不同碳氮比對中華草龜養(yǎng)殖水體生物絮團形成、水質(zhì)及菌群結(jié)構(gòu)的影響

張 凱，林怡靜，厲晨陽，劉芳玲，沈銘浩，鄭善堅

1. 浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004

2. 浙江省野生動物生物技術(shù)與保護利用重點實驗室，浙江 金華 321004

生物絮團技術(shù) (Biofloc technology, BFT) 是一種低成本、可持續(xù)且環(huán)境友好的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)[1-2]；通過添加外部碳源調(diào)控水體中的碳氮比，促進形成含有細菌、真菌、原生動物、微藻等的生物凝絮物，并利用系統(tǒng)中自養(yǎng)細菌和異氧細菌等微生物的處理作用，從水產(chǎn)養(yǎng)殖廢水中吸收有害氮組分以改善水質(zhì)，同時可產(chǎn)生微生物蛋白，直接作為水產(chǎn)動物的飼料[3-5]。生物絮團技術(shù)不僅可為水產(chǎn)動物提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，最大限度地減少了水體交換，同時可在一定程度上減少飼料供給。目前該技術(shù)已在蝦類養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用[6-8]，在其他水產(chǎn)動物上的研究、應(yīng)用也越來越多，如草魚 (Ctenopharyngodon idella)[9-10]、鯉 (Cyprinus carpio)[11-12]、尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus)[13-14]、團頭魴 (Megalobrama amblycephala)[15-16]等。

中華草龜 (Chinemys reevesii) 是龜鱉目中的常見種類，具有繁殖率高、抗逆性強、生長快等諸多優(yōu)勢，兼具較高的食用、藥用和觀賞價值，已成為我國產(chǎn)量最高的經(jīng)濟龜類[17]。目前中華草龜?shù)娜斯ゐB(yǎng)殖技術(shù)主要為溫室養(yǎng)殖，該技術(shù)雖可大幅提高其生長速度，縮短養(yǎng)殖周期，增加養(yǎng)殖產(chǎn)量和經(jīng)濟效益[18]，但存在水質(zhì)調(diào)控成本高、高蛋白飼料投喂量大等高投入、高污染的問題[19]。養(yǎng)殖過程中大量高蛋白飼料投喂會引起水體化學(xué)需氧量 (COD)、總氮和總磷指標偏高，養(yǎng)殖廢水對外界環(huán)境造成巨大壓力。隨著環(huán)保意識的提高，養(yǎng)殖廢水的控制與處理成為中華草龜溫室養(yǎng)殖中亟待解決的問題。目前龜鱉養(yǎng)殖廢水處理的相關(guān)研究較少，主要集中在化學(xué)絮凝法[20]和生物改良[21-22]等方式，王芬等[23]通過藕鱉共作的生態(tài)養(yǎng)殖實驗發(fā)現(xiàn)中華鱉的成活率、特定生長率和飼料轉(zhuǎn)化率相較于傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式均有較大提升，水體中氨氮、COD等指標顯著降低，蓮藕產(chǎn)量也得到了提高。許明宸[24]利用微生物制劑結(jié)合濕地的方式處理養(yǎng)殖尾水，建立快速而穩(wěn)定的尾水凈化系統(tǒng)，實現(xiàn)養(yǎng)殖尾水零排放。溫室龜鱉養(yǎng)殖的高密度和高投入導(dǎo)致養(yǎng)殖用水的嚴重污染，而現(xiàn)有的龜鱉尾水處理方式顯然無法與溫室養(yǎng)殖有機結(jié)合。生物絮團作為一種新型水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)，其充分利用微生物的水質(zhì)高效處理作用，使其在高密度養(yǎng)殖中備受青睞[25-26]。因此本研究通過調(diào)控水體碳氮比，探討碳源添加量對中華草龜溫室養(yǎng)殖過程中生物絮團形成及水質(zhì)的影響，研究建立并維持生物絮團的最佳條件，以期實現(xiàn)中華草龜溫室養(yǎng)殖水體零排放的目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中華草龜幼龜取自金華市綠和生態(tài)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，平均體質(zhì)量為 (76.66±9.83) g，體質(zhì)健康，飼養(yǎng)15 d后進行實驗。

