野鳥(niǎo)源H8N2亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性分析

田井滿(mǎn)，李明慧，白曉利，李玉磊，劉麗娜，李雁冰，陳化蘭

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒屬，病毒粒子表面表達(dá)的兩種糖蛋白分別為血凝素（Hemagglutinin，HA）和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）。在世界各地的野鳥(niǎo)中均可分離到AIVs，根據(jù)HA 可將其劃分為16 種亞型（H1～H16）； 根 據(jù)NA 可 將 其 劃 分 為9 種 亞 型（N1～N9），目前已經(jīng)檢測(cè)到140 多種HA-NA 亞型組合[1-2]。H8 亞型AIV 于1967 年首次在北美的火雞中分離到，隨后在全球均檢測(cè)到了該亞型病毒[3-5]。目前在AIV 數(shù)據(jù)（https://www.gisaid.org/）中H8 亞型AIV 共有271 株，其中最常見(jiàn)的亞型組合是H8N4，但H8 亞型也與N2、N3、N5 和N7 等NA 亞型組合。H8 亞型AIV 為低致病性禽流感病毒（LPAIV），按照其進(jìn)化關(guān)系可劃分為歐亞分支和北美分支。

為了解本團(tuán)隊(duì)2019 年于山東省榮成市分離到的一株H8N2 亞型AIV 的生物學(xué)特性，本研究對(duì)該H8N2 亞型AIV 進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并對(duì)其特殊氨基酸位點(diǎn)和遺傳演化作了分析，評(píng)估了其對(duì)SPF 雞和BALB/c 小鼠的致病性，為H8N2 亞型AI 的綜合防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料600 份新鮮天鵝糞便樣品為2019 年1 月采集自山東省榮成市。9 日齡～11 日齡的普通雞胚、10 日齡的SPF 雞胚及SPF 雞紅細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。RNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自日本TOYOBO 公司；rTaqDNA 聚合酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR 產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒美國(guó)OMEGA 公司；測(cè)序反應(yīng)試劑盒BigDye Terninator 3.1 購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成采用MEGA7 軟件對(duì)AIV數(shù)據(jù)庫(kù)中H8 亞型AIV 序列分析比對(duì)后，采用Primer Premier 5.0 軟件根據(jù)比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增H8 亞型AIV8個(gè)內(nèi)部基因節(jié)段的引物（表1），引物均由吉林庫(kù)美生物有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 病毒分離及其亞型鑒定將600 份糞便樣品經(jīng)旋渦震蕩、離心后取上清液，以0.3 mL/枚接種9 日齡～11 日齡的普通雞胚， 37 ℃孵化72 h 后收獲雞胚尿囊液，按常規(guī)方法測(cè)定其血凝（HA）活性，HA陽(yáng)性（HA≥21）的樣品再通過(guò)對(duì)H1～H16 單因子血清及新城疫（ND）標(biāo)準(zhǔn)血清的血凝抑制（HI）試驗(yàn)確定其HA 亞型。提取確定HA 亞型的AIV 樣品RNA，采用AIV 12 bp 通用引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照文獻(xiàn)[6]，利用RT-PCR 進(jìn)一步鑒定其N(xiāo)A 亞型。

1.4 病毒的純化及半數(shù)感染量（EID50）的測(cè)定將收獲的第1 代雞胚尿囊液用PBS 10 倍倍比稀釋后，每稀釋度接種3 枚9 日齡～11 日齡SPF 雞胚，置于37 ℃孵化器中培養(yǎng)48 h 后收集最高稀釋度最高血凝價(jià)的尿囊液，連續(xù)傳代純化3 代后的尿囊液以106倍稀釋后接種5 枚SPF 雞胚，收集全部尿囊液，無(wú)菌檢驗(yàn)后即為純化病毒。參考文獻(xiàn)[7]測(cè)定純化病毒的EID50。

