敲低GINS1基因抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲能力*

梁 盼，楊艷平，馮國飛，溫文勝，張 哲△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室，南寧 530021；3.廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點實驗室，南寧 530021）

鼻咽癌（NPC）是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病部位多在鼻咽頂部和咽隱窩，以非角化性未分化癌多見。其發(fā)病具有地域性，且病因復雜，EB病毒、遺傳和環(huán)境是促進NPC發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。隨著放療、化療及靶向治療手段的發(fā)展，近年來NPC的療效已大幅提高，轉移和復發(fā)仍是目前NPC 的治療難點[2]。探索與NPC 相關的分子標志物和新的治療靶點，是NPC轉化醫(yī)學研究的重要切入點。

GINS（Go,Ichi,Nii,San）復合體是生物DNA復制機制中的組成部分，參與DNA復制的起始和延伸過程[3-4]。其有助于增加DNA底物親和力，使底物特異性結合到MCM亞基上，激活解旋酶（mini-chromosome maintenance,MCM），促進解螺旋[5]。該復合體由4 個亞基組成，包括亞基GINS1（Psf1），GINS2（Psf2），GINS3（Psf3）和GINS4（Sld5）[6]。近年的研究提示，GINS 復合物的高表達與腫瘤患者的不良預后有關[7-8]。GINS1的表達下調在滑膜肉瘤中可抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[9]，在肺癌可抑制細胞的增殖[10]。此外，GINS1的高表達還與肝癌的較強侵襲性表型和不良預后相關[11]。但GINS1在NPC 中的表達尚無相關報道。本研究主要探討GINS1在NPC 中的表達情況及其對NPC 的生物學行為的影響，進一步為NPC分子靶向診斷和治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和主要試劑 NPC 細胞株HONE1來自廣西醫(yī)科大學鼻咽癌重點實驗室。DMEM 培養(yǎng)基、KSFM培養(yǎng)基（配套生長因子）、澳洲胎牛血清購自Gibco 公司，轉染試劑Lipofectamine RNAi-MAX Reagent 購自Invitrogen 公司，siRNA 購自BIONEER 公司，逆轉錄試劑盒來自全式金品牌，SYBR Green Master Mix 買自Applied Biosystems 公司，細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測試劑盒購自Dojindo 公司。BCA 試劑盒購自碧云天公司，Nu-PAGETM 4-12%Bis-Tris Gel、Marker、sample buffer（4×）、running buffer（20×）購買于Thermo Fisher Scientific公司。GINS1抗體購自Abcam公司，GAPDH抗體購于Proteintech，二抗購自LI-COR公司。細胞劃痕插件購自ibidi 公司，Transwell 小室來自公司Corning，人工基質膠Matrigel來自BD公司。

1.1.2 組織標本 本次鼻咽部組織標本來自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診就診患者，且已經過病理科確診，黏膜慢性炎的患者15例，未分化型非角化性癌患者20例。所有樣本均經過廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理審查委員會批準（No.2016-KY-050），患者均知情同意。收集患者的相關臨床病理資料，采用美國聯(lián)合腫瘤委員會（AJCC）修訂的第8版NPC分期標準，對病例資料進行T分期、N分期及臨床分期。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物信息學分析 數(shù)據(jù)集來自NCBI的公共數(shù)據(jù)庫GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），納入數(shù)據(jù)集標準：（1）正常組和鼻咽癌組均不少于3例；（2）數(shù)據(jù)集來源物種為人；（3）包括GINS1的數(shù)據(jù)。由此納入人的NPC 基因表達譜公共數(shù)據(jù)集GSE12452、GSE13597、GSE34573、GSE61218、GSE53819 和GSE64634，統(tǒng)計學分析以上數(shù)據(jù)集中NPC和正常組織GINS1的轉錄水平情況。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 永生化人鼻咽上皮細胞系NP69與人NPC 細胞株（TW03、HK1、C666-1、5-8F、6-10B、CNE2、CNE1、HONE1）分別復蘇接種于KSFM培養(yǎng)基（含0.2%生長因子）、DMEM 完全培養(yǎng)基（含10%新生胎牛血清、1%青—鏈霉素混合液）中，置于37 ℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 更換培養(yǎng)液。

1.2.3 HONE1細胞轉染 分2組轉染，一組為轉染陰性對照組（siNC-HONE1 組）轉染無義序列；一組為實驗組（siGINS1-HONE1 組）轉染GINS1的序列。按照Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 說明書操作，待接種的6孔板細胞長至50%～60%融合率時進行轉染，分別將siNC 和siGINS1轉染至6 孔培養(yǎng)板中。6 h后6孔板細胞更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RTqPCR）、蛋白免疫印跡法（Western blotting）驗證轉染效率，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 RNA 提取和逆轉錄 利用TRIzol 法提取細胞總RNA，測定RNA濃度，參照逆轉錄試劑盒說明書配置逆轉錄體系，該體系含2 μg Total RNA、1μL Anchored Oligo（dT）Primer、10 μL Reaction Mix、1μL RI Enzyme Mix、1μL gDNA Remover 和對應的RNase-free Water。按照該體系進行逆轉錄，所得cDNA進行后續(xù)實驗。

