miR-32-5p通過靶向下調(diào)EZH2的表達(dá)抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為與裸鼠移植瘤生長(zhǎng)

柳君君，張燕燕，雷衡陽(yáng)（.甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 普外科，甘肅 平?jīng)?744000；.甘肅省平?jīng)鍪械诙嗣襻t(yī)院 婦產(chǎn)科，甘肅 平?jīng)?744099）

胰腺癌是一種常見的胃腸道惡性腫瘤，胰腺導(dǎo)管腺癌占所有胰腺腫瘤的80%～90%[1]。其病死率較高，全球每年有超過22.7萬(wàn)患者死亡[2]。因胰腺癌早期缺乏特異性癥狀，部分患者就診時(shí)已進(jìn)入中晚期，腫瘤出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，手術(shù)及放化療等治療手段只能取得微弱的療效，使得胰腺癌患者的預(yù)后較差，1 年生存率不足10%[3]。因此，開發(fā)靶向治療藥物是阻止胰腺癌病情惡化的關(guān)鍵。微小RNA（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)度為19～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，能夠結(jié)合靶分子的3' UTR 來降解或抑制mRNA 的翻譯[4]。miRNA是各類腫瘤的關(guān)鍵調(diào)控因子，作為致癌基因或抑癌基因，調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移和凋亡[5]。miR?32?5p 是miR?32 家族成員，位于染色體Xq26.2 上，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。YE 等[6]發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p 抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖；WANG等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p抑制腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其表達(dá)與良好的預(yù)后呈正相關(guān)；LIU 等[8]研究顯示，miR?32?5p 在宮頸癌組織中下調(diào)，其可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；YUAN等[9]發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p在胰腺癌組織中呈低表達(dá)，其能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，從而起到抑癌基因的作用。zeste 基因增強(qiáng)子人類同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是多梳家族（polycomb group，PcG）蛋白復(fù)合體成員，參與調(diào)控細(xì)胞分化、增殖及維持穩(wěn)態(tài)。近年來發(fā)現(xiàn)EZH2與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AGRAWAL 等[10]在研究EZH2 對(duì)胰腺癌PANC?1、MIA PaCa?2 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)EZH2 能增強(qiáng)胰腺癌對(duì)放射治療的敏感性。ZHOU 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA 膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 通過上調(diào)EZH2 抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1C 的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和有氧糖酵解。目前，miR?32?5p和EZH2 在胰腺癌中的關(guān)系尚不明確。因此，本研究擬探討miR?32?5p 與EZH2 之間的靶向關(guān)系，及其對(duì)胰腺癌PANC?1 細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和EMT 進(jìn)程的影響，以期為胰腺癌的臨床靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料與標(biāo)本

收集2019 年1 月到2019 年10 月在甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的90例胰腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織，采集的標(biāo)本保存于液氮?；颊咭话闩R床資料包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM 分期、神經(jīng)浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度等（表1）。其中年齡為35～78 歲。根據(jù)TNM 分期分為Ⅰ期18 例，Ⅱ期23例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期19 例。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心、肝、腎功能障礙者；（2）免疫系統(tǒng)疾病者；（3）其他惡性腫瘤者；（4）妊娠或哺乳女性。所有患者均簽署知情同意書，本研究方案已獲得甘肅醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為No.K2019027）。

1.2 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞和試劑

人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞（HPDE6?C7）、胰腺癌細(xì)胞（PANC?1、AsPC?1、SW1990）均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。BALB/c 裸鼠購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格許可證號(hào)：[SYXK（京）2019?0030）]。RPMI 1640 培養(yǎng)液、胰蛋白 酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胎牛血清購(gòu)自中國(guó)四季青生物公司，mimic NC、miR?32?5p mimic、anti?miR?32?5p、pcDNA?EZH2、pcDNA?control 均購(gòu)自上海生物工程有限公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，miR?32?5p、EZH2、U6、GAPDH 引物均購(gòu)自上海華大基因科技有限公司，BCA 試劑盒、ECL顯影劑購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗人EZH2、鼠抗人Ki67、兔抗人MMP?2、鼠抗人E?cadherin、鼠抗人N?cadherin 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)CST 公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京博爾西科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

細(xì)胞培養(yǎng)：HPDE6?C7、PANC?1、AsPC?1、SW1990細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)約80%時(shí)，用胰蛋白酶消化并傳代。