1.5 病毒全基因組測(cè)序及進(jìn)化分析以1.3 中分離株病毒為模板，采用AIV 8 個(gè)內(nèi)部基因節(jié)段特異性引物分別擴(kuò)增各基因，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物后測(cè)序，利用Se-qMan 軟件根據(jù)測(cè)序結(jié)果拼接全基因組，參照GISAID數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)序列，經(jīng)MAFFT 多重序列比對(duì)軟件比對(duì)后，利用RAxMLv8.2.10 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.6 病毒對(duì)SPF 雞的致病性試驗(yàn)將8 只4 周齡SPF雞經(jīng)翅靜脈接種100 μL（106EID50）的該分離病毒液，24 h 后放入3 只未感染的SPF 雞，以檢測(cè)病毒的水平傳播能力；感染后第3 d 隨機(jī)迫殺3 只感染雞，無(wú)菌采集雞的大腦、脾臟、胰腺、盲腸扁桃體、腎臟、法氏囊、胸腺、氣管和肺臟，剩余的雞分別在感染后第3 d、5 d、7 d、9 d 采集喉拭子和泄殖腔拭子。將采集的樣品常規(guī)處理后（臟器樣品加入鋼珠后研磨處理；咽拭子及泄殖腔拭子經(jīng)旋渦震蕩處理），離心取上清液，通過(guò)病毒滴定試驗(yàn)檢測(cè)病毒在雞各臟器中的復(fù)制及排毒狀況，利用Reed-Muench 法計(jì)算病毒滴度。另外在感染后14 d 對(duì)存活雞經(jīng)翅靜脈采血分離血清，通過(guò)HI 試驗(yàn)來(lái)測(cè)定血清HI 抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)情況。

1.7 病毒對(duì)BALB/c 小鼠的致病性試驗(yàn)每組8 只6周齡的雌性BALB/c 小鼠，干冰麻醉后，感染組鼻腔接種50 μL（106EID50）病毒液，對(duì)照組鼻腔接種50 μL PBS。感染后第3 d 每組隨機(jī)剖殺3 只小鼠，無(wú)菌采集小鼠的大腦、脾臟、腎臟、肺臟、鼻甲，按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)研磨、離心后通過(guò)病毒滴定試驗(yàn)檢測(cè)小鼠各個(gè)臟器中的病毒復(fù)制情況，按Reed-Muench 法計(jì)算病毒在小鼠臟器內(nèi)的滴度。其余5 只小鼠連續(xù)稱(chēng)重14 d，記錄其體質(zhì)量變化及死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 病毒的分離與鑒定將采集的野鳥(niǎo)糞便樣品接種雞胚后收獲雞胚尿囊液，進(jìn)行HA 試驗(yàn)。結(jié)果顯示有3 份樣品呈現(xiàn)HA 陽(yáng)性，樣品編號(hào)分別為SD-134、SD-341、SD-442。對(duì)HA 陽(yáng)性的樣品進(jìn)行HI 試驗(yàn)，結(jié)果顯示SD-341 和SD-442 為新城疫病毒；SD-134可被AIV H8 亞型單因子血清所抑制，HI 效價(jià)可達(dá)到1：64，而不能被陰性血清及AIV 其他亞型單因子血清所抑制，表明該樣品含有H8 亞型AIV。經(jīng)RTPCR 鑒定SD-134 的NA 亞型，結(jié)果顯示其為N2 亞型，表明該樣品為H8N2 亞型AIV，命名為A/whoop-er swan/Shandong/S1-134/2019（H8N2），簡(jiǎn)稱(chēng)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）。經(jīng)純化后檢測(cè)該病毒的EID50為107.83EID50/100 μL。

2.2 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株全基因組的PCR 擴(kuò)增及序列分析對(duì)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）采用特異性引物進(jìn)行內(nèi)部基因組的RT-PCR 擴(kuò)增，并測(cè)序后序列分析。結(jié)果顯示，其HA 基因的ORF 為1 701 bp，編碼566 個(gè)氨基酸，與孟加拉國(guó)的一株鴨源H8N4（A/duck/Bangladesh/37509/2019）同源性最高，為98.04%；其N(xiāo)A 基因的ORF 為1 401 bp，編碼467 個(gè)氨基酸，與鴨源H9N2（A/Duck/China/E1158/2014（H9N2））同源性最高，為98.92%；其內(nèi)部基因分別與H4N6、H6N2、H10N7、H11N2、H12N5 等亞型AIV 的部分基因具有最高核苷酸序列同源性。此外，分離株除PB2 和PA 基因與野鳥(niǎo)源的LPAIV 具有最高同源性外，其余基因均與鴨源的LPAIV 具有最高同源性（表2）。綜上表明，WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株具有多亞型AIV 重組的特點(diǎn)。

