基于Label-free技術(shù)的肝癌相關(guān)抗原KTN1蛋白質(zhì)組學(xué)研究*

潘 劍，張瑤堯，覃秋紅，陳承曉，黃天明，黃榮師，羅國(guó)容Δ

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021；2.廣西江濱醫(yī)院病理科，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530200）

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer）發(fā)病率位居2020年全球癌癥第6位，致死率位居第3位[1]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原發(fā)性肝癌主要的病理類型中75%～85%，其發(fā)病隱匿，被發(fā)現(xiàn)時(shí)患者往往已處于晚期且難以治愈，是威脅人類健康的主要因素之一[2]。而肝母細(xì)胞瘤（hepatoblastoma，HB）是兒童主要的原發(fā)性肝癌病理類型[3]。驅(qū)動(dòng)結(jié)合蛋白（Kinectin 1，簡(jiǎn)稱KTN1）基因定位于14 號(hào)染色體q22.3 上，mRNA 全長(zhǎng)約4.6 kb，是驅(qū)動(dòng)蛋白（Kinesin）的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜受體，參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及膜形態(tài)與結(jié)構(gòu)的維持[4]。近年相關(guān)研究表明，KTN1基因在細(xì)胞內(nèi)編碼相應(yīng)蛋白并參與許多疾病的進(jìn)展，包括神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及腫瘤性疾病等[5-7]。課題組前期利用大數(shù)據(jù)綜合分析73 個(gè)數(shù)據(jù)集的表達(dá)數(shù)據(jù)，明確KTN1 在HCC 中高表達(dá)，且可以作為HCC診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物。在HCC 細(xì)胞株Huh7 中敲除KTN1 基因，發(fā)現(xiàn)Huh7 細(xì)胞增殖能力受到抑制，早期和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量均顯著增加，同時(shí)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力也顯著下降，同時(shí)RNA-seq 檢測(cè)了敲除KTN1 基因之后HCC 細(xì)胞表達(dá)譜的改變，展示了差異基因參與的多個(gè)癌癥相關(guān)通路[6]。但KTN1影響HCC發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚。免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）主要用于鑒定2種蛋白之間在細(xì)胞內(nèi)是否發(fā)生了生理性的結(jié)合。非標(biāo)記定量（label-free）主要用于樣品之間同種蛋白質(zhì)差異的比較，通過計(jì)算肽段的母離子峰來鑒定樣品中的肽段或蛋白質(zhì)，再對(duì)所鑒定的蛋白進(jìn)行定量分析。本研究利用Co-IP技術(shù)在HCC 細(xì)胞和正常肝細(xì)胞株WRL68 中下拉與KTN1 結(jié)合的蛋白，利用label-free 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)KTN1 相結(jié)合的蛋白，分析KTN1 可能影響HCC生物學(xué)功能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 HCC 細(xì)胞系Huh7 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系HepG2、正常肝細(xì)胞系WRL68細(xì)胞和Hela細(xì)胞購(gòu)自武漢金開瑞生物工程有限公司。

1.2 主要的儀器設(shè)備與試劑 電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）；半干型轉(zhuǎn)膜儀（Typ-Nr.B337874，Biometra）；細(xì)胞超聲破碎儀（JY92-IIN，寧波新芝）；預(yù)染蛋白Maker（SM0441，F(xiàn)ermentas）；ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒（P004，Vigorous）；丙烯酰胺（341，BioSHARP）；Protein A/G agarose beads（20421，Pierce）；PMSF（ST506，Beyotime）。

1.3 提取細(xì)胞總蛋白（1）收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液在冰上操作；（2）將冰盒放置于搖床30 min；（3）12 000×g，4℃離心20 min，留少量做Western blotting分析。

1.4 蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)（1）PBS 清洗protein G瓊脂糖凝膠顆粒2次，RIPA（IP）緩沖液稀釋瓊脂糖凝膠至原濃度一半，吹打混勻；（2）取裂解液500 μL，加入1 μL正常與一抗同種屬的非免疫兔血清，再加入50 μL protein G 懸浮液；（3）4℃，孵育30 min，5 000 r/min 離心1 min；（4）預(yù)處理后裂解液體積約500 μL，按約0.2 mg裂解液總蛋白加2 μg抗體，4 ℃孵育過夜；（5）在裂解液—抗體孵育液中加入50 μL protein G 懸液；（6）4℃孵育2 h，5 000 r/min 離心1 min，上清，收集沉淀；（7）加入50 μL 甘氨酸溶液，輕柔混勻懸浮顆粒，5 000 r/min 離心1 min；加入5 μL Tris-HCl 溶液，再加蛋白酶抑制劑輕柔混勻；（8）SDS-PAGE及后續(xù)Western blotting（WB）。

