內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白在甲亢性肌病中的作用*

黃雪梅，劉 麗，韋海濤，林媛媛△，盧德成

（1.南寧市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，南寧 530022；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院內(nèi)分泌科，南寧 530199）

甲狀腺功能亢進(jìn)癥（甲亢），屬于內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)病、多發(fā)病，是甲狀腺激素過(guò)多引起的臨床綜合征。而急性肌病是甲亢較少見(jiàn)的并發(fā)癥，起病急，臨床上可出現(xiàn)進(jìn)行性肌無(wú)力，表現(xiàn)為飲水嗆咳、吞咽困難、發(fā)音障礙等，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)意識(shí)障礙、呼吸肌麻痹。在感染、手術(shù)和外傷等誘因下，易出現(xiàn)甲亢危象。若在急性甲亢性肌病的基礎(chǔ)上誘發(fā)甲亢危象，患者常在1～2 周內(nèi)死亡[1-2]。急性甲亢性肌病臨床表現(xiàn)多樣，部分患者起病隱匿，部分患者以肌病為首發(fā)癥狀，部分患者肌病在甲亢癥狀出現(xiàn)一段時(shí)間后才出現(xiàn)，容易誤診、漏診[3-5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、翻譯后折疊、加工、修飾和脂質(zhì)代謝的重要細(xì)胞器，感應(yīng)和調(diào)節(jié)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞缺氧、營(yíng)養(yǎng)能量缺乏或炎癥因子等刺激時(shí)，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)會(huì)被破壞，干擾蛋白質(zhì)的折疊；未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔中，引發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）[6-8]。蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種跨膜激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶腔結(jié)構(gòu)域。在ERS狀態(tài)下，PERK能夠誘導(dǎo)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/homologous protein，CHOP）的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[9-11]。本研究選取2020年2月至2021 年6 月在南寧市第一人民醫(yī)院初次診斷的急性甲亢性肌病患者進(jìn)行分析，探討ERS 中PERK和CHOP 在急性甲亢性肌病中的作用，為急性甲亢性肌病的發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020 年2 月至2021 年6 月在南寧市第一人民醫(yī)院初次診斷的急性甲亢性肌病患者21例，其中男2例，女19例，年齡15～50歲，平均（28.19±9.68）歲；單純甲亢患者30 例，其中男5 例，女25 例，年齡18～55 歲，平均（31.30±9.60）歲。同時(shí)，選取健康者25 例作為正常對(duì)照組，其中男3 例，女22 例，年齡17～48 歲，平均（33.32±9.64）歲。3 組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床表現(xiàn)及相關(guān)檢查結(jié)果符合甲亢及急性肌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性甲亢、妊娠；合并有糖尿病、高血壓、神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、自身免疫性疾病、近期嚴(yán)重感染者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 臨床生化指標(biāo) 采集研究對(duì)象空腹肘靜脈血5 mL，取3 mL 靜脈血檢測(cè)血清促甲狀腺激素（TSH）、游離甲狀腺素（FT4）、游離三碘甲狀腺原氨酸（FT3）、促甲狀腺素受體抗體（TRAb）。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）取研究對(duì)象空腹靜脈血2 mL，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻后離心，棄上清液，留白細(xì)胞沉淀，加入NucleoZOL試劑（德國(guó)MN 公司）混勻，提取樣本總RNA，采用Prime Script?RT Master Mix 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 大連公司）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃保存。采用SYBR Green?Premix Ex TaqTM II（TaKaRa大連公司）進(jìn)行定量檢測(cè)分析。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s，退火60 ℃34 s，40個(gè)循環(huán)，熔解曲線95 ℃30 s，60 ℃15 s。引物序列由上海生工生物工程公司合成。PERK上游引物為5’-CCAGTTTTGTACTCCAATTGCA-3’，下游為5’-CAGATACAGCTGGCCTCTATAC-3’；CHOP上游引物為5’-GAGAATGAAAGGAAAGTGGCAC-3’，下游為5’-ATTCACCATTCGGTCAATCAGA-3’；GAPDH上游引物為5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游為5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。以GAPDH作為內(nèi)參，mRNA的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△CT法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，各組樣本比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（n）或百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用person相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)分析

急性甲亢性肌病組TRAb、FT4、FT3水平高于單純甲亢組和正常對(duì)照組（P＜0.01）；急性甲亢性肌病組TSH水平與單純甲亢組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組患者外周血生化指標(biāo)比較

表1 3組患者外周血生化指標(biāo)比較

與急性甲亢性肌病組比較，aP＜0.01。

2.2 PERK、CHOP mRNA表達(dá)水平

急性甲亢性肌病組PERK、CHOPmRNA 表達(dá)水平高于單純甲亢組和正常對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2 3組患者PERK和CHOP mRNA表達(dá)量比較