2.3 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株氨基酸位點(diǎn)分析 對(duì)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）進(jìn)行特殊氨基酸位點(diǎn)分析，結(jié)果顯示，HA 蛋白氨基酸的裂解位點(diǎn)為SIEPK/GLF，僅有一個(gè)堿性氨基酸，符合LPAIV 的分子特征；在受體結(jié)合位點(diǎn)aa222 與aa224 均未發(fā)生突變，均為典型的禽型受體結(jié)合位點(diǎn)。其N(xiāo)2 蛋白在aa62～aa69 位發(fā)生缺失，而PB2 蛋白的aa627 與aa701均未發(fā)生突變，但PB1 蛋白發(fā)生了D622G 的突變。另外該H8N2 亞型AIV NS1 蛋白在aa80～aa84 未發(fā)生缺失，但在aa42、aa101、aa138 均發(fā)生了突變，這可能會(huì)增加其對(duì)小鼠的致病性（表3）。上述結(jié)果表明，WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株具有潛在增強(qiáng)小鼠致病性的能力。

表3 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析Table 3 Key residues of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)genome

2.4 WS/SD/S1-134/2019(H8N2）分離株基因遺傳進(jìn)化分析 對(duì)WS/SD/S1-134/2019（H8N2）全基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示其HA 基因與H8N2、H8N4、H8N5 亞型AIV 的HA 基因同屬于一個(gè)分支，均可劃分為歐亞分支（圖1）。WS/SD/S1-134/2019（H8N2）的NA基因與我國(guó)家禽中廣泛流行的H9N2 亞型AIV 的NA 基因聚為一支，屬于歐亞分支（圖2）。對(duì)其內(nèi)部基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，除了WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株的PB2 基因可以劃分為北美分支外，其余5 個(gè)內(nèi)部基因（PB1、PA、NP、M 以及NS 基因）均屬于歐亞分支（圖3）。上述結(jié)果表明WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株的各個(gè)基因進(jìn)化具有跨大陸、跨物種及多亞型重組的特點(diǎn)。

圖1 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株HA基因進(jìn)化樹(shù)Fig.1 The HA gene phylogenetic tree of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)

圖2 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株NA基因進(jìn)化樹(shù)Fig.2 The NA gene phylogenetic tree of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)

圖3 WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株內(nèi)部基因的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The internal genes phylogenetic trees of WS/SD/S1-134/2019(H8N2)

2.5 分離株對(duì)SPF 雞致病性試驗(yàn)結(jié)果WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株感染SPF 雞后感染組和同居組均未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，各臟器中也均未檢測(cè)到該病毒，表明該病毒株不能在SPF 雞中有效的復(fù)制和水平傳播。在感染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集的喉拭子和泄殖腔拭子也均未檢測(cè)到病毒，表明感染組和同居組SPF 雞均不能向外界排毒。另外，感染14 d 后的各組雞抗體檢測(cè)中也未發(fā)現(xiàn)HI 抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)的情況。以上結(jié)果表明WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株對(duì)SPF 雞呈現(xiàn)低致病力，對(duì)家禽的威脅較小。

2.6 分離株對(duì)小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果WS/SD/S1-134/2019（H8N2）分離株感染小鼠3 d 后臟器病毒滴定檢測(cè)結(jié)果顯示，其能在小鼠肺臟和鼻甲中有效復(fù)制，病毒滴度分別為4.25 log10EID50/mL～5.5 log10EID50/mL 和3.25 log10EID50/mL～4.5 log10EID50/mL。對(duì)照組小鼠未檢測(cè)到病毒（圖4）。被檢3 只小鼠中兩只小鼠腎臟和一只小鼠脾臟中檢測(cè)到該病毒，病毒滴度分別為0.98 log10EID50/mL、2.75 log10EID50/mL 和1.5 log10EID50/mL。剩 余5 只小鼠連續(xù)觀察14 d，均未出現(xiàn)死亡，且無(wú)明顯臨床癥狀和體質(zhì)量下降。對(duì)照組小鼠也均正常（圖5）。表明該分離株對(duì)小鼠呈低致病力。

圖4 分離病毒感染3 d后小鼠臟器病毒滴定結(jié)果Fig.4 Viral titers in the organs of mice at 3 d post-inoculation

