循經(jīng)通絡(luò)推拿結(jié)合藥物對乳腺增生大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的影響

紀 寧，李 麗，阮 迪，李丹丹

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院推拿科，烏魯木齊 830099）

乳腺增生癥（mammary gland hyperplasia，MGH）是中青年女性最為常見的一種乳腺疾病，主要以乳房非炎性腫塊及周期性脹痛為臨床特征[1]，中醫(yī)有“乳癖”之稱。乳腺增生癥的發(fā)病機制目前已公認與內(nèi)分泌激素失調(diào)所致的雌激素分泌絕對升高，孕激素分泌絕對或相對不足相關(guān)，下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸是調(diào)控乳腺生理和病理變化的關(guān)鍵途徑，其功能的紊亂與乳腺增生癥發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。推拿治療具有無不良反應(yīng)、遠期療效好、患者易于接受的優(yōu)勢，在大量臨床研究中已驗證其作用于乳腺增生癥的有效性。本實驗采用孕雌激素聯(lián)合造模法復(fù)制乳腺增生癥大鼠模型，觀察循經(jīng)通絡(luò)推拿手法及抗雌激素藥物三苯氧胺單純或聯(lián)合應(yīng)用對乳腺增生癥大鼠的治療作用，并探討其通過調(diào)控下丘腦-垂體-卵巢軸治療乳腺增生癥的相關(guān)機制。

1 實驗材料

SD 雌性大鼠50 只，SPF 級，體質(zhì)量（180±220）g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，于溫度（23±3）℃、相對濕度 40%～70% 的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。苯甲酸雌二醇注射液、黃體酮注射液（北京索萊寶有限責任公司），三苯氧胺（上海華聯(lián)制藥有限公司），蘇木素染液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），伊紅染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），大鼠卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均（武漢華美生物工程有限公司），促性腺激素釋放激素（GnRH）、垂體促性腺激素釋放激素受體（GnRH-R）一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），Real-time PCR 試劑盒（TaKaRa 公司）。高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司），酶標儀、電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad 公司），電泳儀（北京六一生物技術(shù)有限公司），光學倒置顯微鏡（日本尼康），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司），RT-RCR 儀（美國 ABI 公司）。

2 實驗方法

2.1 造模方法 大鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組（對照組、模型組、手法組、藥物組、藥物加手法組），每組10只。除對照組外，其余各組均采用肌肉注射雌二醇和黃體酮法制備乳腺增生癥模型[3]：肌肉注射苯甲酸雌二醇注射液（0.5 mL/kg），每日1 次，持續(xù)25 d，繼而改用黃體酮注射液（5 mg/kg）肌肉注射，每日1 次，持續(xù)5 d。造模結(jié)束后，觀察各組大鼠乳頭外觀形態(tài)，測量乳頭直徑與高度，并取第2對乳房組織作標本切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色觀察病理形態(tài)改變。以大鼠乳頭紅腫豎起高于皮膚表面，乳頭直徑、高度增加，HE染色見乳腺小葉增多、導管及腺泡腔擴張等為造模成功。

2.2 治療方法 手法組于造模同時給予循經(jīng)通絡(luò)推拿手法：1）指腹直推大鼠前肢內(nèi)側(cè)至腋窩處（手三陰經(jīng)），并延乳房外圍向乳頭方向指揉乳絡(luò)；2）指腹直推大鼠后肢內(nèi)側(cè)根部至后掌足跖（足三陰經(jīng)）；3）指腹直推大鼠頸部至恥骨（任脈）、頸部至尾根部（督脈）；4）指揉大鼠乳房部；直推、按揉力度、速度適中、順逆經(jīng)交替，每次治療10 min，至局部皮膚發(fā)紅。藥物組給予三苯氧胺（0.5 mg/kg）灌胃，藥物加手法組同時給予三苯氧胺（0.5 mg/kg）及循經(jīng)通絡(luò)推拿手法治療，每日 1 次，連續(xù)30 d。對照組與模型組不予干預(yù)。

3 檢測指標

3.1 大鼠乳頭直徑與高度測量 治療結(jié)束后，各組大鼠第2 對左右乳頭用精密游標卡尺測量直徑與高度，比較模型組與對照組，治療組與模型組以及各治療組之間的差異。

3.2 HE 染色觀察乳腺組織病理形態(tài)變化 大鼠腹主動脈取血后處死，解剖后取第2 對右側(cè)乳房，取部分乳腺組織于4 %多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片機作 5 μm 切片后行蘇木素-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡于不同倍數(shù)下觀察乳腺組織形態(tài)學改變并拍照。

