偽狂犬病病毒感染小鼠的背根神經(jīng)節(jié)后天然免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序及分析

王 冰，吳紅霞，李 淼，高 瑩，袁夢淇，仇華吉，孫 元

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由PR 病毒（PRV）引起[1]。PRV 是皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科的成員，病毒粒子直徑為150 nm～180 nm，由內(nèi)至外分別為病毒基因組（Genome）、衣殼（Capsid）、基質(zhì)（Tegu-ment）和囊膜（Envelope）[2]。PRV 的天然宿主是豬，但是也能夠感染其他哺乳動物[3]，包括感染人[4]。PRV感染動物后能夠在外周神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nervous system，PNS）神經(jīng)元的軸突末梢進(jìn)行吸附、內(nèi)化，并沿軸突逆向傳導(dǎo)至神經(jīng)胞體，從而完成病毒復(fù)制或潛伏感染[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PRV 感染小鼠后會激活其機(jī)體的天然免疫反應(yīng)，同時誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀和神經(jīng)炎癥，但是其具體機(jī)制仍未知[6]。小鼠的背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglia，DRG）位于脊柱內(nèi)脊髓兩側(cè)，是初級傳入神經(jīng)元胞體所在的位置，屬于外周神經(jīng)元[7]，并且PRV 能夠在小鼠DRG 內(nèi)復(fù)制并建立潛伏感染[5]。因此，研究感染PRV 后小鼠外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，尤其DRG 內(nèi)基因表達(dá)水平變化，有助于深入研究PRV 的致病機(jī)制。

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種皰疹病毒與宿主的相互作用研究，如研究人員通過對山羊皰疹病毒1 型（Caprine herpesvirus 1，CpHV-1）感染的MDBK 細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多種與天然免疫反應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化，如IFIT1、IFIT2和IFIT5[8]；通過對愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染后不同時間的原代B 淋巴細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq，同樣發(fā)現(xiàn)了大量轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因，這為深入研究EBV的致瘤機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[9]。為了探究PRV 感染小鼠的外周神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，本研究將PRV 接種小鼠后，在其瀕死期分離DRG，進(jìn)行RNAseq，并對差異轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行分析，為深入研究PRV的致病機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料PRV TJ 株由本實驗室分離、鑒定和保存；6 周齡的BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基購自Sigma 公司；TRIzol 試 劑 購 自Invitrogen 公 司；HiScript II Q RT Su-perMix for qPCR（+gDNA wiper）、2×ChamQ SYBR qP-CR Master Mix 均 購 自Vazyme 公 司。

1.2 小鼠感染實驗將6 只6 周齡健康BALB/c 小鼠隨機(jī)分為2 組（n=3），其中實驗組接種100 μL 107pfu/mL PRV，對照組接種100 μL DMEM，接種途徑均為左腿肌肉注射，每組各作3 個重復(fù)（TJ-1～TJ-3、Mock-1～Mock-3）。本實驗室前期研究結(jié)果顯示，小鼠在接種PRV TJ 株后56 h 進(jìn)入瀕死期，臨床癥狀也最嚴(yán)重，因此本研究選擇接種病毒56 h 后迫殺小鼠，參照文獻(xiàn)[10]方法分離DRG，-80 ℃保存于200 μL TRIzol 試劑中待用。

1.3 RNA-seq 及差異轉(zhuǎn)錄基因的功能分析各組小鼠DRG 樣品由華大基因公司使用BGISEQ 平臺進(jìn)行RNA-seq，獲得測序原始數(shù)據(jù)，去除其中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基含量過高的reads，獲得clean reads，利用HISAT 軟件將過濾后的基因序列與小鼠參考序列比對。采用華大基因多組學(xué)系統(tǒng)（https://biosys.bgi.com/#/report/project/projectList）進(jìn)行生物信息學(xué)和差異轉(zhuǎn)錄基因的功能分析。本研究利用DESeq2軟件比較對照組與感染組小鼠DRG 內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并利用clusterProfiler R 軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄差異基因的基因本體論數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 差異轉(zhuǎn)錄基因的熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證根據(jù)測序結(jié)果隨機(jī)選擇10 條轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或下調(diào)的基因，利用TRIzol 試劑提取各組DRG 樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后為模板，采用Premier 6.0 設(shè)計引物（表1），進(jìn)行qPCR 檢測，驗證各基因的轉(zhuǎn)錄情況。PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃5 min；95 ℃10 s、60 ℃30 s、72 ℃1 min，共40 個循環(huán)；95 ℃1 min，55 ℃30 s，95 ℃30 s，共1 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