1.5 Label-free 實(shí)驗(yàn)（1）蛋白提取和還原烷基化處理：用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，棄上清，加入蛋白裂解液，混勻后冰上孵育5 min；加l0 mmol/L 的DTT，冰浴超聲15 min；13 000×g，4 ℃離心20 min，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中；向離心管中加入4 倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃過夜；離心收集沉淀，空氣中晾干；加入8 mol/L urea 溶液重新溶解蛋白；加入DTT 至終濃度10 mmol/L，56 ℃水浴30 min進(jìn)行還原反應(yīng)；加入IAM 至終濃度55 mmol/L，暗處室溫放置30 min進(jìn)行烷基化反應(yīng)；Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。（2）酶解和除鹽：每個(gè)樣品取100 μg等量的蛋白質(zhì)用于胰蛋白酶消化；酶解后C18柱脫鹽，干燥脫鹽后真空冷凍。（3）液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析：質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用TripleTOF 5600+液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（SCIEX）。

1.6 蛋白質(zhì)組鑒定（1）數(shù)據(jù)庫(kù)選擇：NCBInr 全庫(kù)；（2）參數(shù)設(shè)置及鑒定結(jié)果用Protein Pilot 軟件分析質(zhì)譜的結(jié)果，參數(shù)設(shè)置，見表1。

表1 Protein Pilot參數(shù)設(shè)置

1.7 生物信息學(xué)分析 通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot的注釋信息，使用基因本體論（Gene Ontology，GO）對(duì)Huh7 細(xì)胞株中下拉的KTN1 結(jié)合蛋白進(jìn)行注釋分析，初步了解他們?cè)诩?xì)胞中的作用；Huh7 細(xì)胞株中下拉的KTN1 結(jié)合蛋白信息與KEGG（https://www.kegg.jp）公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行注釋。通過整合來自GEO、TCGA、ArrayExpress 的全球肝細(xì)胞癌組織樣本基因芯片及mRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，計(jì)算KTN1 結(jié)合蛋白的綜合表達(dá)水平及其與KTN1 的表達(dá)相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)提取效果鑒定及內(nèi)源性KTN1的WB檢測(cè) HepG2、Huh7、WRL68 等3 種細(xì)胞株的總蛋白條帶清晰可見，而且條帶的位置基本整齊一致，說明總蛋白的提取成功，可以進(jìn)行后續(xù)的Western blotting和Co-IP實(shí)驗(yàn)（圖1）。使用Hela細(xì)胞作為對(duì)照，結(jié)果可見4 種細(xì)胞在36 ku 大小位置有明顯的GAPDH的蛋白條帶，而且條帶灰度值基本一致（圖2）。

圖1 3種細(xì)胞總蛋白SDS-PAGE 電泳檢測(cè)

圖2 內(nèi)源性KTN1的WB檢測(cè)

2.2 Co-IP 后Western blotting 及Co-IP 后蛋白銀染結(jié)果 用KTN1 抗體進(jìn)行Co-IP 實(shí)驗(yàn)下拉的蛋白中也可以檢測(cè)到KTN1 蛋白的條帶，位置亦于156 ku處。而陰性對(duì)照IgG 下拉的蛋白中，未見任何蛋白條帶（圖3）。在HepG2、Huh7、WRL68 等3 個(gè)細(xì)胞中，經(jīng)過Co-IP富集均可見10個(gè)以上的條帶，而且條帶的位置基本與細(xì)胞總蛋白中的條帶相對(duì)應(yīng)，陰性對(duì)照IgG的泳道則沒有蛋白條帶或者極少的蛋白條帶（圖4）。

圖3 WB檢測(cè)Co-IP蛋白中KTN1的含量

圖4 Co-IP后蛋白銀染結(jié)果

2.3 蛋白質(zhì)組鑒定 3 種細(xì)胞中一共鑒定出29 種蛋白（表2），其中PRL、CASPE、ACTS、PRDX1 這4種蛋白僅在正常肝細(xì)胞株WRL68樣本中檢出，而H2B1L、IGHG2、VSXL2、RS18、H32、SHRM3、CALL5、SIK3這8種蛋白僅Huh7樣本中檢出（圖5）。

圖5 3個(gè)細(xì)胞株KTN1相結(jié)合蛋白的韋恩圖

表2 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

2.4 蛋白質(zhì)GO功能注釋 KTN1結(jié)合蛋白可以富集于14 個(gè)生物過程（圖6），其中cellular process、metabolic process、biological regulation、response to stimulus、multicellular organismal process、developmental process 等富集的蛋白數(shù)較多。這些蛋白還富集于11 個(gè)細(xì)胞組分，其中cell part、organelle、extracellular region part、organelle part有較多的蛋白富集。對(duì)于分子功能，這些蛋白一共富集于7 種分子功能，其中最多的是binding，一共富集了18種蛋白。

圖6 KTN1結(jié)合蛋白GO分析結(jié)果

2.5 蛋白質(zhì)KEGG 通路注釋 富集了2 個(gè)以上蛋白的通路有14 個(gè)，其中富集基因數(shù)最多的Alcoholism和Systemic lupus erythematosus兩個(gè)通路均富集了5 個(gè)基因（圖7），分別是ACTN4、H4、H32、H2A1J、H2B1L和CALL5、H4、H32、H2A1J、H2B1L。

