強(qiáng)蠕通便方對(duì)慢傳輸型便秘大鼠的治療作用及機(jī)制研究

王 松，張兆鵬，謝璐璐，連春雨，肖鈺雪，史曉梅，王鑫赫，劉玉彤，張海鵬，劉宏巖

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

慢傳輸型便秘（STC）是結(jié)腸動(dòng)力減弱、傳輸功能減慢、腸內(nèi)容物停留時(shí)間延長(zhǎng)、水分過度吸收而出現(xiàn)的便秘[1]。STC 是功能性便秘（FC）的一種，其發(fā)病率約占FC的45.5%[2]，其患病率隨生活壓力的增加、飲食結(jié)構(gòu)與生活方式的改變、人口老齡化的加劇而逐年遞增。STC 發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前研究涉及了腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸道平滑肌、Cajal 間質(zhì)細(xì)胞、水通道蛋白、腸道菌群等多個(gè)方面[3-6]。

劉宏巖教授對(duì)于STC的治療有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為“陽虛濕盛，氣機(jī)升降失調(diào)”為STC 的根本病機(jī)?；诖耍岢隽艘鏆鉁乩镄袣饣瘽裢ū惴úM強(qiáng)蠕通便方治療STC。本實(shí)驗(yàn)旨在探究強(qiáng)蠕通便方對(duì)STC 模型大鼠的通便效果及作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。

1.2 藥物 強(qiáng)蠕通便方（炙黃芪、人參、茯苓、炒白術(shù)、姜厚樸、炒枳實(shí)、豆蔻、干姜、酒肉蓯蓉、鎖陽、炮附子、炙甘草）及生大黃均購于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院。枸櫞酸莫沙必利片（福建海西新藥創(chuàng)制有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片5 mg）。生大黃粉懸濁液制備：將生大黃粉碎，后過100 目篩，純凈水混合均勻。強(qiáng)蠕通便方藥液制備：將炮附子先煎煮1 h，與此同時(shí)浸泡余藥，混合所有藥液武火煮沸后文火煎煮40 min，將藥液濾出，再加水煎煮40 min，將兩次濾液混勻，濃縮成2.67 g/mL 的藥液，晾至室溫，密封后4 ℃保存。莫沙必利藥液制備：將莫沙必利粉碎，純凈水混合均勻，制備成1.65 mg/mL 的藥液，密封，4 ℃保存。

1.3 試劑 阿拉伯樹膠粉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；活性炭（粉）（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；自噬效應(yīng)蛋白（Beclin-1）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）蛋白抗體（Proteintech 公司）。

1.4 儀器 電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-7C）；智能熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（廣州光儀生物科技有限公司，型號(hào)：JY-MINI610）。

2 方法

2.1 造模與分組 將40 只SD 雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組、模型組、強(qiáng)蠕通便方組、莫沙必利組。除正常組外，其余各組均采用生大黃細(xì)粉懸濁液灌胃每日1 次，首日劑量為200 mg/（kg·d），后每日劑量按首日量遞增，半數(shù)大鼠稀便時(shí)維持此劑量灌胃，至80%大鼠無稀便。按此法循環(huán)3 次，待第3 次結(jié)束時(shí)，繼續(xù)灌胃1周。正常組同時(shí)灌服等量生理鹽水。

2.2 治療 造模成功后，強(qiáng)蠕通便方組給予26.25 g/（kg·d）的強(qiáng)蠕通便方藥液，莫沙必利組給予1.65 mg/（kg·d）的莫沙必利藥液，正常組與模型組分別給予相應(yīng)體積的生理鹽水，連續(xù)給藥28 d。

2.3 觀察大鼠一般狀態(tài) 觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括糞便性狀、活動(dòng)度、精神狀態(tài)和皮毛情況等。

2.4 糞便檢測(cè) 制備5%碳末懸濁液：稱取10 g 阿拉伯樹膠粉倒入裝有80 mL 蒸餾水的器皿中攪勻，煮沸至透明，加入5 g 活性炭粉，煮沸3次后，晾至室溫，定容至100 mL 即為5%碳末懸濁液，4℃保存。首粒黑便排出時(shí)間：所有大鼠于檢測(cè)前禁食不禁水12 h，經(jīng)口灌入5%碳末懸濁液2 mL，正常飲食飲水，灌胃結(jié)束開始計(jì)時(shí)，排出首粒黑便計(jì)時(shí)結(jié)束，該過程所需時(shí)間為大鼠排出首粒黑便的時(shí)間。