表1 RT-qPCR所用的引物Table 1 Primers for RT-qPCR

2 結(jié) 果

2.1 PRV 感染小鼠后DRG 的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析根據(jù)小鼠DRG 的RNA-seq 結(jié)果，對PRV 感染組小鼠和對照組小鼠DRG 內(nèi)mRNA 水平進(jìn)行聚類分析（圖1），計算PRV 感染組與對照組小鼠基因思轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C），并繪制火山圖（圖2）。結(jié)果顯示，對照組（Mock-1、2、3）和感染組（TJ-1、2、3）被聚為兩大類（圖1），符合感染組和非感染組的差異轉(zhuǎn)錄基因水平預(yù)期，表明PRV-TJ 感染后可引起小鼠DRG 內(nèi)大量基因的差異轉(zhuǎn)錄。FC>2 且P≤0.05的差異轉(zhuǎn)錄基因共有6 502 條。其中，相對于對照組，PRV 感染組小鼠DRG 內(nèi)有3 703 條基因轉(zhuǎn)錄水平升高，2 799 條基因轉(zhuǎn)錄水平降低（圖2）。表明PRV 感染可導(dǎo)致小鼠DRG 的大量基因轉(zhuǎn)錄水平異常。

圖2 PRV感染小鼠DRG內(nèi)差異轉(zhuǎn)錄基因的火山圖分析Fig.2 Volcano plot of differentially transcribed genes in DRG from the PRV-infected mice

2.2 差異轉(zhuǎn)錄基因的功能分析為了探究PRV 感染小鼠后可能造成的影響，本研究將差異轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行了GO 注釋。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變的基因廣泛存在于細(xì)胞各組分中，如細(xì)胞質(zhì)、胞外基質(zhì)和軸突等（圖3）。其中，細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中差異轉(zhuǎn)錄的基因數(shù)量最多。進(jìn)一步對差異轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果顯示，差異轉(zhuǎn)錄的基因被富集到20 種KEGG 信號通路中（圖4），表明PRV 感染小鼠會對其DRG 內(nèi)多種生理過程產(chǎn)生影響。對上述結(jié)果匯總發(fā)現(xiàn)差異轉(zhuǎn)錄基因存在數(shù)量最多的5 條抗病毒信號通路分別為絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（Nucleotide-binding oligomer-zation domain-like receptor，NLR）信號通路、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路、細(xì)胞凋亡（Apoptosis）信號通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（Signal transducers and activators of transcription，JAK -STAT）信號通路。

圖3 GO分析PRV感染小鼠DRG內(nèi)差異轉(zhuǎn)錄基因的定位Fig.3 GO analysis for the location of differentially transcribed genes in DRGs from the PRV-infected mice

圖4 PRV感染小鼠DRG內(nèi)差異轉(zhuǎn)錄基因參與的信號通路的KEGG分析Fig.4 KEGG analysis for signaling pathways participated by differentially transcribed genes in DRG from the PRV-infected mice

2.2.1 MAPK 信號通路 MAPK 信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳遞通路[11]。本研究對兩組小鼠DRG 參與MAPK 信號通路的分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，實驗組小鼠DRG 內(nèi)在MAPK 信號通路中有124 個基因發(fā)生了差異轉(zhuǎn)錄，其中有53 個基因與天然免疫反應(yīng)有關(guān)，其中轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的各5個基因，見表2。該結(jié)果表明，PRV 感染小鼠后可能通過調(diào)控MAPK 信號通路而影響機(jī)體炎癥反應(yīng)，且TNF、NTF5等基因的表達(dá)產(chǎn)物可能是影響該信號通路的關(guān)鍵接頭分子。

