常上皮細(xì)胞的完整性和極性，從而防止細(xì)胞遷移發(fā)生。當(dāng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被異常激活時(shí)，E-cadherin/β-catenin復(fù)合體將發(fā)生解聚，使細(xì)胞的黏附能力降低；同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)游離的β-catenin則因?yàn)椴荒鼙患皶r(shí)磷酸化降解，大量在胞質(zhì)內(nèi)積聚，并被轉(zhuǎn)運(yùn)入胞核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子(TCF/LEF)結(jié)合，引起下游的致EMT和纖維化的靶基因表達(dá)增強(qiáng)，繼而腎小管上皮細(xì)胞基底膜被破壞，細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化和遷移，進(jìn)而導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展〔14，15〕。本研究結(jié)果表明Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與了高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

cSN50.1是一種人工合成的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)肽(NTM)，為26 或28 個(gè)氨基酸片段連接的多肽，由人類成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-4 疏水區(qū)信號(hào)序列(SSHR)和人核因子(NF)-κB1核定位序列組成。核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(importin)能識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)中大分子量蛋白中的核定位信號(hào)(NLS)，與之結(jié)合后形成復(fù)合物，再經(jīng)核孔復(fù)合體(NPC)把其運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)，家族成員包括importin α和importin β，可以單獨(dú)或聯(lián)合起來(lái)完成核轉(zhuǎn)錄因子的入核轉(zhuǎn)運(yùn)〔16，17〕。有文獻(xiàn)報(bào)道，cSN50.1能與importin α5和importin β1結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制importin對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子的入核轉(zhuǎn)運(yùn)〔18，19〕。而importin β1又可以調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中β-catenin的入核轉(zhuǎn)運(yùn)〔20〕。本研究結(jié)果提示，cSN50.1能夠改善高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，且該作用可能是通過(guò)調(diào)控β-catenin入核轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而影響EMT相關(guān)因子表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。