1.2 實驗方法

實驗在溫室內(nèi) 70 cm×50 cm×40 cm 的實驗池中進行，每個實驗池養(yǎng)殖中華草龜6只。使用經(jīng)曝氣后的自來水蓄水20 cm，養(yǎng)殖水溫采用自動加熱棒控溫在 (31.4±0.7) ℃，實驗期間使用充氧泵 (森森牌CT-404，8 W) 對水體進行曝氣，每個實驗池設(shè)1個氣石。不進行換水和排污，但定期補充系統(tǒng)運行蒸發(fā)和采樣失水。每天07:00投喂烏龜專用膨化飼料 (mC∶mN=6∶1，北京大北農(nóng)科技集團股份有限公司) 1次，日投喂量為龜體質(zhì)量的1%。設(shè)3個實驗組，利用Avnimelech[1]的方法計算出調(diào)控不同碳氮比所要投放的蔗糖質(zhì)量，實驗中的碳氮比指添加物質(zhì) (飼料和蔗糖) 的碳元素與氮元素的質(zhì)量比，計算公式如下：

式中：mC為碳質(zhì)量；mCH為所需碳水化合物的添加量；Wc/ch為碳水化合物中碳的質(zhì)量分數(shù)；mN為氮質(zhì)量；mF為 投喂的飼料量；WN/F為飼料中氮的質(zhì)量分數(shù)；WN/ex為排泄物中氮的質(zhì)量分數(shù)；ANremoved和NITremoved分別為氨氮和亞硝酸鹽的去除率；CG為對照組；EG為實驗組。

將蔗糖溶于水中，在投飼后的水體中添加，使水體碳氮質(zhì)量比分別為10∶1 (CN-10)、15∶1(CN-15)和20∶1 (CN-20)，每組3個平行，同時設(shè)1個對照組CG。對照組僅投喂飼料，全程未添加蔗糖。

實驗期間每日進行水質(zhì)檢測，其中溶氧、pH、溫度采用電極法測定，氨氮、亞硝酸鹽、總氮使用Clever Chem 380全自動間斷化學(xué)分析儀測定，通過公式(3)、(4)計算氨氮、亞硝酸鹽(NO2-N) 的去除率，整個實驗周期 40 d。

1.3 生物絮團體積與形態(tài)觀察

通過使用 Imhoff管 (1000-0010, Nalgene) 進行生物絮團沉積量 (BFV) 的測定，每7 d進行一次取樣，樣品體積為1 L，經(jīng)30 min沉降后記錄沉積物的體積量，每組取3個平行的平均值。采用徠卡DM2500全自動顯微鏡拍照記錄生物絮團的粒徑，實驗具體步驟參照陳鵬飛[27]的研究方法。

1.4 生物絮團基因組 DNA 提取

對采集的CN-15實驗組和對照組的水樣2 L用0.22 μm濾膜進行真空抽濾，將濾膜置入5 mL無菌袋，于?80 ℃保存，絮團DNA采用Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒 (上海生工生物工程股份有限公司) 進行提取，對提取后的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量和完整性，所有DNA均在?20 ℃下保存。

1.5 高通量測序

將提取的絮團基因組DNA進行16S rDNA可變區(qū)擴增、純化與構(gòu)建測序文庫，并進行Illumina MiSeq測序。對測序獲得的有效序列進行OTU聚類分析，使用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學(xué)分析，并在各個水平統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

2 結(jié)果

2.1 生物絮團沉積量及其形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

對照組的生物絮團沉積量在整個實驗期間保持在 2 mL·L?1以下 (圖1)。實驗組水體中的生物絮團沉積量呈上升趨勢，14 d后均高于對照組且差異顯著 (P<0.05)；28 d 后基本保持穩(wěn)定，為 4～7 mL·L?1。在顯微鏡下 (400×) 觀察，生物絮團平均直徑約100～300 μm，絮團中充滿較多的絲狀體和細微顆粒 (圖2)。

圖1 實驗期不同處理組的生物絮團沉積量動態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes of biofloc deposits in different groups during experimental period

圖2 生物絮團的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察圖Fig. 2 Morphology of biofloc under microscope