3.3 ELISA 實驗檢測血清FSH、LH 含量變化 大鼠麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min 離心10 min 取血清，按ELISA 試劑盒說明書要求操作：樣品孔加入樣品稀釋劑40 μL、檢測抗體100 μL 及血清樣品10 μL，置于37 ℃恒溫箱重孵育1 h，洗滌劑洗板5 次，加入顯色液A、B 各50 μL，于37 ℃恒溫箱中避光孵育15 min，隨后加入終止液50 μL，于酶標儀450 nm 下檢測各反應(yīng)孔OD 值，建立標準曲線，代入各樣本OD 值計算FSH、LH 的含量。

3.4 Western-blot 檢測下丘腦GnRH 與垂體GnRH-R 蛋白表達 取各組大鼠下丘腦和垂體組織，剪碎后置于裂解液中，勻漿器于冰上勻漿，12 000 r/min 離心 20 min提取總蛋白，BCA 法檢測組織蛋白濃度。經(jīng)制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃下孵育2 h，ECL 發(fā)光液孵育，凝膠成像系統(tǒng)曝光，以β-actin 為內(nèi)參測定各組灰度值，分析相對蛋白含量。

3.5 RT-PCR 檢測下丘腦GnRH與垂體GnRH-R mRNA 表達 取大鼠部分下丘腦及腦垂體組織，Trizol法提取組織總RNA，測定總RNA 濃度，分別進行逆轉(zhuǎn)錄、cDNA 擴增，引物序列為：GnRH 上游引物5’-CCGCTGTTGTTCTGTTGACT-3’，下游引物5’-GCAGATCCCT AAGAGGTGAA-3’；GnRH-R上游引物 5’-TCACTCAGCCCTTAGCTGTCC-3’，下游引物 5’-GAAGGCTTCATGCCACCATTG-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行 40個循環(huán)。以2-△△Ct法分析mRNA相對表達量。

3.6 統(tǒng)計學處理 采用 SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均以均值±標準差（）表示，兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較。

4 結(jié)果

4.1 大鼠乳頭直徑與高度比較 與對照組比較，模型組兩側(cè)乳頭高度、直徑增大明顯（P＜0.05）；各治療組乳頭高度和直徑較模型組顯著減?。≒＜0.05）；其中藥物組乳頭直徑、藥物加手法組乳頭高度和直徑較手法組減小更為明顯（P＜0.05）；藥物加手法組大鼠左側(cè)乳頭直徑較藥物組減小更為明顯（P＜0.05），見表 1。

表1 各組大鼠乳頭直徑及高度比較（，n =10） mm

表1 各組大鼠乳頭直徑及高度比較（，n =10） mm

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05；與藥物組比較，□P ＜0.05

4.2 大鼠乳腺組織病理形態(tài)學觀察 對照組乳腺小葉形態(tài)規(guī)則，未見明顯增生，腺泡較少，腺泡腔及導管管腔未見擴張，個別導管內(nèi)可見少量分泌物；模型組可見乳腺小葉增生，腺泡增大，導管管腔擴張，導管上皮細胞增生，導管內(nèi)含較多分泌物；與模型組相比，手法組和藥物組大鼠乳腺組織病變改善不明顯，藥物加手法組乳腺小葉增生減少，乳腺導管擴張減輕，導管內(nèi)分泌物減少，見圖 1。

圖1 各組大鼠乳腺組織病理學變化（HE 染色）

4.3 大鼠血清FSH、LH 水平比較 藥物組和藥物加手法組FSH 水平較模型組明顯降低，LH 水平明顯升高（P＜0.05），其中藥物加手法組與手法組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 各組大鼠血清FSH、LH 水平（，n =10）

表2 各組大鼠血清FSH、LH 水平（，n =10）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

4.4 大鼠下丘腦GnRH 與垂體GnRH-R 的蛋白表達 藥物加手法組GnRH、GnRH-R 的表達較模型組均明顯減少（P＜0.05），其中藥物加手法組與手法組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的蛋白表達（，n =6）

表3 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的蛋白表達（，n =6）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

4.5 大鼠下丘腦GnRH 與垂體GnRH-R 的mRNA表達 藥物組、藥物加手法組較模型組明顯減少了GnRH、GnRH-R 的mRNA 表 達（P＜0.05），其 中藥物加手法組與手法組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 4。

表4 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的mRNA 表達（，n =6）

表4 各組大鼠下丘腦GnRH 與垂體組織GnRH-R 的mRNA 表達（，n =6）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與手法組比較，▲P ＜0.05