2.5 血清檢測(cè) 10%水合氯醛腹腔注射以麻醉大鼠，將腹主動(dòng)脈完全暴露，取血、離心，取上清液按照ELISA 相對(duì)應(yīng)試劑盒的說明書進(jìn)行操作，測(cè)得大鼠血清TNF-α、IL-6 的含量。

2.6 病理形態(tài)學(xué)檢測(cè) 結(jié)腸組織固定于4%的多聚甲醛，石蠟包埋，切片HE 染色，光鏡下觀察。

2.7 Western 印記檢測(cè) 稱取50 mg 凍存結(jié)腸組織，超生低溫粉碎研磨，加入RIPA 裂解，在冰上充分裂解30 min，4 ℃、15 000 r/min 低溫高速離心15 min，后提取其上清液，通過BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，高溫煮沸以使蛋白變性。采用SDS-PAGE 法凝膠電泳，轉(zhuǎn)蛋白至PVDF 膜，使用脫脂奶粉封閉，加入目的蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，TBST 清洗，ECL 化學(xué)發(fā)光顯影，拍照。ImagJ 軟件計(jì)算蛋白表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Graphpad Prism 構(gòu)建圖形，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。以單因素方差分析來比較多組間的差異。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)變化情況 造模期間，各組大鼠糞便先變稀，后轉(zhuǎn)為干硬，喜抱團(tuán)，毛發(fā)無光澤，肌肉松弛，甚至出現(xiàn)脫肛現(xiàn)象。強(qiáng)蠕通便方與莫沙必利治療后大鼠糞便由干硬變軟，不抱團(tuán)，毛發(fā)有光澤，肌肉松弛有度，脫肛現(xiàn)象消失。

3.2 各組大鼠首粒黑便排出時(shí)間 與正常組相比，模型組大鼠排出首粒黑便的時(shí)間明顯較長(zhǎng)（P＜0.01）。與模型組相比，強(qiáng)蠕通便方組大鼠排出首粒黑便的時(shí)間在第1 周較短；第2 周進(jìn)一步較短（P＜0.05）；第3 周、第4 周強(qiáng)蠕通便方組大鼠排出首粒黑便的時(shí)間均明顯較短（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠首粒黑便排出時(shí)間（，n =10） min

表1 各組大鼠首粒黑便排出時(shí)間（，n =10） min

注：與正常組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

3.3 各組大鼠血清炎癥因子含量 與正常組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，強(qiáng)蠕通便方組血清中TNF-α、IL-6 含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 各組大鼠血清炎癥因子含量

3.4 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化 正常組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞豐富、排列整齊，細(xì)胞間無水腫；模型組大鼠結(jié)腸黏膜層變薄，杯狀細(xì)胞斷裂、數(shù)量減少、排列不規(guī)整，細(xì)胞間水腫；強(qiáng)蠕通便方組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，杯狀細(xì)胞無斷裂、數(shù)量較豐富、排列較規(guī)整，細(xì)胞間無水腫。見圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE，×400）

3.5 各組大鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白含量 與正常組相比，模型組Beclin-1、LC3-II/LC3-I、P62 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，強(qiáng)蠕通便方組Beclin-1、LC3-II/LC3-I、P62 表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組大鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白含量