1.2.5 RT-qPCR

采用SYBR Green 法，20 μL 的反應體系，該體系包括無菌去離子水7 μL，基因正向引物1 μL，基因反向引物1 μL，cDNA 1 μL 和SYBR Green 10 μL。反應條件為：95 ℃（預變性）10 min；95 ℃10 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)，所得結果使用2-ΔΔCT方法計算。目標基因為GINS1，上游引物序列為：5’-CAACTGCCTGCCTTCAACGA-3’，下游引物序列為：5’-ATCCGAAGCAAGCGGTCATA-3’。內參基因為GAPDH，上游引物序列為：5’-GCTCAGACACCATGGGGAAG-3’，下游引物序列為：5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGGG-3’。

1.2.6 Western blotting 法檢測細胞蛋白水平的表達 收集細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。70 ℃10 min蛋白變性，上樣，使用220 V 電壓電泳至泳道m(xù)aker 分離至膠底，切膠、轉膜后使用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，一抗過夜后，二抗孵育1.5 h，凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄。Image J 進行灰度值分析，蛋白相對表達量=（目的條帶灰度值－背景灰度值）/（內參條帶灰度值－背景灰度值）。

1.2.7 CCK-8法測定細胞活力

將轉染后的HONE1細胞，離心、計數(shù)。取96孔板居中位置，每孔接種細胞數(shù)為1 000 個/100 μL 培養(yǎng)基。siGINS1-HONE1 組與siNC-HONE1 組分別設置5個復孔/d，每天同一時段取10 μL CCK-8試劑溶液加入每孔，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀450 nm波長處測定細胞吸光度值（OD）值并記錄，連續(xù)測定5 d。

1.2.8 劃痕法測定細胞遷移能力 HONE1 細胞轉染24 h后，消化、離心、計數(shù)。將提前準備好的劃痕插件黏附于6 孔板，siGINS1-HONE1 組與siNCHONE1 組各5 個復孔。插件小室內接種細胞數(shù)為5×104個。待小室細胞貼壁長滿后，移除插件，在六孔板中加入無血清DMEM培養(yǎng)，顯微鏡下觀察劃痕傷口愈合情況，抓拍0 h、8 h 細胞劃痕照片，計算劃痕愈合率。傷口愈合率=（0 h劃痕面積－8 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.9 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將基質膠與無血清DMEM 按1∶29 比例混合稀釋，取100 μL稀釋后的基質膠鋪于Transwell小室上室，放置培養(yǎng)箱1.5 h。轉染后的HONE1 細胞取5×104個接種于上室，下室加入600 μL 含10%血清DMEM完全培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醛固定、1%結晶紫染色，顯微鏡下拍照，計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，STATA 13軟件進行Meta分析，Image J進行蛋白條帶灰度值分析和劃痕愈合率計算，GraphPad 8.0作圖。計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1GINS1在NPC細胞和腫瘤組織中轉錄上調

在NCBI平臺公共數(shù)據(jù)庫GEO提取公共數(shù)據(jù)集GSE12452，GSE13597，GSE34573，GSE61218，GSE53819 和GSE64634，使用兩獨立樣本t檢驗對GINS1轉錄水平的差異性進行分析。結果顯示，與正常組比較，鼻咽癌組中GINS1轉錄水平表達上調，差異均具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 GINS1在NPC基因芯片中的表達情況

對6個微陣列數(shù)據(jù)集進行Meta分析，鼻咽癌組包括111 例、正常組包括44 例，見表1。結果顯示，單個數(shù)據(jù)集存在異質性（I2=61.50%，P=0.02），NPC組織中的轉錄水平高于正常組織（SMD=2.23，95%CI：1.44～3.02，P=0.000），見圖2A。Begg 法（P=0.26）和Egger 法（P=0.38），檢驗結果表明本研究不存在明顯發(fā)表偏倚，見圖2B，圖2C。敏感度分析（圖2D）結果顯示，合并標準均差較為穩(wěn)定，剔除任一研究結果，不會改變結論。

表1 Meta分析中GEO數(shù)據(jù)集的詳細信息

圖2 GINS1在GEO數(shù)據(jù)庫NPC芯片數(shù)據(jù)集中的Meta分析

進一步通過RT-qPCR 技術，檢測了GINS1在NPC 細胞系和組織轉錄水平的差異，結果顯示，對比正常鼻咽上皮細胞系NP69，基因GINS1在NPC細胞系中轉錄上調（P＜0.05）（圖3A）；對比正常組織，GINS1基因在癌組織中呈轉錄上調（P＜0.01），圖3 B、圖3 C。

圖3 GINS1在NPC細胞和組織中轉錄水平表達情況

進一步分析GINS1的轉錄水平與患者臨床病理特征的關系，GINS1的轉錄水平在患者的年齡、性別、T分期、N分期及臨床分期中差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 臨床組織樣本中GINS1 轉錄水平與NPC 患者相關臨床病理參數(shù)的關系