表2 PRV感染小鼠的MAPK信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的各5條基因Table 2 Five relatively highly and lowly-transcribed genes in the MAPK signaling pathway in the PRV-infected mice

2.2.2 NOD 樣受體信號通路 NOD 樣受體信號通路在機(jī)體內(nèi)受到廣泛調(diào)控[12]。本研究對兩組小鼠DRG內(nèi)涉及NOD 信號通路分子的編碼基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共有99 個基因差異轉(zhuǎn)錄，數(shù)量略低于MAPK 信號通路中差異轉(zhuǎn)錄的基因，其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)及下調(diào)倍數(shù)最大的各5 個基因，見表3。該結(jié)果表明，PRV 感染小鼠后，可能通過NOD 樣受體信號通路影響其體內(nèi)各種信號調(diào)節(jié)因子的分泌，其中CXCL2、CCL5等可能是PRV 影響該信號通路的關(guān)鍵基因。

表3 PRV感染小鼠的NOD樣受體信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 3 Five relatively highly and lowly transcribed genes in the NLR signaling pathway in the PRV-infected mice

2.2.3 腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）信號通路 TNF 在炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡方面具有重要作用[13]。本研究對兩組小鼠DRG 內(nèi)TNF受體通路中的差異轉(zhuǎn)錄基因分析，結(jié)果列舉了轉(zhuǎn)錄上調(diào)及下調(diào)最顯著的各5 個基因，見表4。表明PRV可能通過上述基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物調(diào)控TNF 信號通路影響機(jī)體的炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡過程。

表4 PRV感染小鼠的TNF信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 4 Five relatively highly and lowly transcribed genes in TNF signaling pathway in the PRV-infected mice

2.2.4 細(xì)胞凋亡信號通路 凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡，分為內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示，PRV 感染小鼠DRG 內(nèi)該通路轉(zhuǎn)錄水平變化的基因共有73 個，其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)最顯著的各5 個基因，見表5。該結(jié)果表明，PRV 感染小鼠后可能通過影響上述基因的轉(zhuǎn)錄而影響其細(xì)胞凋亡信號通路的應(yīng)答。

表5 PRV感染小鼠的細(xì)胞凋亡信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 5 Five relatively highly and lowly transcribed genes in the apoptosis signaling pathway in the PRV-infected mice

2.2.5 JAK-STAT 信號通路 JAK-STAT 信號通路與炎癥和自身免疫性疾病的產(chǎn)生有關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，PRV 感染小鼠后，其DRG 內(nèi)JAK-STAT 通路內(nèi)存在66 個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)或者下調(diào)，上調(diào)或下調(diào)轉(zhuǎn)錄水平最顯著的各5 個基因，見表6。該結(jié)果表明，PRV 感染小鼠后，可能通過上述基因作為靶標(biāo)而影響JAK-STAT 信號通路，進(jìn)而影響其炎癥反應(yīng)。

表6 PRV感染小鼠的JAK-STAT信號通路中轉(zhuǎn)錄水平升高及降低的5條基因Table 6 Five relatively highly and lowly-transcribed genes in JAK-STAT signaling pathway in the PRV-infected mice

2.3 差異轉(zhuǎn)錄基因驗證根據(jù)RNA-seq 的結(jié)果，隨機(jī)選取10 條差異轉(zhuǎn)錄的基因進(jìn)行RT-qPCR 驗證分析。結(jié)果顯示，與對照組比較，在PRV 感染后的DRG 內(nèi)CXCL1、CXCL2、CXCL9、LY6A、IFIT1、IFI44、OAS1A、MS4A6D的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，CRABP1、GKN3的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致（圖5）。表明本研究RNA-seq 測序數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。