圖5 小鼠感染病毒后的體質(zhì)量變化Fig.5 Weight change of mice post-inoculation

3 討 論

野鳥(niǎo)是AIV 的自然宿主，H8 亞型AIV 主要分離自雁形目（野鴨、天鵝和鵝）鳥(niǎo)類(lèi)[8]。在AIV 數(shù)據(jù)（https://www.gisaid.org/）中，全球共分離到271 株H8亞型AIV，其中北美大陸占64.21%（174/271），歐亞大陸占34.32%（93/271），其他地區(qū)占1.47%（4/271），不同地區(qū)的分離數(shù)量不同可能與野鳥(niǎo)的棲息地有關(guān)。同時(shí)隨著野鳥(niǎo)的遷徙可能會(huì)使LPAIV 在各大洲間傳播，并可能導(dǎo)致AIV 的進(jìn)化以及重組[9-10]，而在全球8 條候鳥(niǎo)的遷徙路線中有3 條經(jīng)過(guò)中國(guó)，家養(yǎng)水禽可能通過(guò)和野鳥(niǎo)共用水源被感染，目前已有研究報(bào)道H8 亞型AIV 在家養(yǎng)水禽和野鳥(niǎo)中均被檢測(cè)到[11]。因此，對(duì)該亞型AIV 的監(jiān)測(cè)尤為重要，本研究從野鳥(niǎo)糞便分離到AIV WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株更說(shuō)明了對(duì)H8亞型AIV 監(jiān)測(cè)的重要性。

本研究對(duì)分離得到的WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株的遺傳進(jìn)化研究顯示，該H8N2 亞型AIV 的各基因節(jié)段來(lái)源于不同地區(qū)、不同宿主以及不同亞型AIV，說(shuō)明該病毒株具有跨大陸、跨物種及多亞型AIV 重組的特點(diǎn)。綜上所述，野鳥(niǎo)對(duì)AIV 的進(jìn)化和傳播起著重要作用，越冬或中途?？康乜赡苁且傍B(niǎo)與家禽之間傳播AIV 的關(guān)鍵。因此，需要加強(qiáng)對(duì)野鳥(niǎo)越冬或中途?？康氐谋O(jiān)測(cè)密度及頻率。

為了進(jìn)一步了解WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株分子進(jìn)化特征，本研究以A/Aichi/2/1968（H3N2）的NA蛋白為參考株，分析該分離病毒NA 的頸部缺失，其余的7 個(gè)蛋白均以A/goose/Guangdong/1/1996（H5N1）的蛋白序列為參考株，分析分離株的特殊氨基酸位點(diǎn)及序列。NA 蛋白的頸部缺失會(huì)影響病毒的感染性和復(fù)制能力[12]，本研究分離的H8N2 AIV N2蛋白在aa62～aa69 發(fā)生缺失，這可能會(huì)增強(qiáng)該病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制能力。PB2 蛋白與病毒的宿主適應(yīng)性及傳播能力相關(guān)[13]，但本研究分離的WS/SD/S1-134/2019（H8N2）株P(guān)B2 蛋白的aa627 與aa701 均未發(fā)生突變。PB1 蛋白與PA 蛋白通過(guò)改變RNA 依賴(lài)的RNA 聚合酶（RdRP）組分之間的親和力而影響病毒的復(fù)制能力和聚合酶活性[14]，且許多單一氨基酸的突變會(huì)改變病毒對(duì)小鼠的致病性，如D622G 的突變可以增強(qiáng)病毒對(duì)小鼠的致病性，本研究分離的H8N2 AIV 發(fā)生了D622G 的 突 變。NS 基 因 編 碼NS1、NS2 和NS3 蛋 白，其中NS1 蛋白中的單個(gè)氨基酸缺失或突變可能會(huì)影響AIV 對(duì)小鼠的致病性[15]，本研究分離的H8N2 亞型AIV 在aa80～aa84 未發(fā)生缺失，但在aa42、aa101、aa138 均發(fā)生了突變，這可能會(huì)增強(qiáng)該病毒對(duì)小鼠的致病性。

動(dòng)物致病性試驗(yàn)顯示，本研究分離的該新型重組H8N2 亞型AIV 雖然對(duì)家禽（雞）和哺乳動(dòng)物（小鼠）呈低致病力，但是該病毒已可以在小鼠體內(nèi)有效復(fù)制，且其基因組攜帶多個(gè)AIV 增強(qiáng)哺乳動(dòng)物致病性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，具有感染人的潛在風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)加大監(jiān)測(cè)力度，密切關(guān)注其在野鳥(niǎo)以及家禽中出現(xiàn)的頻率和波及面，以及對(duì)哺乳動(dòng)物的致病性。本研究為我國(guó)AI的綜合防控及公共衛(wèi)生安全提供參考數(shù)據(jù)。