2.2 碳氮比對水質(zhì)因子的調(diào)控

水質(zhì)檢測結(jié)果顯示，對照組的溶解氧質(zhì)量濃度和pH均高于實驗組且存在顯著差異 (P<0.05)，其中 CN-20 組的溶解氧僅為 0.21 mg·L?1，pH 為 7.01(表1)。表明添加碳源可以顯著降低養(yǎng)殖水體中的氨氮濃度 (P<0.05)，在實驗第1—第18天，各組氨氮濃度均先升高后降低，養(yǎng)殖20 d后，各實驗組的氨氮濃度顯著低于對照組并處于較低水平，40 d后 CN-15 組的氨氮水平最低，僅為 0.52 mg·L?1，氨氮去除率為76.7%；實驗組與對照組的亞硝酸鹽濃度在養(yǎng)殖15 d后差異顯著，實驗組顯著低于對照組 (P<0.05)，其中 CN-15和 CN-20組在 35 d后顯著下降，并維持在 0.48 和 0.42 mg·L?1，亞硝酸鹽去除率分別為64.4%和68.9%；添加碳源對總氮的影響較小，對照組與實驗組總氮濃度無顯著差異(P>0.05，圖3)。在養(yǎng)殖期的第11—第25天，實驗組的氨氮和亞硝酸鹽濃度大幅降低，這也再一次佐證通過添加碳源生成生物絮團對養(yǎng)殖水體具有顯著的凈化效果。

表1 實驗結(jié)束時不同處理組養(yǎng)殖水體的水質(zhì)參數(shù)Table 1 Water quality of aquaculture water bodies in different groups at the end of test

圖3 實驗期不同處理組氨氮、亞硝酸鹽和總氮的動態(tài)變化Fig. 3 Dynamic changes of mass concentration of ammonia-N,nitrite-N and total nitrogen in different groups during experimental period

2.3 細菌菌落結(jié)構(gòu)分析

對CN-15實驗組與對照組進行高通量測序。對照組和實驗組中微生物群落在門水平上的分布情況見圖4。兩組樣品細菌共隸屬于15個菌門，其中變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門和Patescibacteria為優(yōu)勢菌門。其中變形菌門占比最多，在對照組和實驗組中分別占43.58%和50.78%。對照組中的擬桿菌門、綠彎菌門、厚壁菌門、梭桿菌門和Dependentiae占比高于實驗組，分別高出14.86%、1.88%、2.6%、2.13%和2.36%；而實驗組 (CN-15) 中的變形菌門、放線菌門和Patescibacteria的占比高于對照組，分別高出7.2%、11.29%和5.73%。除纖維桿菌門和藍菌門只存在于對照組中 (占比0.34%)，其余菌門在兩組中均有一定占比。

圖4 對照組與實驗組 (CN-15) 細菌門水平的分布情況Fig. 4 Distribution of bacterial phylum levels in control group and experimental group (CN-15)

在綱水平上，兩組樣品細菌主要隸屬于32個菌綱，其主要優(yōu)勢菌綱為γ-變形菌綱和擬桿菌綱，在對照組中分別占38.88%和35.38%，在實驗組中分別占47.78%和19.53% (圖5)。此外，放線菌綱、厭氧繩菌綱、δ-變形菌綱在實驗組和對照組中為次要優(yōu)勢菌綱。實驗組中γ-變形菌綱、放線菌綱、纖細菌綱、Parcubacteria、綠彎菌綱的豐度顯著高于對照組，且Gracilibacteria、Parcubacteria、綠彎菌綱均為實驗組特有菌綱；而對照組中的擬桿菌綱、厭氧繩菌綱、梭桿菌、Babeliae、α-變形菌綱、梭菌綱、芽孢桿菌綱和纖維桿菌綱高于實驗組，纖維桿菌綱為對照組特有菌綱。

圖5 對照組與實驗組 (CN-15) 細菌綱水平的分布情況Fig. 5 Distribution of bacterial class levels in control group and experimental group (CN-15)