細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染：將PANC?1 細(xì)胞分為對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染）、miR?NC組（轉(zhuǎn)染mimic NC）、miR?32?5p mimic 組（轉(zhuǎn)染miR?32?5p mimic）、Anti?miR?32?5p 組（轉(zhuǎn)染miR?32?5p inhibitor）；miR?NC+pcDNA?NC 組（轉(zhuǎn) 染mimic NC 和pcDNA?control）、miR?NC+pcDNAEZH2 組（轉(zhuǎn)染mimic?NC 和pcDNA?EZH2）、miR?32?5p mimic+pcDNA?NC 組（轉(zhuǎn) 染miR?32?5p mimic 和pcDNA?control）、miR?32?5p mimic+pcDNA EZH2 組（轉(zhuǎn)染miR?32?5p mimic 和pcDNA?EZH2）。根據(jù)LipofectamineTM2000說明書，將100 μL終濃度為100 nmol/L 的質(zhì)粒與LipofectamineTM2000 混合溶液加入各 組PANC?1 細(xì) 胞。對(duì)照組 僅加入LipofectamineTM2000 溶液。轉(zhuǎn)染4 h 后更換培養(yǎng)基，24 h后用qPCR及WB法檢測(cè)轉(zhuǎn)染是否成功。

1.4 在線生物數(shù)據(jù)庫(kù)分析EZH2 在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后生存期（OS）的關(guān)系

使用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析EZH2在胰腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平及其對(duì)患者預(yù)后（OS）的影響。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR?32?5p 與EZH2之間的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScanHuman 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p與EZH2 mRNA的3'UTR存在互補(bǔ)結(jié)合序列。將EZH2 mRNA的3'UTR序列克隆到雙熒光素報(bào)告基因載體，分別構(gòu)建野生型（EZH2 3'UTR?WT）和突變型（EZH23'UTR?MUT）質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒分別與mimic NC、miR?32?5p mimic混合，通過LipofectamineTM2000分別共轉(zhuǎn)染至各組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞制備細(xì)胞裂解物后檢測(cè)其熒光素酶活性。

1.6 qPCR法檢測(cè)胰腺癌組織及細(xì)胞中miR?32?5p和EZH2的表達(dá)

用TRIzol試劑從胰腺癌組織和轉(zhuǎn)染后各組PANC?1細(xì)胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR Green法進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95 ℃10 s、60 ℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。U6和GAPDH 作內(nèi)參基因，用2－ΔΔCT公式計(jì)算miR?32?5p、EZH2 的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列：miR?32?5p上游引物為5'?TATTGCACATTACTAAGCCTT?3'，下游引物 為5'?GAATACCTCGGACCCTGC?3' ；U6 上游引物 為5'?CTCGCTTCGGCAGCACA?3'，下游引物為5'?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3'；EZH2上游引物為5'?GCCAGACTGGGAAGAAATCTG?3'，下游引物為5'?TGTGCTGGAAAATCCAAGTCA?3'；GAPDH上游引物為5'?GAAGGTGAAGGTCGGAGT?3'，下游引物為5'?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3'。

1.7 MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的增殖能力

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化細(xì)胞并按1×103/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)至24、48、72和96 h時(shí)，加入20 μL MTT溶液，37 ℃處理4 h，離心去上清液，加入150 μL DMSO，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（D）值。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1×103/孔接種于6 孔板培養(yǎng)，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)10 d 后，用4%多聚甲醛溶液固定，用結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡（×40）觀察克隆形成情況并拍照。

1.8 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的遷移能力

將5×104個(gè)轉(zhuǎn)染后的PANC?1細(xì)胞接種于6孔板，分組同1.3，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)時(shí)，使用200 μL移液器吸頭劃痕，PBS洗去脫落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察并記錄劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下再次觀察記錄劃痕寬度。細(xì)胞劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度-24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%，用細(xì)胞劃痕愈合率表示細(xì)胞的遷移能力。

1.9 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的侵襲能力

在Transwell 小室平板平鋪一層人工基膜（matrigel）（約50 μL），用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整轉(zhuǎn)染后細(xì)胞密度至3×105個(gè)/mL，取50 μL各組單細(xì)胞懸液加至上室，在下室是含有10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS 清洗后，甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下觀察并對(duì)穿過膜的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)。

