丁二酸和4-氨基安替吡啉構(gòu)筑的Co(II)配合物與DNA之間的相互作用

李小芳,馮小強(qiáng),馬金霞

(天水師范學(xué)院 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,甘肅 天水 741001)

1 前 言

DNA 是抗癌試劑中的主要靶向分子,抗腫瘤藥物、抗瘧疾藥物以及抗菌素都是以DNA 為作用標(biāo)靶來設(shè)計(jì)的[1]。藥物分子發(fā)揮藥效的能力與嵌插結(jié)合DNA 的作用方式及作用程度有關(guān)。為了克服順鉑類抗癌藥物毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn),研發(fā)新型、高效和低毒副作用的金屬配合物類抗腫瘤藥物受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2-3],金屬配合物在臨床、分析和工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用,并在許多領(lǐng)域發(fā)揮著重要的作用。

鈷元素是許多生理活動(dòng)的基本元素,在許多金屬蛋白中都存在。鈷配合物的設(shè)計(jì)合成、生物活性以及與DNA 之間的作用方式研究,對(duì)明確配合物的生物效應(yīng)及某些抗腫瘤藥物機(jī)理都具有十分重要的意義[4-5]。盧靜等[6]以8-氨基喹啉、鈷離子為原料,合成的配合物[Co L2](ClO4)3CH3CH2OH (L=8-(2-甲基吡啶)-氨基喹啉)具有較好的化學(xué)核酸酶活性；鄭德論等[7]以羥基乙酸(GA)和1,10-鄰菲咯啉(phen)作為配體,合成的Co(GA)2(phen)·2 H2O 具有化學(xué)核酸酶活性,能對(duì)質(zhì)粒體超螺旋DNA 產(chǎn)生切割作用；宋玉民等[8]合成的配合物[Co(phen)3]3+與DNA 之間存在插入作用；張永坡等人合成了喹啉類單核鈷配合物[Co L(H2O)3]·H2O 與CT-DNA 之間存在嵌插鍵合,以H2O2作為誘導(dǎo)劑能切割DNA,切割機(jī)理為氧化切割[9]。

考慮到丁二酸的良好配位功能,及4-氨基安替吡啉衍生配體及其金屬配合物的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)尚鮮見報(bào)道,本研究以丁二酸、4-氨基安替吡啉為配體,合成了一種Co(II)為中心離子的三元配合物,以鯡魚精DNA 為靶點(diǎn),通過紫外吸收光譜、循環(huán)伏安法和DNA粘度滴定實(shí)驗(yàn),探討了該配合物與鯡魚精DNA 之間相互作用的方式,并測(cè)試了配合物對(duì)金黃色葡萄球菌(St.aureus)的抑菌性能。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材料與儀器

AAP(分析純)；CoCl2·6 H2O(分析純)；SA(分析純)；鯡魚精DNA(Sigma產(chǎn)品)；金黃色葡萄球菌(St.aureus,ATCC 26113),牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,瓊脂培養(yǎng)基。

UV-2450紫外可見光譜儀；CHI660B型電化學(xué)工作站；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀。

2.2 配合物的合成

用30 m L 無水乙醇溶解0.30 g SA,并加入NaOH 溶液調(diào)節(jié)其p H 值至5.0～6.0。用15 m L 無水乙醇溶解0.52 g AAP,然后將上述SA 和AAP混合后在60 ℃水浴中恒溫?cái)嚢?0 min,少量多次加入0.60 g CoCl2·6 H2O 繼續(xù)恒溫回流6h,抽濾,用無水乙醇洗滌沉淀數(shù)次,干燥至恒重,得到丁二酸-4-氨基安替吡啉-鈷配合物。將Co(II)配合物溶于N,N-二甲基甲酰胺(NMF)中,測(cè)得其摩爾電導(dǎo)率Λm=0.154 S·m2·molˉ1,說明配合物在NMF中不電離,是以中性分子形式存在,屬于非電解質(zhì)；元素分析理論值:C 56.32,H 5.71,N 8.57；實(shí)測(cè)值:C 56.64,H 5.63,N 8.62；UV-Vis(DMF),λmax/nm:209,254,293；IRmax:3387cmˉ1(υO(shè)-H/H2O),1636 cmˉ1(υC=N),1383 cmˉ1(υC-O),547 cmˉ1(υM-O),466 cmˉ1(υM-N)。

2.3 配合物與鯡魚精DNA之間的相互作用表征

紫外吸收光譜測(cè)定:在參比池和樣品池中分別加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺和配合物溶液,掃描測(cè)定其紫外吸收光譜,之后,用等量的1 mg/m L DNA分別滴定參比池和樣品池,作用5 min后,再掃描測(cè)定其紫外吸收光譜。

