金黃色葡萄球菌處理對奶牛乳腺上皮細胞外泌體表征的影響

蔡 萌，朱曉艷，王夢玲，劉子豪，熊本海，楊 亮

(中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

乳房炎是奶牛養(yǎng)殖中最重要的疾病之一，給全球牧場帶來巨大的經濟損失[1]。乳房炎造成奶牛產奶量顯著下降、乳品質量下降、獸醫(yī)護理成本增加及過早淘汰的損失約占總經濟損失的70%[2]。乳房炎通常由微生物感染引起，按乳房癥狀及乳汁變化分為臨床型和亞臨床型乳房炎，臨床型乳房炎的主要癥狀表現(xiàn)為乳房患處出現(xiàn)不同程度的充血、腫脹、手感溫熱伴有疼痛，乳汁變黃、質地變稠、偶有乳凝塊等[3]。亞臨床型乳房炎一般沒有明顯的臨床癥狀，肉眼無法看出異常，但是產奶量出現(xiàn)下降且乳中病原菌、膿球、白細胞含量增加而乳脂、蛋白質、乳糖、鉀、鈣、鎂、磷、鐵和鋅含量下降[4]。相對于臨床型乳房炎，亞臨床型乳房炎更難治療，潛在危害更大。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cell,BMEC)是乳腺感染時的第一道防線，是抵御病原微生物入侵的天然屏障，可以啟動機體對病原微生物最早的免疫識別和免疫應答，并協(xié)調后續(xù)免疫分子、免疫細胞應答等[5]。金黃色葡萄球菌(以下簡稱金葡菌)、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、大腸桿菌等是乳房炎的主要致病菌。其中，金葡菌是最常見且最重要的病原菌之一[6]。由于金葡菌的抵抗力及其逃避固有免疫和獲得性免疫反應的能力，經常引起亞臨床乳房炎和慢性乳房炎[7]。金葡菌可以黏附侵入BMEC誘導細胞內自噬體的形成，阻止胞內細菌清除，從而導致持續(xù)感染并引起慢性疾病[8-10]。

外泌體是一種直徑大小在30～150 nm之間的納米級小囊泡，它可以特異性地包裹一些蛋白質、脂質、核酸或miRNA等物質。外泌體具有生物活性，能夠被受體細胞吸收，實現(xiàn)細胞間的物質運輸和信息傳遞[11]。不同細胞來源的外泌體在免疫調節(jié)中起著不同的作用[12]。外泌體的來源非常廣泛，幾乎所有類型的細胞均可分泌，如凋亡細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞以及星形膠質細胞等[13-17]。外泌體普遍存在于各種體液中，如血清、血漿、尿液和母乳等[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，母乳中富含外泌體，但其來源不能確定，可能來源于BMEC、巨噬細胞、淋巴細胞，甚至來源于身體其他可以通過血液循環(huán)到達母乳的細胞[21-22]。外泌體與許多生理病理學功能有關，如信號傳導、免疫和感染等[17]。外泌體可以直接將病原體相關分子從細胞轉移到細胞，從而影響感染進程。結核分枝桿菌感染的巨噬細胞釋放的外泌體，可將分枝桿菌蛋白、脂質和核酸等傳遞給幼稚巨噬細胞，從而激活或抑制免疫反應[17]。在黏附侵襲性大腸桿菌感染腸上皮細胞后，細胞分泌的外泌體可以將特定的miRNA(如miR-30c和miR-130a)轉移到受體細胞，從而抑制自噬介導的細胞內細菌清除過程[23-24]。上述研究證實感染細胞釋放的外泌體參與宿主對病原感染的免疫反應。牛奶衍生的外泌體含有大量與乳腺和免疫相關的miRNA。試驗性或臨床性金葡菌感染導致的奶牛乳房炎會引起牛奶中外泌體miRNA表達譜的差異，差異miRNA包括miR-142-5p、miR-223、miR-223、miR-378和miR-185[25-27]。然而，BMEC感染乳房炎病原菌金葡菌與細胞釋放外泌體之間的關系仍然未知。本研究將探究不同金葡菌與BMEC數(shù)量比值(MOI)和處理后無外泌體培養(yǎng)時間對外泌體總濃度的影響，并對金葡菌誘導BMEC釋放的外泌體進行分離和鑒定，旨在確立一套金葡菌誘導BMEC釋放外泌體的細胞模型，為進一步探究其在感染進程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T細胞系)及金葡菌均由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所智慧畜牧業(yè)團隊保存。