1.10 WB法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中EZH2、E?cadherin、N?cadherin的表達(dá)

各組轉(zhuǎn)染PANC?1細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，離心所得的上清液即為蛋白樣品。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組蛋白濃度，蛋白定量變性后進(jìn)行SDS?PAGE分離蛋白，電泳后迅速轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶TBST 溶液中室溫封閉2 h，加入對(duì)應(yīng)一抗EZH2、E?cadherin、N?cadherin（稀釋度均為1∶2 000）4 ℃處理過夜，TBST 洗滌3 次后，加入二抗（稀釋度為1∶10 000）室溫處理2 h，加入DAB顯色劑顯色，Bio?Rad凝膠成像儀記錄蛋白條帶灰度并拍照，以GAPDH作為內(nèi)參照，對(duì)各組蛋白進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.11 PANC?1細(xì)胞移植瘤裸鼠模型的建立與觀察

按隨機(jī)數(shù)字表法，將BALC/c裸鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，雌雄各半。4組分別為對(duì)照組（未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miR?NC組（轉(zhuǎn)染mimic NC細(xì)胞）、miR?32?5p mimic組（轉(zhuǎn)染miR?32?5p mimic細(xì)胞）、Anti?miR?32?5p組（轉(zhuǎn)染miR?32?5p inhibitor細(xì)胞）。在各組裸鼠右肩背部皮下分別注射0.2 mL（1×107個(gè) 細(xì)胞/mL）已轉(zhuǎn)染的PANC?1細(xì)胞懸液。正常飼養(yǎng)，觀察裸鼠皮下成瘤情況。第30天處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤后稱其質(zhì)量。

1.12 免疫組化染色法觀察移植瘤組織中Ki67、MMP?2的表達(dá)

移植瘤組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性后，分別加入鼠抗人Ki67（1∶1 000）、MMP?2 單抗（1∶1 000），4 ℃處理過夜。滴加辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗鼠二抗（1∶1 000），室溫處理1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性膠封片。最后，顯微鏡（×200）下鏡檢拍照。細(xì)胞核有棕色顆粒沉著的為陽(yáng)性染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野，陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)分析應(yīng)用軟件SPSS22.0，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用單因素和多因素分析影響miR?32?5p表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。以P＜0.05或P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在胰腺癌組織中EZH2 呈高表達(dá)、miR?32?5p 呈低表達(dá)且EZH2高表達(dá)患者OS短

通過分析GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)、TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx項(xiàng)目胰腺癌組織中的EZH2表達(dá)水平，顯示胰腺癌組織（163 例）的EZH2 表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（圖1A，P＜0.05），且分析38例患者的EZH2的表達(dá)水平越高，其OS越短（圖1B，P＜0.05）。qPCR法檢測(cè)本院收集的90例胰腺癌組織中miR?32?5p 和EZH2 mRNA表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，胰腺癌組織中miR?32?5p呈低表達(dá)而EZH2 mRNA明顯呈高表達(dá)，且胰腺癌組織中miR?32?5p 與EZH2 mRNA 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖1C、D、E，均P＜0.05）。

2.2 胰腺癌組織中miR?32?5p 的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

為了驗(yàn)證miR?32?5p在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，將90例胰腺癌組織中miR?32?5p相對(duì)表達(dá)水平以平均值為劃分線分為高表達(dá)組（32 例）、低表達(dá)組（58 例）。結(jié)果（表1）顯示，miR?32?5p 的表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小等無(wú)明顯關(guān)聯(lián)（均P＞0.05），與神經(jīng)浸潤(rùn)、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯的關(guān)聯(lián)（均P＜0.05）。將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果（表2）顯示，TNM Ⅲ～Ⅳ期、有神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中低分化程度是影響miR?32?5p低表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 miR-32-5p表達(dá)水平與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 在胰腺癌細(xì)胞中miR?32?5p 呈低表達(dá)而EZH2呈高表達(dá)

qPCR 法檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與正常胰腺HPDE6?C7細(xì)胞相比，PANC?1、AsPC?1、SW1990細(xì)胞中miR?32?5p明顯呈低表達(dá)，EZH2 mRNA呈明顯高表達(dá)（均P＜0.05）。

2.4 過表達(dá)或抑制miR?32?5p能抑制或促進(jìn)PANC?1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力和EMT進(jìn)程

克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖3A）、MTT 實(shí)驗(yàn)（圖3B）、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（圖3C）、Transwell 小室實(shí)驗(yàn)（圖5D）和WB實(shí)驗(yàn)（圖3E）檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR?NC 組相比，miR?32?5p mimic 組細(xì)胞 克隆形 成數(shù)目 減少、增殖能力降低、遷移能力降低、侵襲能力降低、E?cadherin 表達(dá)上調(diào)、N?cadherin 表達(dá)下調(diào)（均P＜0.05），Anti?miR?32?5p 組細(xì)胞克隆形成數(shù)目增加、細(xì)胞增殖能力升高、劃痕愈合率增加、細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)、E?cadherin表達(dá)下調(diào)、N?cadherin表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR?32?5p可抑制PANC?1 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT 進(jìn)程，而抑制miR?32?5p則能促進(jìn)PANC?1細(xì)胞的這些惡性生物學(xué)行為。