粘度測(cè)定:固定DNA 濃度為0.5 mg/m L,以不同的比例R(Ccomplex/CDNA)加入配合物,恒定溫度25 ℃,反應(yīng)24 h,測(cè)定混合溶液的粘度,得到(η/η0)1/3與配合物濃度的關(guān)系。其中η為加入配合物后DNA溶液的粘度,η0為加入配合物前DNA 溶液的粘度。

采用循環(huán)伏安法表征“相互作用”:采用三電極體系,工作電極為玻碳電極,對(duì)電極為Pt片電極,輔助電極為甘汞電極,以Na Ac-HAc(p H=6.0)緩沖溶液為底液,在ˉ0.6～1.2 V 電位范圍內(nèi)掃描。

2.4 抑菌活性測(cè)定

先將受試菌種St.aureus接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,活化后用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成O.D610nm=0.2的菌懸液備用。同時(shí),將受試菌種接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃下St.aureus活化48 h后,用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成O.D610=0.224的菌懸液備用。接著取直徑為6 mm 已滅菌的圓濾紙片分別浸泡在濃度為0.2 mg/m L的SA、AAP及配合物溶液中。最后將上述0.1 m L菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上,用無菌鑷子取處理過的濾紙片,貼于培養(yǎng)基上,每皿貼3片。以DMF 作為空白對(duì)照。37 ℃恒溫培養(yǎng),測(cè)定圓濾紙片的抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與討論

3.1 配合物與鯡魚精DNA之間的相互作用

3.1.1 紫外吸收光譜表征 當(dāng)小分子中加入DNA 后,倘若吸收光譜出現(xiàn)減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象,則說明小分子與DNA 之間發(fā)生了嵌插作用,且減色程度能反映插入試劑與DNA 結(jié)合的強(qiáng)度與能力[11]。如圖1所示:配合物原位于209.5 nm 和254 nm 處的吸收峰,吸光度分別為1.575 和1.215,在加入500μL DNA 后吸收峰波長分別藍(lán)移至204.8 nm 和241.2 nm處,吸光度下降至1.285和1.069。但是,原位于283 nm 處的吸收峰紅移至288.6 nm 處,紅移了5.6 nm,吸光度由0.903下降至0.674,減色25.4%。根據(jù)紫外吸收光譜的變化,初步推斷配合物與DNA之間發(fā)生了相互作用。

圖1 DNA 加入前后配合物的紫外-可見吸收光譜Fig.1 UV absorption spectra of complex addition DNA before and after

根據(jù)摩爾比法,以DNA 的濃度對(duì)254nm 處的吸光度作圖,得圖2。圖2(a)所示結(jié)合比n(DNA)∶n(配合物)=1∶1。為了定量比較配合物與DNA 的結(jié)合力,以1/(A0ˉA)～1/CDNA作圖,得線性擬合方程1/(A0ˉA)=0.882+2.21/(CDNA),在室溫下配合物與DNA 的結(jié)合常數(shù)為3.770×103L·molˉ1,如圖2(b)所示。

圖2 配合物-DNA 體系的摩爾比圖(a)和雙倒數(shù)曲線(b)Fig.2 Molar ratio plots(a)and double reciprocal plots(b)of complex-DNA system

3.1.2 循環(huán)伏安法表征 在ˉ0.6～1.2 V 電位范圍內(nèi)掃描,發(fā)現(xiàn)配合物在玻碳電極上有電化學(xué)行為,如圖3(a)所示。當(dāng)掃描速率為1.8 V/s時(shí),在配合物0.5867 V 和ˉ0.0461 V 處出現(xiàn)兩個(gè)氧化峰,峰電流分別為ˉ3.084×10ˉ4A 和ˉ1.918×10ˉ4A。通過改變掃描速率,發(fā)現(xiàn)氧化峰電流隨掃描速度的不斷增大而增大,氧化峰電位也隨之發(fā)生正移。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的掃描范圍內(nèi)(ˉ0.6～1.2 V),通過繪制Ipa～υ圖,發(fā)現(xiàn)氧化峰電流與掃描速度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:Ipa=ˉ0.839ˉ1.434υ(R=0.976),如圖3(b)所示,表明配合物在玻碳電極上的電化學(xué)行為主要是由吸附過程控制的[10]。

圖3 掃描速率對(duì)配合物循環(huán)伏安曲線的影響(a)及Ipa～υ曲線(b)Fig.3 Effect of scan rate on the CV curves of complex(a)and Ipa～υrelationship curve(b)