1.2 主要試劑及儀器

LB肉湯、瓊脂粉均購自博奧星生物公司；CHROMagar培養(yǎng)基購自科瑪嘉公司；胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(青霉素、鏈霉素)均購自Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、PBS均購自HyClone公司；ECL發(fā)光液購自Tanon公司；慶大霉素、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自索萊寶科技有限公司。BCA試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司；兔抗CD9、CD81、TSG101單克隆抗體均購自Abcam公司。

主要儀器有超速離心機(Optima XE-90，貝克曼庫爾特公司)；透射電子顯微鏡(HT7700，日立公司)；掃描電子顯微鏡(LSM 900，蔡司公司)。

1.3 無外泌體胎牛血清的制備

將胎牛血清于4 ℃、110 000×g離心18 h，去除外泌體。緩慢收集上層血清，避免擾動底部的沉淀，收集的上層血清即為無外泌體血清，在細胞間無菌超凈臺中使用0.22 μm濾器過濾后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 建立金葡菌處理BMEC模型

1.4.1 準備菌株 使用LB肉湯復蘇金葡萄菌株，使用CHROMagar培養(yǎng)基純化菌株，取直徑1 mm單菌落增菌4 h，4 ℃保存待用。

1.4.2 準備細胞 細胞接種至T75細胞瓶中，每組15瓶，待細胞匯合度達到85%后做攻菌處理,此時每瓶約含2.3×106個細胞。

1.4.3 金葡菌處理BMEC 攻菌前更換細胞培養(yǎng)基為感染培養(yǎng)基(含5%無外泌體血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，無雙抗)。MOI=1組加入金葡菌2.3×106/瓶；MOI=10組加入金葡菌2.3×107/瓶，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。同時以未處理細胞作為空白對照組。

1.4.4 收集細胞上清 攻菌結束后徹底棄掉感染培養(yǎng)基，PBS清洗多次，以保證清洗掉未黏附的細菌。更換無外泌體培養(yǎng)基(含10%無外泌體血清、含1%雙抗、200 μg/mL慶大霉素)。將攻菌后的細胞分別培養(yǎng)9、12、24 h，收集細胞上清并用0.22 μm濾器過濾。

1.5 金葡菌處理BMEC后細胞形態(tài)學觀察

將細胞爬片提前置于6孔細胞培養(yǎng)板底部，然后進行細胞接種培養(yǎng)。PBS清洗細胞并壓碎細胞爬片。將細胞爬片碎片放入到4 ℃預冷的3%戊二醛中，4 ℃過夜固定。棄掉固定劑后，用PBS清洗細胞爬片碎片2次，每次10 min，加入預冷的1%鋨酸4 ℃固定1 h，再次清洗細胞爬片碎片。脫水，干燥。使用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

1.6 外泌體的分離純化及鑒定

1.6.1 外泌體分離純化 將收集的上清于4 ℃、110 000×g離心90 min，緩慢不徹底棄上清，避免擾動底部的沉淀，使用PBS重懸沉淀、再次離心，用PBS清洗外泌體。向外泌體沉淀中加入200 μL PBS重懸，并轉移到1.5 mL離心管中，徹底吹勻后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 外泌體形態(tài)觀察 取10 μL外泌體懸液滴在封口膜上，將銅網膜面置于外泌體懸滴上保持3 min，再置于蒸餾水懸滴上，保持1 min，然后置于醋酸雙氧鈾懸滴上，保持5 min。膜面朝上標記好樣品名稱置于平皿中，室溫干燥，保持潔凈。待銅網干燥后，在透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)并拍照。

1.6.3 外泌體粒徑分析 取外泌體20 μL，PBS稀釋5 000倍，通過粒徑分析儀(Zeta View，Particle Metrix)實時對懸浮液中50～1 000 nm直徑范圍內特定的外泌體等小囊泡進行逐個直接成像和觀察，最后通過軟件Zeta view 8.04.02計算外泌體粒徑分布。