表2 臨床組織樣本中GINS1 轉錄水平與NPC 患者相關臨床病理參數(shù)的關系

2.2 siRNA 沉默GINS1的表達抑制NPC 細胞的增殖能力

沉默GINS1后細胞中GINS1轉錄水平和蛋白水平表達降低，見圖4 A～圖4C。通過CCK-8 法檢測細胞貼壁后第1、第2、第3、第4、第5 天的OD 值，繪制生長曲線，結果顯示，與siNC-HONE1 組相比，siGINS1-HONE1 組第3、第4、第5 天細胞的吸光度值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4D。

圖4 沉默GINS1抑制NPC細胞增殖能力

2.3 siRNA 沉默GINS1的表達抑制NPC 細胞的遷移能力

劃痕結果顯示，siGINS1-HONE1 組與siNCHONE1 組細胞劃痕愈合率分別為（0.61±0.14）、（0.75±0.12），siGINS1-HONE1 組劃痕愈合率低于siNC-HONE1 組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=2.22，P＜0.05），見圖5。

圖5 沉默GINS1抑制NPC細胞的遷移能力

2.4 siRNA 沉默GINS1的表達抑制NPC 細胞的侵襲能力

Transwell 侵襲實驗顯示，siNC-HONE1 組穿膜細胞數(shù)為每視野（23±19）個，siGINS1-HONE1 組穿膜細胞數(shù)為每視野（113±25）個，兩組細胞數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.91，P＜0.05），見圖6。

圖6 沉默GINS1抑制NPC細胞的侵襲能力

3 討論

GINS1是GINS 復合體家族成員的一種亞基，是SLD5的伴侶，其在進化上是保守的，參與了低等真核生物[12-13]和人類的DNA復制過程[14]。GINS1是近幾年的研究熱點，大多情況下，該基因在腫瘤中表達上調，具有一定的腫瘤組織靶向性。本研究發(fā)現(xiàn)，GINS1在GEO 數(shù)據(jù)庫NPC 芯片中轉錄上調。通過RT-qPCR檢測，GINS1在NPC細胞系及組織中mRNA表達水平高于正常鼻咽上皮細胞及組織，結果與GEO 數(shù)據(jù)庫一致。提示GINS1可能是促癌基因。

本課題使用siRNA 干擾技術沉默細胞HONE1中基因GINS1表達后，通過CCK-8 法檢測到si-GINS1-HONE1 組細胞的增殖能力明顯受到抑制。Tang 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在滑膜肉瘤腫瘤中，下調GINS1的表達，可明顯抑制細胞增殖、促進細胞凋亡。Li等[15]發(fā)現(xiàn)，在肝癌中，下調GINS1可導致G1/S 期腫瘤細胞周期阻滯，進而降低腫瘤細胞的增殖能力。再者，Zhang等[10]的研究表明，敲低GINS1的表達后，肺癌細胞的增殖能力被抑制。本研究證實敲低GINS1后，可在體外抑制NPC 細胞的增殖，進一步證明GINS1有抑制腫瘤增殖的作用。

遷移和侵襲是腫瘤細胞重要的惡性生物學行為，亦是臨床上促使癌癥發(fā)展，造成死亡的主要原因。鑒于此，本研究使用劃痕和Transwell實驗檢測沉默GINS1的NPC細胞的遷移和侵襲能力，結果提示：沉默GINS1的表達，可以抑制鼻咽癌細胞的遷移侵襲能力。Saifei等[16]研究發(fā)現(xiàn)，沉默GINS2可以抑制甲狀腺癌MAPK通路過度激活的狀態(tài)，抑制該信號通路的相關蛋白表達，比如JNK、ERK 和p38，降低甲狀腺癌細胞的活力、遷移和侵襲功能。Dianmin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，下調GINS2增加了STAT1 和STAT2蛋白的表達，抑制肺癌的增殖和遷移。此外，Yang 等[18]研究指出，GINS4在非小細胞肺癌中高表達促進了細胞的遷移和侵襲能力。GINS 復合物亞基之間有著密不可分的關系，GINS2、GINS4在其他腫瘤當中的作用也提示著GINS1在NPC 中也可能是異常生物學行為發(fā)生的重要因素之一。本研究也證實了，沉默GINS1抑制NPC 遷移和侵襲能力，說明GINS1可能在NPC 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

綜上，GINS1在NPC中呈現(xiàn)轉錄上調，通過siRNA 敲低GINS1的表達，可以顯著抑制NPC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究表明，GINS2在腫瘤中可通過MAPK/ERK 通路、STAT 信號通路影響腫瘤的增殖和遷移[16-17]。因此，筆者假設，與GINS2同為GINS 家族的GINS1，也有通過MAPK/ERK 通路、STAT 信號通路影響NPC 惡性生物學行為的可能性，這也是本課題下一步的研究方向。闡明相關機制，本課題組能更好的了解GINS1基因作為癌基因的作用，為NPC的診斷和防治提供新的靶點。