2.5 miR?32?5p靶向負(fù)調(diào)控EZH2的表達(dá)

TargetScanHuman 在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)EZH2 為miR?32?5p 的靶基 因，miR?32?5p 與EZH2 mRNA 3'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖4B）顯示，與miR?NC+EZH2 3'UTR?WT組比較，miR?32?5p+EZH2 3'UTR?WT 組細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR?32?5p mimic+EZH2 3' UTR?MUT 組細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯變化，證實(shí)miR?32?5p 靶向結(jié)合EZH2 mRNA 的3'UTR。qPCR法（圖4C、D、E、F）和WB法（圖4G、H）檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR?NC 組相比，miR?32?5p mimic 組miR?32?5p 表達(dá)上調(diào)、EZH2 mRNA 和其蛋白表達(dá)量下調(diào)（均P＜0.05），Anti?miR?32?5p組miR?32?5p 表達(dá)下調(diào)、EZH2 mRNA和其蛋白表達(dá)量上調(diào)（均P＜0.05），表明胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功，同時(shí)提示，細(xì)胞中miR?32?5p 對(duì)EZH2 表達(dá)具有明顯的抑制作用。與miR?NC+pcDNA?NC 組相比，miR?NC+pcDNA?EZH2 組miR?32?5p 表達(dá)下調(diào)、EZH2 mRNA和其蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；與miR?32?5p mimic+pcDNA?NC 組相比，miR?32?5p mimic+pcDNA EZH2組miR?32?5p 表達(dá)下調(diào)、EZH2 mRNA 和其蛋白水平上調(diào)（均P＜0.05）。上述結(jié)果表明，過表達(dá)miR?32?5p靶向抑制EZH2的表達(dá)。

2.6 過表達(dá)EZH2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR?32?5p對(duì)PANC?1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程的抑制作用

單克隆形成實(shí)驗(yàn)、MTT 法、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和WB法檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR?NC+pcDNA?NC組相比，miR?NC+pcDNA EZH2組細(xì)胞克隆形成數(shù)目增加（圖5A，P＜0.05）、增殖能力升高（圖5B，P＜0.05）、遷移（圖5C，P＜0.05）和侵襲能力增強(qiáng)（圖5D，P＜0.05），E?cadherin 表達(dá)下調(diào)、N?cadherin 表達(dá)上調(diào)（圖5E，均P＜0.05）；與miR?32?5p mimic+pcDNA?NC 組相比，miR?32?5p mimic+pcDNA EZH2組細(xì)胞克隆形成數(shù)目增加、增殖能力升高、遷移能力增加和侵襲能力增強(qiáng)、E?cadherin 表達(dá)下調(diào)、N?cadherin表達(dá)上調(diào)（均P＜0.05）。上述結(jié)果表明，過表達(dá)EZH2 能夠逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR?32?5p 對(duì)PANC?1 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程的抑制作用。

2.7 過表達(dá)miR?32?5p 抑制體內(nèi)PANC?1 細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)

移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR?NC組相比，miR?32?5p mimic 組移植瘤質(zhì)量明顯減小，Anti?miR?32?5p 組移植瘤質(zhì)量明顯增加（圖6A，均P＜0.05），說明過表達(dá)miR?32?5p抑制體內(nèi)PANC?1細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)。免疫組化染色法檢測(cè)結(jié)果（圖6B、C）顯示，與miR?NC組相比，miR?32?5p mimic 組移植瘤組織中Ki67 和MMP?2 陽(yáng)性細(xì)胞率減少（P＜0.05），Anti?miR?32?5p組移植瘤組織中Ki67和MMP?2陽(yáng)性細(xì)胞率增加（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miR?32?5p抑制體內(nèi)PANC?1細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論