4 討論

本研究通過灌服生大黃粉懸濁液成功制備了STC大鼠模型。模型制備過程中大鼠先出現(xiàn)了腹瀉。蒽醌類衍生物作為大黃的有效成分能夠使平滑肌M 受體興奮而加速腸蠕動(dòng)，亦可抑制腸黏膜的鈉泵酶活性，通過阻礙Na+主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制水分吸收，以達(dá)致瀉作用。隨著灌胃時(shí)間延長(zhǎng)，大便由稀變干，排便時(shí)間延長(zhǎng)。長(zhǎng)期服用大黃可損傷腸神經(jīng)系統(tǒng)，降低結(jié)腸傳輸功能，而致便秘[7]。造模過程由于不斷泄瀉而耗傷陽氣和津液，但以耗傷陽氣為主。脾陽受傷，運(yùn)化失司，水液、水谷運(yùn)行障礙，濕阻氣滯，大便排泄不暢，而見大便粘滯不爽，次數(shù)減少，即形成便秘。臨床中發(fā)現(xiàn)許多便秘患者都可見大便粘滯不爽、排便次數(shù)減少，伴疲乏無力，畏寒肢冷，腹脹滿，舌淡、體胖大、有齒痕、苔白厚膩或滑，脈沉緩或沉濡等癥狀。其中，很大一部分是從服瀉藥開始逐漸形成便秘的，與此模型同理。張仲景亦在《金匱要略·腹?jié)M寒疝宿食脈證治》中提到陽虛便秘即“趺陽脈微弦，法當(dāng)腹?jié)M，不滿者必便難……此虛寒從下上，當(dāng)以溫藥服之”?；诖耍岢鲆鏆鉁乩镄袣饣瘽裢ū惴?，并據(jù)法擬強(qiáng)蠕通便方用以治療STC，臨證療效顯著。方中黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)四藥合用可益氣、補(bǔ)虛，具有增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)的作用[8]；方用干姜、附子共奏溫里之功，具有增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)、增強(qiáng)機(jī)體代謝的作用[9-10]；方配伍枳實(shí)、厚樸、白豆蔻以化濕行氣，具有增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)的作用[11-12]；肉蓯蓉、鎖陽可補(bǔ)腎陽、通便，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉、鎖陽可增加便秘小鼠小腸推進(jìn)度，增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)[13-14]；炙甘草調(diào)和諸藥。全方合用共奏益氣溫里行氣化濕通便之功，增強(qiáng)了胃腸蠕動(dòng)功能，從根本上治療STC。

有研究表明，便秘患者的血清炎癥因子有較為顯著的增加[15]。炎癥因子TNF-α、IL-6 的持續(xù)產(chǎn)生可導(dǎo)致結(jié)腸黏膜發(fā)生炎癥反應(yīng)而損傷腸黏膜屏障，降低腸道運(yùn)動(dòng)功能[16]。本次研究結(jié)果中STC 大鼠血清的TNF-α、IL-6 含量有明顯的升高。研究顯示黃芪主要活性成分黃芪甲苷具有抗炎作用[17]，厚樸的主要活性成分厚樸酚有明顯的抗炎活性[18]。翟勇聰發(fā)現(xiàn)附子-干姜藥對(duì)可降低炎癥因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)[19]。由此看出補(bǔ)氣、溫里、行氣化濕類中藥可起到抗炎作用。本方應(yīng)具有抗炎作用。研究結(jié)果顯示該方降低了STC大鼠血清中TNF-α、IL-6含量，莫沙必利則無顯著影響。故在抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，修復(fù)結(jié)腸損傷而改善腸道運(yùn)動(dòng)方面，強(qiáng)蠕通便方優(yōu)于莫沙必利。

杯狀細(xì)胞為結(jié)腸黏膜的黏液分泌細(xì)胞。研究顯示，便秘大鼠結(jié)腸黏膜杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，黏液分泌減少[20]。本研究HE 結(jié)果顯示STC 大鼠結(jié)腸黏膜層變薄，杯狀細(xì)胞斷裂、數(shù)量少，提示STC 大鼠結(jié)腸黏膜受損、粘液分泌受限。強(qiáng)蠕通便方能夠修復(fù)結(jié)腸黏膜損傷，作用效果優(yōu)于莫沙必利。

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種降解方式[21]。在基礎(chǔ)水平上，細(xì)胞自噬可以維持能量代謝和物質(zhì)再利用，故細(xì)胞自噬水平在一定程度上可反應(yīng)細(xì)胞代謝水平。近年來，有研究表明腸道黏膜屏障的損傷與結(jié)腸組織自噬水平降低有關(guān)[22]。自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-II/I、P62的表達(dá)量可反應(yīng)自噬水平[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，STC 大鼠結(jié)腸組織Beclin-1、LC3-II/I、P62 表達(dá)顯著降低，強(qiáng)蠕通便方可明顯增加Beclin-1、LC3-II/I、P62 表達(dá)，調(diào)節(jié)結(jié)腸組織細(xì)胞自噬，增強(qiáng)細(xì)胞代謝，改善便秘。莫沙必利可增加LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62 表達(dá)，但對(duì)Beclin-1 無顯著影響，故在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬方面，強(qiáng)蠕通便方優(yōu)于莫沙必利。

綜上，強(qiáng)蠕通便方通過降低血清炎性因子TNF-α、IL-6 含量，調(diào)節(jié)自噬和凋亡信號(hào)通路有效改善STC 模型大鼠排便功能。