固定掃描速率為0.5V/s,以Fe(CN)63ˉ/4ˉ為電化學(xué)活性物質(zhì),在ˉ0.6～1.6 V 范圍內(nèi)掃描其循環(huán)伏安曲線,結(jié)果如圖4所示。Fe(CN)63ˉ/4ˉ在0.515 V/ˉ2.822×10ˉ4A 處出現(xiàn)了氧化峰,加入一定量的DNA 后,氧化峰正移,還原峰負(fù)移至0.231 V/3.384×10ˉ4A,往DNA/Fe(CN)63ˉ/4ˉ體系中加入400μL配合物后,其氧化峰正移至0.612 V,還原峰負(fù)移至0.1304 V,電流分別下降至ˉ2.431×10ˉ4A 和3.086×10ˉ4A。Bard[12]提出,當(dāng)小分子與DNA 發(fā)生作用時(shí),如果峰電位向負(fù)方向偏移,說明小分子與DNA 之間存在靜電作用；反之,如果峰電位向正方向偏移,說明小分子與DNA 之間存在嵌插結(jié)合作用。由圖4可知,在加入DNA 后配合物的氧化峰電位不斷正移,還原峰電位不斷負(fù)移,電位差逐漸增大,即ΔEp增大,表明配合物與DNA 是以嵌插方式發(fā)生相互作用。

圖4 含配合物的Na Ac-HAc緩沖溶液中的K 4 Fe(CN)6在DNA 電極上的循環(huán)伏安圖Fig.4 CV curves of K4 Fe(CN)6 in Na Ac-HAc buffer solution containing complex

3.2 抑菌活性測(cè)定

3.1.3 DNA粘度法表征 已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13],當(dāng)具有適當(dāng)大小平面結(jié)構(gòu)的配合物與DNA之間發(fā)生嵌插結(jié)合作用后,能使DNA 解螺旋,從而增加了DNA 螺旋鏈的長度,最終表現(xiàn)為DNA黏度的增大；當(dāng)兩者以靜電、溝面結(jié)合等非插入方式產(chǎn)生相互作用時(shí),溶液的粘度無明顯變化；以部分插入方式與DNA 產(chǎn)生相互作用時(shí),則可能使雙螺旋發(fā)生扭結(jié),使其粘度減小。配合物對(duì)DNA粘度的影響如圖5所示,隨配合物的加入及其濃度的增加,導(dǎo)致DNA的相對(duì)黏度增大,表明配合物以嵌插方式與DNA 相結(jié)合,這與上述的紫外光譜法以及循環(huán)伏安法表征結(jié)果相一致。

圖5 配合物對(duì)DNA 粘度的影響Fig.5 Influence of complex on DNA viscosity

通常以抑菌圈直徑的大小作為抑菌效果的評(píng)定指標(biāo),抑菌圈直徑越大,則抑菌劑對(duì)供試細(xì)菌的抑制效果越好,反之則抑制效果越差。以DMF 作為空白對(duì)照樣,其對(duì)St.aureus沒有任何抑菌效果。配體和配合物對(duì)St.aureus的抑菌圈照片如圖6所示,可以看出,SA、AAP和配合物分別作用于St.aureus后,均具有明顯的抑菌圈,并且配合物的抑菌圈直徑大于單一的兩種配體。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明了配合物對(duì)St.aureus的生長具有較好的抑制作用,與金屬絡(luò)合可以增強(qiáng)配體的活性。金屬鈷離子可稱為“超級(jí)酸”,與有機(jī)物SA 和AAP配位后,金屬的正電荷部分與配體中的供體原子共享,并且在配體上方有一個(gè)電子離域整個(gè)螯合環(huán),分子表面的正電荷密度增加,增強(qiáng)了將聚陽離子吸附到帶負(fù)電荷的細(xì)菌表面的能力,從而顯示出較強(qiáng)的抑菌效果。

圖6 AAP(a)、SA(b)和配合物(c)作用于St.aureus的抑菌照片F(xiàn)ig.6 Inhibition zone of SA,AAP and complex against St.aureus

4 結(jié) 論

配合物中加入DNA 后,其吸收峰出現(xiàn)明顯的減色和紅移,且減色和紅移程度與DNA 加入量呈正相關(guān),配合物與DNA 形成1∶1的復(fù)合物,結(jié)合常數(shù)為3.77×103L·molˉ1；配合物中加入DNA 后,其氧化還原峰的峰電位也發(fā)生正移,峰電流減??；DNA 的粘度隨配合物的加入而增大。因此,可以判斷配合物以嵌插方式與DNA 發(fā)生了相互作用,采用抑菌圈法研究發(fā)現(xiàn)配合物的抑菌活性大于單一的兩種配體。其體內(nèi)、體外抗腫瘤活性以及藥效學(xué)性質(zhì)尚待進(jìn)一步研究。