1.6.4 外泌體標記蛋白CD9、CD81、TSG101的鑒定 每組取外泌體10 μL，使用RIPA裂解液提取總蛋白；總蛋白通過15% SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜，將PVDF膜置于5% BSA中37 ℃封閉1 h；1×PBST緩沖液洗滌2次，每次10 min。加入兔抗CD9(1∶500稀釋)、CD81(1∶500稀釋)、TSG101(1∶500稀釋)，4 ℃過夜。1×PBST緩沖液洗滌2次，每次10 min，加入HRP標記的抗兔IgG(H+L)(1∶5 000稀釋)，37 ℃反應50 min；1×PBST緩沖液洗滌2次，每次10 min。ECL顯影，根據(jù)蛋白大小調節(jié)曝光時間，保存圖像備用。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0軟件進行非參數(shù)分析(Kruskal-Wallis)，考察不同MOI及處理后培養(yǎng)不同時間對外泌體總蛋白濃度的影響。結果以平均值±標準誤表示，用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 金葡菌處理BMEC后細胞形態(tài)學分析

通過掃描電鏡觀察細胞表面超微結構(圖1)。由圖1A可知，空白對照組BMEC形態(tài)飽滿、結構完整，呈現(xiàn)橢圓形，表面微絨毛排列有序。金葡菌呈典型圓球狀，處理BMEC 3 h后，大量黏附在細胞膜表面；MOI=1和MOI=10組BMEC表面微絨毛均消失，細胞骨架萎縮、凹陷，后者細胞受損程度更嚴重(圖1B和圖1C)。

A，空白對照組；B，MOI=1；C，MOI=10。圖2同A，Control group;B,MOI=1；C,MOI=10. The same as fig.2圖1 不同處理組BMEC表面超微結構觀察(2 000×)Fig.1 Ultrastructural observation of BMEC surface in different processing group (2 000×)

2.2 外泌體形態(tài)學分析

采用透射電鏡觀察BMEC外泌體的形態(tài)(圖2)。由圖2可知，各組外泌體均為大小類似、形態(tài)一致的小囊泡，直徑在100～150 nm之間，均可見明顯雙層膜、中間凹陷的茶托樣結構，各組形態(tài)無明顯差異。其中，MOI=10組(圖2C)外泌體密度大于MOI=1組(圖2B)，且兩組均大于空白對照組(圖2A)。

圖2 不同處理組BMEC釋放的外泌體形態(tài)觀察(50 000×)Fig.2 Morphological observation of exosomes released by BMEC in different processing group (50 000×)

2.3 外泌體總蛋白濃度分析

由圖3可知，在各培養(yǎng)時間點，MOI=10時細胞上清外泌體總蛋白濃度高于其他2組，但各組間差異不顯著(P>0.05)。感染后繼續(xù)培養(yǎng)12 h，空白對照組及MOI=1、MOI=10攻菌組細胞上清外泌體總蛋白濃度均值分別為499.65、611.75和781.68 μg/mL，其中以MOI=10組獲取的外泌體總蛋白濃度最高。

根據(jù)外泌體總蛋白濃度結果，確定攻菌量MOI=10和攻菌后培養(yǎng)時間為12 h。后續(xù)外泌體鑒定只保留空白對照組和MOI=10組。

圖3 各處理組不同培養(yǎng)時間BMEC上清中外泌體總蛋白濃度Fig.3 Concentration of exosome protein from BMEC supernatant in each treatment group at different cultured time

2.4 外泌體粒徑分析和CD9、CD81、TSG101蛋白鑒定

使用納米顆粒追蹤分析技術確定外泌體大小，外泌體大小均一，無明顯差異(圖4)。其中，空白對照組平均粒徑112 nm,粒徑在40～185 nm 范圍的顆粒數(shù)占總顆粒數(shù)的96.62%(圖4A)；MOI=10組平均粒徑116 nm，粒徑在40～185 nm 范圍的顆粒數(shù)占總顆粒數(shù)的97.73%(圖4B)。Western blotting檢測結果顯示，空白對照組和MOI=10組外泌體標記蛋白CD9、CD81、TSG101表達均呈陽性(圖4C)。

A、B,分別為空白對照組和MOI=10組外泌體粒徑分析;C，Western blotting檢測結果A and B，The detection results of control group，MOI=10；C，Western blotting detection rusults圖4 外泌體納米顆粒追蹤分析和標記蛋白表達Fig.4 Nanoparticle tracking analysis and labeled protein expression of exosomes