表2 3組患者PERK和CHOP mRNA表達(dá)量比較

與急性甲亢性肌病組比較，aP＜0.01。

2.3 相關(guān)性分析

在急性甲亢性肌病組中，TRAb 與PERK、CHOP mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.898，P＜0.01；r=0.897，P＜0.01），與血清FT4、FT3水平無(wú)相關(guān)性（r=0.307，P=0.175；r=0.393，P=0.078）；血清FT4與PERK、CHOP mRNA 表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（r=0.362，P=0.106；r=0.303，P=0.182）；血清FT3與PERK、CHOP mRNA表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性（r=0.356，P=0.113；r=0.414，P=0.062）,見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 TRAb與PERK mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

圖2 TRAb與CHOP mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示，急性甲亢性肌病患者TRAb、FT4、FT3水平比單純甲亢患者增高（P＜0.01）。朱少偉[5]研究亦發(fā)現(xiàn)，急性甲亢性肌病患者多有FT4、FT3明顯增高，TSH 降低。有研究報(bào)道，急性甲亢性肌病男性患者TRAb、FT4、FT3水平明顯高于單純甲亢組，而急性甲亢性肌病女性患者TRAb、FT4、FT3水平與單純甲亢組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[4]。

目前，急性甲亢性肌病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。急性甲亢性肌病是自身免疫性疾病，可能與延髓麻痹有關(guān)[14-15]；有研究表明，可能過(guò)多的甲狀腺激素激活細(xì)胞膜腺苷酸環(huán)化酶使細(xì)胞代謝增高，ATP 存儲(chǔ)減少，影響細(xì)胞的能量代謝[3,16]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，如能量代謝障礙、氧化應(yīng)激和鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡等會(huì)觸發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，從而觸發(fā)ERS。未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白累積激活PERK，進(jìn)而磷酸化真核翻譯起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α），活化轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4），調(diào)控CHOP 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[17-18]。持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的ERS 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，損傷機(jī)體功能，而CHOP 是ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特異性轉(zhuǎn)錄因子[10,19]。王丹等[20]研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫性腦炎患者外周血T 淋巴細(xì)胞CHOP 的表達(dá)顯著升高，ERS 抑制自身免疫性腦炎患者T 淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ERS可能與自身免疫性腦炎發(fā)生有關(guān)。謝希等[21]研究顯示，PERK和CHOP在糖尿病大鼠的胰腺組織中表達(dá)水平明顯升高，提示ERS PERK 和CHOP 在糖尿病大鼠模型胰腺組織被激活。Jia等[22]研究發(fā)現(xiàn)，ERS可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)主動(dòng)脈炎癥的退化；在CHOP缺陷小鼠模型中，CHOP缺失可以防止胸主動(dòng)脈瘤/夾層的形成和破裂。本研究結(jié)果顯示，急性甲亢性肌病組PERK、CHOPmRNA 表達(dá)水平高于單純甲亢組和正常對(duì)照組（P＜0.01），提示ERS中PERK、CHOP可能參與急性甲亢性肌病的發(fā)生、發(fā)展。

在ERS 過(guò)程中，機(jī)體的免疫系統(tǒng)、與壓力相關(guān)的通路均會(huì)受到影響。TRAb是甲狀腺內(nèi)的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白，TRAb 滴度水平對(duì)評(píng)價(jià)甲亢相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)、病情進(jìn)展及預(yù)后有著重要意義[23-24]。TRAb 水平增加可以減弱甲狀腺素和三碘甲狀腺原氨酸對(duì)甲狀腺濾泡上皮內(nèi)cAMP的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，ERS在機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答過(guò)中起著關(guān)鍵作用，免疫細(xì)胞具有較多的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和較高的蛋白質(zhì)折疊活性，更易發(fā)生ERS[25-26]。本研究相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，急性甲亢性肌病組TRAb 與PERK、CHOP mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與血清FT4、FT3水平無(wú)相關(guān)性。劉曉相等[27]研究結(jié)果顯示，血清TRAb 滴度與TSH、FT4、FT3水平無(wú)相關(guān)性。一項(xiàng)甲亢合并浸潤(rùn)性突眼的研究亦發(fā)現(xiàn)，血清TRAb 水平與FT4、FT3水平無(wú)相關(guān)性[28]。這與本研究急性甲亢性肌病組TRAb 與FT4、FT3水平無(wú)相關(guān)性的研究結(jié)果一致，而TRAb與PERK、CHOP mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)關(guān)系，提示TRAb 結(jié)合PERK、CHOP有利于早期判斷急性甲亢性肌病。

綜上所述，治療急性甲亢性肌病的關(guān)鍵在于早期診斷，以便及時(shí)治療。ERS 中PERK 和CHOP 可能參與急性甲亢性肌病的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程，TRAb聯(lián)合PERK、CHOP 有利于早期判斷急性甲亢性肌病。