miRNA作為致癌基因或抑癌基因，能夠調(diào)控胰腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和凋亡等進(jìn)程。以往研究已確定miR?32?5p 可通過調(diào)節(jié)各種靶基因的表達(dá)來影響癌癥的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。吳瑞平等[12]報(bào)道，敲低lncRNAX 染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本（X chromosome inactivation specific transcript，XIST）可上調(diào)miR?32?5p的表達(dá)水平、下調(diào)EZH2 表達(dá)水平，從而抑制結(jié)直腸癌HCT?8 細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。DANIEL等[13]發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p在前列腺癌組織中下調(diào)；WANG等[14]報(bào)道m(xù)iR?32?5p在三陰性乳腺癌中低表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，miR?32?5p 在胰腺癌細(xì)胞PANC?1、AsPC?1、SW1990中低表達(dá)；miR?32?5p表達(dá)水平與神經(jīng)浸潤(rùn)、腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征明顯關(guān)聯(lián)，且TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、有神經(jīng)浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中低分化的胰腺癌患者miR?32?5p 表達(dá)更低（P＜0.05）。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，過表達(dá)miR?32?5p可抑制PANC?1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT，抑制體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)，說明miR?32?5p 在胰腺癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。

miRNA 通常與目標(biāo)mRNA 的3'UTR 結(jié)合，篩查并鑒定miR?32?5p的靶基因?qū)⑦M(jìn)一步闡明miR?32?5p在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。EZH2 是多梳抑制性復(fù)合物2 的核心催化亞基，能誘導(dǎo)組蛋白H3 第27 位點(diǎn)賴氨酸甲基化，從而起到沉默靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，其在許多腫瘤組織中呈高表達(dá)，參與腫瘤惡性進(jìn)展[15]。盛泳佳等[16]發(fā)現(xiàn)，miR?124?3p靶向抑制EZH2的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞外因子1（Wnt?1）和β?連環(huán)蛋白（β?catenin）表達(dá)水平，遲緩肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。閔捷等[17]發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST 通過靶向miR?101下調(diào)其表達(dá)水平、上調(diào)EZH2 表達(dá)水平，從而促進(jìn)PANC?1 細(xì)胞的增殖和遷移能力。MA 等[18]發(fā)現(xiàn)，miR?139?5P 和EZH2 具有靶 向調(diào)控關(guān)系，過表達(dá)miR?139?5P 或敲低EZH2 能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲、EMT 和腫瘤形成。本研究通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中EZH2 呈高表達(dá)，且與預(yù)后較差相關(guān)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)EZH2 在胰腺癌組織和PANC?1、AsPC?1、SW1990細(xì)胞中呈高表達(dá)，miR?32?5p可靶向結(jié)合EZH2 并抑制其表達(dá)，過表達(dá)EZH2 可部分逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR?32?5p 對(duì)PANC?1 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT 的抑制作用，說明miR?32?5p 和EZH2 在胰腺癌細(xì)胞中存在調(diào)控關(guān)系（圖7）。

由于胰腺與許多器官毗鄰，胰腺癌細(xì)胞常常侵襲相鄰器官組織[19]。因此，確定胰腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制至關(guān)重要。Ki67是一種與增殖相關(guān)的核抗原，可以反映細(xì)胞增殖活性，在正常胰腺組織中低表達(dá)。CHAUDHARY 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，miR?205?5p 在胰腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，通過降低Ki67 的表達(dá)，抑制腫瘤干細(xì)胞的增殖和腫瘤生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR?32?5p 后腫瘤組織Ki67 表達(dá)降低，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。而異常的遷移和侵襲是腫瘤不良預(yù)后和復(fù)發(fā)的主要原因，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力對(duì)腫瘤的治療十分重要。基質(zhì)金屬蛋白酶是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的蛋白水解酶，在腫瘤細(xì)胞突破基底膜屏障而浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起重要作用，在許多腫瘤組織中，都發(fā)現(xiàn)MMP?2高表達(dá)。WANG 等[21]報(bào)道，載脂蛋白E2（apolipoprotein E2，ApoE2）在胰腺癌組織中過表達(dá)，ApoE2增強(qiáng)了胰腺癌細(xì)胞中MMP?2/9 的表達(dá)，從而促進(jìn)了細(xì)胞遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR?32?5p 后移植 瘤組織MMP?2 表達(dá)降 低，腫瘤細(xì) 胞侵襲轉(zhuǎn)移受到抑制，降低N?cadherin 水平、升高E?cadherin 水平抑制細(xì)胞的EMT；而過表達(dá)EZH2 能挽救上述影響。由此可推斷過表達(dá)miR?32?5p 通過靶向EZH2而抑制PANC?1細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，miR?32?5p 通過靶向調(diào)控EZH2 抑制PANC?1細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，以及體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為胰腺癌的防治提供了新的潛在靶點(diǎn)。但miR?32?5p和EZH2能否作為臨床有效的預(yù)測(cè)和治療靶標(biāo)應(yīng)用于胰腺癌患者的診療還有待進(jìn)一步研究。