3 討 論

乳房炎幾乎總是由病原微生物引起的一種奶牛乳房炎癥。它嚴重損害了奶牛養(yǎng)殖和乳制品行業(yè)。當BMEC細胞等受到細菌毒素的刺激后，會分泌大量的細胞因子和炎癥介質，進而引起乳房炎。乳房炎不僅造成產奶量下降，還降低了乳品質，甚至危害人體健康，嚴重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益。乳腺是奶牛防御疾病的第一道防線，BMEC不僅是抵御外來病原微生物入侵的天然屏障，還可以啟動機體對病原微生物最早的免疫識別和免疫應答[5]。外泌體通過旁分泌途徑在細胞之間進行交流，其攜帶的物質是啟動通信的開關[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，金葡菌以MOI=10處理BMEC 3 h后，繼續(xù)無外泌體培養(yǎng)細胞12 h收集上清，利用超速離心法快速獲得大量的外泌體。透射電鏡觀察結果顯示，囊泡顆粒具有外泌體典型雙層膜中間凹陷的茶托樣結構，各組樣品整體均一性良好。CD9、CD81和TSG101 蛋白為典型的外泌體標記蛋白，其主要涉及到了外泌體的生物發(fā)生過程。CD9、CD81是參與外泌體運輸?shù)乃目缒さ鞍准易宄蓡T，TSG101是轉運必需內體分選(ESCRT)復合體相關的蛋白，而ESCRT復合體是膜形成和斷裂的驅動器[29]。Western blotting結果顯示，本研究分離的囊泡顆粒表達外泌體表面標志物CD9、CD81和TSG101，進一步證明了透射電鏡觀察到的囊泡狀物質為外泌體。粒徑分析結果顯示，細胞上清中的空白對照組外泌體平均粒徑約112 nm，MOI=10組外泌體平均粒徑約116 nm，兩組外泌體粒徑范圍在40～185 nm占比高達95%以上，符合外泌體定義大小。

相同培養(yǎng)條件下，與MOI=1相比，MOI=10能刺激BMEC釋放更高濃度的外泌體。如克羅恩病患者的回腸黏膜中存在高流行的黏附侵襲性大腸桿菌。從表型上觀察，大腸桿菌可以通過與受體細胞的結合來增加腸上皮的通透性，進而促進其在巨噬細胞中存活和增殖。大腸桿菌在巨噬細胞內可以誘導細胞分泌更高濃度的外泌體[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，在相同MOI時，繼續(xù)無外泌體培養(yǎng)12 h，可收集分離的外泌體總量最多。推測原因是金葡菌侵染細胞后定植在胞內，培養(yǎng)24 h比12 h會導致更多的細胞死亡、凋亡，且破碎的細胞會釋放酶類物質，胞內細菌也會逃出細胞，這些都有可能會破壞上清中外泌體囊膜的完整性，進而影響外泌體的總量。已有研究報道，脂多糖可以刺激奶牛BMEC產生外泌體，引起外泌體中的miRNA差異變化[31-32]。轉化生長因子-β1(TGF-β1)刺激牛BMEC產生外泌體通過激活p38-MAPK通路抑制牛巨噬細胞的增殖，并可能干擾奶牛的免疫力[33]。本研究檢測不同MOI處理和培養(yǎng)時間的外泌體總量蛋白濃度，結果無顯著差異，這可能與奶牛乳腺的天然免疫機制有關。據(jù)報道，革蘭氏陽性細菌可引起奶牛乳腺較為緩慢或中等程度的免疫反應[34]，與金葡菌有關的乳房炎引起的先天免疫反應非常緩慢甚至不可察覺[35]。這種情況下外泌體總量無顯著差異，但外泌體功能可能存在一定的差異。自噬是一種參與清除入侵的病原微生物的生物過程，自噬體吞噬病原體并與溶酶體融合以發(fā)揮降解作用[36]。然而，一些細菌通過干擾自噬來逃避自噬降解機制，從而為自身的生存創(chuàng)造了有利條件。黏附侵襲性大腸桿菌感染腸上皮細胞后，細胞分泌的外泌體可以將特定的miRNA(如miR-30c和miR-130a)轉移到受體細胞，從而抑制自噬介導的細胞內細菌清除過程[30,37]。外泌體也與攜帶成孔α-毒素的金葡菌的致病性密切相關[38]。上述研究證實細菌感染會促使細胞釋放外泌體，但細菌侵入BMEC時自噬是否參與了細菌感染機制有待進一步研究。今后將進一步研究細菌感染對細胞釋放的外泌體攜帶物質組成及功能的影響。

4 結 論

本研究從形態(tài)學和分子生物學特征等方面證實試驗獲得的分離物為外泌體；MOI=10時，金葡菌處理細胞3 h后繼續(xù)無外泌體培養(yǎng)12 h，收獲的細胞上清中外泌體蛋白含量最高。本研究可為金葡菌誘導BMEC釋放外泌體的后續(xù)研究提供參考。