屬水平上，兩組樣品共檢測出113個菌屬，實驗組中主要可鑒定優(yōu)勢菌群為多核桿菌屬和沉積物桿狀菌屬，而對照組為腐敗螺旋菌屬、噬幾丁質(zhì)菌屬和擬桿菌屬。實驗組中Ambiguous、多核桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、Terrimonas、Nitrospira顯著高于對照組。對照組中擬桿菌屬、分支桿菌屬、海洋桿菌屬、Azospira、Permianibacter、Hypnocyclicus、Bacteriovorax、Bdellovibrio、Streptococcus等含量高于實驗組，Parasutterella和Mucilaginibac-ter是對照組特有菌屬；而多核桿菌屬、Terrimonas、Haliscomenobacter和Leucobacter在實驗組中含量較高 (圖6、圖7)。

圖6 對照組與實驗組 (CN-15) 細菌屬水平的分布情況Fig. 6 Distribution of bacterial genus levels in control group and experimental group (CN-15)

圖7 對照組與實驗組 (CN-15) 部分細菌屬水平差異圖Fig. 7 Difference of bacterial genus level between control group and experimental group (CN-15)

3 討論

3.1 不同碳氮比下溫室中華草龜池生物絮團形成與水質(zhì)調(diào)控

生物絮體是由有機物和微生物組成的非均勻顆粒的聚集基質(zhì)[28]，通過添加碳源以增加碳氮比，刺激異養(yǎng)細菌的生長，并使其利用總氮作為氮源以產(chǎn)生細菌蛋白[29]。隨著碳氮比的增加，生物絮團形成并逐漸穩(wěn)定，并開始進行同步硝化、反硝化作用 (SND) 和除磷作用以調(diào)節(jié)水質(zhì)，將水體中的含氮化合物直接以氮氧化物或氮氣的形式排出[30]。當(dāng)mC∶mN=15∶1時，對總氮、硝酸鹽和磷酸鹽的去除效果最佳[31]。同時，生物絮團還具有促進水產(chǎn)動物生長[32]、增強抗氧化功能[33]及降低飼料系數(shù)[34]等諸多功效，甚至可以增強水產(chǎn)動物對常見水產(chǎn)致病菌的抗病性[35]，這使得生物絮團技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。本研究同樣發(fā)現(xiàn)當(dāng)mC∶mN≥15時，對中華草龜池的水質(zhì)調(diào)控效果最佳，在mC∶mN≥10時能形成穩(wěn)定的生物絮團，生物絮團生成量隨碳氮比的增大而增多，當(dāng)碳氮比達到20∶1時生物絮團的生成量與碳氮比為15∶1時差異不顯著(P>0.05)，但水面產(chǎn)生較多泡沫，溶解氧和pH更低。因此，可推斷當(dāng)碳氮比為15∶1時，溫室中華草龜池水體中形成了較為穩(wěn)定的生物絮團，水體中氨氮、亞硝酸鹽含量較低。這與盧炳國等[9]對草魚池生物絮團形成的研究結(jié)果類似，而鄧吉朋等[36]發(fā)現(xiàn)：保持水體碳氮比為20∶1 時有利于斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon) 池生物絮團的形成；孫盛明等[15]研究發(fā)現(xiàn)團頭魴養(yǎng)殖水體中生物絮團的碳氮比大于16時可有效調(diào)節(jié)水質(zhì)；Zhe 等[37]發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比為20時，生物絮團能有效凈化水質(zhì)，促進黃金鯽 (Carassius auratus) 生長，提高飼料利用率，增強消化酶活力；國外針對生物絮團中添加碳源以控制碳氮比使其達到最佳效果的研究同樣非常多，但針對不同物種，其最適比例也存在明顯差異。Mirzakhani等[38]發(fā)現(xiàn)當(dāng)碳氮比為15∶1時，生物絮團系統(tǒng)對尼羅羅非魚的生長性能、腸道組織結(jié)構(gòu)和免疫應(yīng)答最佳。由此可見，合理的碳氮比是形成生物絮團并發(fā)揮其最佳效果的必要條件[27,39]。除碳氮比外，增氧曝氣也是生物絮團形成的必要條件，人工曝氣的主要目的是維持生物絮團的懸浮和微生物供氧所需。隨著實驗進行，水體中的溶氧量維持在較低水平，僅為 0.2～0.4 mg·L?1。這既與增氧泵功率較小有關(guān)，也與生物絮團中大量微生物的耗氧有關(guān)。雖然人工曝氣量較小，但由于實驗池水位較淺，加上中華草龜自身的爬行攪動，使得生物絮團始終能維持一定的懸浮狀態(tài)而未發(fā)生崩解。