5 討論

近年來，乳腺增生癥發(fā)病率逐年上升，發(fā)病趨勢呈現(xiàn)低齡化，且伴有一定的癌變風險，受到中青年女性的極大關(guān)注[4]。西醫(yī)針對此病常采用抗雌激素類藥物治療，但存在副作用多、不適合長期應(yīng)用、停藥后易復(fù)發(fā)等缺點[5]。推拿作為中醫(yī)特色療法，通過推揉按摩經(jīng)穴而激發(fā)經(jīng)絡(luò)氣機，達到疏通經(jīng)絡(luò)，行氣運血的作用，以其遠期療效好、無不良反應(yīng)等優(yōu)勢得到了患者的廣泛認可[6]。

乳腺增生癥屬于中醫(yī)學“乳癖”范疇，病屬本虛標實，以腎氣不足，沖任失調(diào)為本，肝脾郁結(jié)，氣滯、痰凝、血瘀凝滯為標，故治療當以調(diào)節(jié)沖任，疏肝健脾為主，配以化痰散結(jié)，暢通經(jīng)絡(luò)之法[7-9]。乳房為“宗經(jīng)之所”，多條經(jīng)脈在此匯聚[10]，足厥陰肝經(jīng)布于兩脅，環(huán)繞乳頭而行；足太陰脾經(jīng)絡(luò)胃，上膈，散布胸脅，行至乳頭之外；足少陰腎經(jīng)貫肝膈，其支脈入胸中，故循經(jīng)推拿以足三陰經(jīng)為主。沖任二脈同起于胞中，沖脈與足少陰經(jīng)并行向上而布于胸中，任脈行于兩乳之間，乳房的生理病理狀態(tài)直接受此二脈經(jīng)氣盈虧的調(diào)節(jié)[11]；督脈行于背脊正中，為“陽脈之?！?，任脈為“陰脈之海”，二脈通調(diào)則百脈皆通[12]。此外，手三陰經(jīng)分布于上肢及腋窩，過胸部乳頭外側(cè)，肝有邪常客于兩腋，手法作用于此三脈亦可達到疏肝散結(jié)之效。

本研究采用循經(jīng)通絡(luò)推拿手法作用于大鼠足三陰、手三陰經(jīng)、任脈、督脈和乳房部，在此基礎(chǔ)上結(jié)合西藥三苯氧胺，觀察西藥和手法單獨或聯(lián)合應(yīng)用對乳腺增生大鼠的治療效果。

結(jié)果顯示，與模型組比較，各治療組大鼠第2 對乳頭直徑與高度均顯著減小，其中手法加藥物組效果最明顯。HE 染色可見，模型組乳腺組織增生病變明顯，提示造模成功，藥物加手法組明顯減輕了乳腺組織的病變程度，而藥物組和手法組對病變改善均不明顯，提示推拿聯(lián)合藥物的治療效果優(yōu)于單純應(yīng)用手法和藥物。

乳腺增生癥的發(fā)生與下丘腦-垂體-卵巢軸的功能紊亂密切相關(guān)[13]。下丘腦所分泌的 GnRH 是下丘腦-垂體-卵巢軸中最為關(guān)鍵的神經(jīng)介質(zhì)，其與垂體促性腺細胞上具有高親和力的受體GnRH-R 結(jié)合后，能夠刺激垂體合成和釋放FSH 和LH，二者的分泌進一步作用于卵巢，刺激卵巢分泌雌激素與孕激素，從而調(diào)節(jié)乳腺組織的生理和病理改變[14]。過量分泌的FSH 可激活卵巢顆粒細胞合成和釋放雌二醇（E2），導致乳腺增生癥[15]。而LH 含量的降低可造成 P 的生成不足，E2和P 之間平衡被打破，使E2生成過多，使乳腺增生癥間接加重[16]。本實驗結(jié)果提示推拿手法聯(lián)合藥物可能通過干預(yù)下丘腦-垂體-卵巢軸的內(nèi)分泌功能，使GnRH 及其受體的生成減少，從而調(diào)節(jié)FSH 和LH 的分泌水平，拮抗激素紊亂引起的乳腺增生癥。

前期研究發(fā)現(xiàn)，循經(jīng)通絡(luò)推拿療法用于乳腺增生癥患者臨床總有效率可達100%[17]。本實驗中單純應(yīng)用推拿手法顯著減輕了乳腺增生癥大鼠乳頭高度和直徑的增大，提示其對外源性雌激素所致乳腺增生癥具有明顯療效。病理學和分子檢測中雖未見明顯改善，但聯(lián)合藥物治療時卻發(fā)揮了協(xié)同作用。推拿等保守療法療程長，對癥狀的改善見效較慢；三苯氧胺等抗雌激素藥物療效明顯，但停藥后易復(fù)發(fā)。本實驗顯示循經(jīng)推拿手法聯(lián)合三苯氧胺具有一定的協(xié)同增效作用，提示內(nèi)服與外治并重對下丘腦-垂體-卵巢軸功能和激素水平能夠起到更好的調(diào)節(jié)作用。