圖7 KTN1結(jié)合蛋白的Pathway通路富集

2.6 KTN1 結(jié)合蛋白表達(dá)驗(yàn)證 如圖8 所示，與3135 例癌旁正常組織樣本相比，KTN1 結(jié)合蛋白H2B1L（由HIST2H2BE編碼）的mRNA水平在3532例肝細(xì)胞癌組織標(biāo)本中顯著升高。KTN1 與HIST2H2BE表達(dá)水平存在明顯正相關(guān)。

圖8 KTN1結(jié)合蛋白的表達(dá)驗(yàn)證

3 討論

KTN1可能通過其相結(jié)合的蛋白一起共同影響HCC的生物學(xué)過程。KTN1不僅可以與Rho家族成員的GTP 形式結(jié)合并相互作用，還可以與RhoA、Rac1 和Cdc42 的GDP 形式結(jié)合并相互作用，KTN1的肽片段可抑制吞噬體沿微管雙向運(yùn)動(dòng)。多項(xiàng)研究表明，KTN1 很可能成為Rho 家族的下游靶分子[9-10]。KTN1 可能通過調(diào)控CXCL8 基因的表達(dá)來促進(jìn)三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）細(xì)胞生物學(xué)功能變化，并有望成為TNBC治療的潛在分子靶點(diǎn)[11]。敲低KTN1 會(huì)降低EGFR 蛋白的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，增加凋亡，抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carcinomac，cSCC）細(xì)胞存活[12]。課題組前期也明確KTN1 在HCC 中高表達(dá)，且可以作為HCC 診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物。在HCC 細(xì)胞株Huh7 中敲除KTN1 基因后，Huh7 細(xì)胞株的生物學(xué)功能及表達(dá)譜發(fā)生了改變，差異基因參與多個(gè)癌癥相關(guān)通路[8]。目前尚缺乏KTN1 參與HCC的分子機(jī)制研究。從蛋白質(zhì)GO功能注釋結(jié)果可以看到，這些結(jié)合蛋白主要的功能是binding并且參與了多種重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞過程、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、多細(xì)胞生物過程、發(fā)育過程等。本研究發(fā)現(xiàn)H2B1L、IGHG2、VSXL2、RS18、H32、SHRM3、CALL5、SIK3 等8 種蛋白僅在HCC細(xì)胞系Huh7樣本中檢出。H2B1L是核小體的核心成分，核小體將DNA 包裹并壓縮成染色質(zhì)，通過阻礙反式作用因子與同源DNA序列的結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和染色體穩(wěn)定中發(fā)揮核心作用[13]。IGHG2 為免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)，具有抗原結(jié)合活性和免疫球蛋白受體結(jié)合活性，參與多個(gè)過程，包括激活免疫反應(yīng)、對(duì)其他生物的防御反應(yīng)和吞噬作用[14]。VSXL2是質(zhì)膜的組成部分，具有細(xì)胞粘附分子結(jié)合活性并參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附。這些關(guān)鍵蛋白可能共同參與了KTN1 在HCC 中的生物學(xué)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究檢測(cè)獲得的KTN1結(jié)合蛋白雖然僅有29個(gè)，數(shù)目較少。但Pathway 通路富集顯示KTN1 相結(jié)合的蛋白參與了重要的通路。已有學(xué)者在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者中發(fā)現(xiàn)抗KTN1 抗體，推測(cè)KTN1 參與了SLE 的進(jìn)展[15]，這與我們富集到的結(jié)合蛋白所參與的通路一致。Alcoholism和Viral carcinogenesis也是兩個(gè)重要通路，研究表明，飲酒和乙型肝炎病毒感染均為HCC 患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16-17]。KTN1 可能存在其它的蛋白亞型。從內(nèi)源性及Co-IP 后KTN1 蛋白Western blotting 檢測(cè)結(jié)果可以看到，3 個(gè)細(xì)胞系無論是總蛋白還是Co-IP 后，都在130～140 ku 處均出現(xiàn)了兩個(gè)蛋白條帶?？梢酝茰y(cè)抗體結(jié)合到了蛋白家族的共有序列。這與公共數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt 所提供的KTN1 3 個(gè)蛋白亞型數(shù)目和分子量都很接近（Q86UP2-2、Q86UP2-3、Q86UP2-4），說明Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究通過Co-IP結(jié)合Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在肝細(xì)胞癌株Huh7中鑒定出了20種KTN1蛋白結(jié)合蛋白，其中H2B1L、IGHG2、VSXL2、RS18、H32、SHRM3、CALL5、SIK3 等8 種蛋白僅在HCC細(xì)胞系Huh7樣本中檢出，其中H2B1L、IGHG2、VSXL2 可能共同參與了KTN1 在HCC 中的生物學(xué)作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。