3.2 中華草龜養(yǎng)殖水體生物絮團細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

高通量測序是一種低成本、更準確的新一代測序技術(shù)，可以同時對含多種生物的微生物群落進行鑒定[40-42]。本實驗對碳氮比為15∶1的實驗組與對照組的中華草龜養(yǎng)殖水體中生物絮團的細菌組成進行高通量測序。結(jié)果顯示，在門水平上，主要為變形菌門和擬桿菌門，這與日本對蝦 (P. japonicus) 養(yǎng)殖過程中生物絮團微生物多樣性的結(jié)果類似[43]。生物絮團是一個以異養(yǎng)微生物為主體的團聚物，因此其中有許多異養(yǎng)細菌在發(fā)揮作用，并在生物絮團凈化水質(zhì)方面起主導(dǎo)作用，主要為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門。養(yǎng)殖水體中變形菌門的種類大都是共生細菌，主要功能是清除污水中的有機物，在養(yǎng)殖尾水以及一些廢水處理中發(fā)揮重要作用[44-47]。作為一種應(yīng)用廣泛的益生菌，擬桿菌 (Bacteroides) 可產(chǎn)生促進養(yǎng)殖生物生長的益生素[48]。放線菌門是一種常見的益生菌，王俊華等[49]研究發(fā)現(xiàn)放線菌可有效去除黑臭水體中的氨氮、磷酸鹽等污染物，有利于水生生物的生長發(fā)育；同時，放線菌為分支狀菌絲體，其菌絲可以伸展到絮團以外，從而形成生物絮團的主要骨架結(jié)構(gòu)，在生物絮團形成過程中發(fā)揮重要功能[1]；這也是實驗組的生物絮團生成量高于對照組的原因之一。除幾種主要優(yōu)勢菌門外，厚壁菌門也有一定占比，包括梭菌綱和芽孢桿菌綱，且對照組含量顯著高于實驗組。在綱水平上，主要優(yōu)勢菌綱為變形菌綱、擬桿菌綱，其次是放線菌綱、厭氧繩菌綱。中華草龜養(yǎng)殖水體的生物絮團中，變形菌在數(shù)量上占主導(dǎo)地位。已有研究表明，污水處理系統(tǒng)的生物絮團中，變形菌綱占支配地位[50-51]，變形菌具有清除污水中有機物的作用[46]，能有效調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水質(zhì)。與對照相比，實驗組 (CN-15)放線菌綱的占比較大，這與放線菌組成生物絮團的基本結(jié)構(gòu)這一特性有關(guān)。Gracilibacteria為實驗組特有菌綱，隸屬于芽單胞菌門，在廢水處理中有一定的除磷功效[52]。在屬水平上，不動桿菌屬和氣單胞菌屬是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的條件致病菌，在實驗組(CN-15) 的生物絮團水體中，不動桿菌屬占比為0.02%，氣單胞菌屬占比為0.09%，均小于對照組的0.65%和0.53%。Bacteroides和Azospira在對照組中的占比顯著高于實驗組，Bacteroides是一類以有機物為最終電子受體的細菌，該菌可利用水體中的多種有機物碳源進行異養(yǎng)代謝反應(yīng)，產(chǎn)生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等。Azospira是一類兼性厭氧細菌，能利用水體中的多種碳源和氮源進行代謝，進行異化性硝酸鹽還原作用，在不良環(huán)境下形成胞素，同時分泌大量多糖，在水體中進行反硝化作用。

總體來看，在中華草龜養(yǎng)殖中，添加碳源對草龜池生物絮團的菌群結(jié)構(gòu)有一定影響，包括變形菌門、放線菌門和放線菌門等的占比，同時降低了假交替單胞菌屬 (Pseudoalteromonas) 和弧菌屬(Vibrio) 等條件致病菌的比例；生物絮團菌群結(jié)構(gòu)隨碳氮比的不同會發(fā)生一定變化，關(guān)于不同微生物對水質(zhì)的調(diào)節(jié)機理、有益菌和致病菌的比例等系列問題還需進一步研究。