圖5 差異轉(zhuǎn)錄基因的RT-qPCR驗證Fig.5 Verification of differentially transcribed genes by RT-qPCR

3 討 論

PRV 是一種特殊的嗜神經(jīng)性病毒[16-17]，感染機(jī)體后能夠進(jìn)入外周神經(jīng)系統(tǒng)并建立潛伏感染[17-19]。但是機(jī)體感染PRV 后PNS 神經(jīng)元中基因的表達(dá)變化目前尚未可知。因此，本研究對感染PRV 小鼠的DRG進(jìn)行了RNA-seq，并對基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，DRG 中發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)的基因共有6 502 條，其中轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因有3 703 條，轉(zhuǎn)錄下調(diào)的基因有2 799 條。這些差異轉(zhuǎn)錄基因廣泛存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及其他細(xì)胞組分中，并參與細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)過程。這說明PRV 感染宿主后，會對DRG 內(nèi)的各種生理過程產(chǎn)生廣泛影響。另外，差異轉(zhuǎn)錄的基因分布在20 種信號通路中，其中有12 條通路與天然免疫反應(yīng)有關(guān)，這說明雖然PRV 的感染會對神經(jīng)系統(tǒng)造成廣泛的影響，但是主要引起天然免疫相關(guān)信號分子的變化。

天然免疫是機(jī)體抵抗外來病原侵入的第一道防線[20]。在病毒感染宿主后，機(jī)體內(nèi)的天然免疫相關(guān)通路會被激活，從而發(fā)揮抗病毒作用，以清除病原并減輕自身損傷[21]。小鼠感染PRV 后，其DRG 內(nèi)發(fā)生差異轉(zhuǎn)錄基因數(shù)量最多的前5 條天然免疫信號通路分別為MAPK 信號通路、NOD 樣受體信號通路、TNF 信號通路、細(xì)胞凋亡信號通路和JAK-STAT 信號通路。MAPK 信號通路廣泛參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，包括細(xì)胞發(fā)育、炎癥發(fā)生等；NOD 樣受體廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中，其在識別相應(yīng)配體后能夠激活NF-κB 信號通路并激活促炎性因子從而導(dǎo)致炎癥發(fā)生；TNF 信號通路能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡；JAK-STAT 信號通路能夠參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。目前，已有較多關(guān)于PRV 與宿主天然免疫信號通路相互作用的研究，如PRV 感染細(xì)胞后，TNF-α 能夠通過活化p38 MAPK 和JNK/SAPK 信號通路而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬[22]；另外，PRV還能通過蛋白酶體途徑降解JAK 從而抑制干擾素刺激基因的表達(dá)等[23]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，并且還發(fā)現(xiàn)仍有其他天然免疫通路中的基因發(fā)生差異轉(zhuǎn)錄，如NOD 樣受體信號通路?？紤]到NOD樣受體在天然免疫過程中發(fā)揮的作用，該通路中的CXCL2、CCL5 和CXCL3 可能與PRV 引起的神經(jīng)炎癥有關(guān)。除此之外，本研究還新發(fā)現(xiàn)了某些轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生差異的基因，如參與細(xì)胞凋亡信號通路的GZMB基因和參與MAPK 信號通路的NTF5基因，前者能夠調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和修復(fù)細(xì)胞損傷[24]，而后者是一種神經(jīng)保護(hù)分子[25]；上述基因在PRV 感染過程中的作用還尚見報道。

在PRV 感染過程中，宿主先天性免疫應(yīng)答對于限制病毒復(fù)制和清除宿主體內(nèi)病毒十分重要。本研究采用RNA-Seq 得到PRV 感染小鼠后DRG 內(nèi)的詳細(xì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)分析了PRV 感染機(jī)體后免疫相關(guān)基因參與的代謝途徑與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為下一步研究機(jī)體抗PRV 反應(yīng)及機(jī)體神經(jīng)炎癥產(chǎn)生的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。