雙氫睪酮對小鼠卵泡顆粒細(xì)胞增殖與抗苗勒管激素表達(dá)的影響

于 凱，趙玉芬，翁 鈺，王 琴，郝紹瑜，于泊洋，杜晨光，蘇布登格日勒，李海軍

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010110)

卵泡顆粒細(xì)胞作為卵泡內(nèi)的一類功能細(xì)胞，對維持哺乳動物卵巢功能具有至關(guān)重要的作用[1]。促卵泡素(FSH)能夠調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的生長，促卵泡素受體(FSHR)是卵泡顆粒細(xì)胞特征性表達(dá)蛋白[2]。卵泡顆粒細(xì)胞的增殖或凋亡是卵泡發(fā)育或閉鎖的主要特征。研究表明，卵巢內(nèi)源性雄激素在調(diào)控卵泡發(fā)育中具有重要作用[3-7]。睪酮能通過激活蛋白激酶B(Akt)信號通路誘導(dǎo)小鼠原始卵泡的激活[3]；睪酮結(jié)合其雄激素受體(AR)可以促使牛初級卵泡向次級卵泡的轉(zhuǎn)變[4]；此外，AR基因被敲除后，小鼠卵泡顆粒細(xì)胞凋亡增加且出現(xiàn)排卵異常[5-7]。因此，探討雄激素及其受體在卵巢顆粒細(xì)胞增殖或凋亡過程中的作用，對于深入理解哺乳動物卵泡發(fā)育或者閉鎖發(fā)生機(jī)理具有重要意義。

哺乳動物卵巢內(nèi)主要存在4種內(nèi)源性雄激素，分別為脫氫表雄酮、雄烯二酮、睪酮與雙氫睪酮(DHT)，但其作用各有不同。前兩者是睪酮與DHT在卵巢內(nèi)合成過程的中間前體，而后兩者通過結(jié)合AR發(fā)揮各自特定生理作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在卵泡中雄烯二酮能夠轉(zhuǎn)化為睪酮，雄烯二酮與睪酮均可在細(xì)胞5α-還原酶的作用下不可逆地生成DHT，且DHT與AR的親和力顯著高于睪酮[9]。研究報道，體內(nèi)注射睪酮或DHT后，雌猴和雌鼠卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞與生長卵泡數(shù)量均顯著增加[10-11]，說明睪酮與DHT在卵巢卵泡發(fā)育過程中具有重要作用。由于卵巢內(nèi)雄激素種類多且作用機(jī)制復(fù)雜，致使相關(guān)機(jī)制研究難以深入甚至結(jié)果彼此矛盾。睪酮是參與卵泡發(fā)育與閉鎖調(diào)控的一類關(guān)鍵內(nèi)源雄激素，然而類似研究未能排除DHT的影響。有關(guān)綿羊卵巢的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，卵泡內(nèi)DHT濃度與AR的表達(dá)成正向依賴關(guān)系，隨著卵泡生長發(fā)育的進(jìn)行，DHT與AR的表達(dá)均逐漸下降[12]，但雙氫睪酮調(diào)節(jié)早期卵泡發(fā)育的機(jī)制鮮見報道。

抗苗勒管激素(AMH)是卵巢卵泡發(fā)育過程中主要由顆粒細(xì)胞分泌的一類關(guān)鍵內(nèi)源激素。研究發(fā)現(xiàn)，AMH能夠抑制芳香化酶(CYP19A1)的活性，進(jìn)而抑制雌二醇(E2)生成[13]。在哺乳動物卵泡發(fā)育過程中，AMH在青春期前卵泡處于較低水平，在青春期水平激增，隨后逐漸下降直到更年期；在小腔卵泡中AMH表達(dá)最強(qiáng)，隨后開始下降；在排卵前，除了卵丘細(xì)胞能夠檢測到少量AMH，其他細(xì)胞中幾乎檢測不到[14-15]。在健康卵巢中，AMH抑制有腔卵泡的發(fā)育，AMH水平下降是排卵的先決條件[14-15]。隨著雄激素水平增高，血清和卵泡液中AMH水平也隨之升高[16]；生理濃度下，隨著DHT濃度升高，綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中AR的表達(dá)也隨之升高[12]。研究發(fā)現(xiàn)，DHT能夠促進(jìn)人顆粒細(xì)胞AMH的表達(dá)[17]。綜上，DHT、AR與AMH等分子組成一個相對復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，共同參與了卵巢卵泡早期發(fā)育的調(diào)控過程。本研究以小鼠卵泡顆粒細(xì)胞為研究對象，通過研究DHT與AR調(diào)節(jié)劑(特異性抑制劑：Flutamide；特異性激動劑：11-ketodihydrotestosterone)對小鼠顆粒細(xì)胞增殖、AMH基因表達(dá)及蛋白水平的作用,以期為闡明DHT對卵泡發(fā)育影響的機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物 50只3周齡雌性昆明小鼠(SPF級)，體重(22～25) g，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(22±1)℃，濕度保持在50%～60%，光照條件為12 h光照和12 h黑暗。

1.1.2 主要試劑 雙氫睪酮(DHT)購自Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)、牛血清白蛋白(BSA)均購自CLARK Bioscience公司；青-鏈霉素購自Solarbio公司；雄激素受體抑制劑(Flutamide,HY-B0022)、雄激素受體激動劑(11-ketodihydrotestosterone，HY-135794)、AMH蛋白ELISA檢測試劑盒均購自MCE公司；CCK-8(C6005)購自US Everbright公司；一抗Anti-FSHR(22665-1-AP)購自Proteintech公司；熒光二抗(A32732)購自Abcam公司；細(xì)胞RNA微量提取試劑盒(74034)購自QIAGEN公司；M5 Sprint qPCR RT Kit with gDNA Remover(MF949-01)、2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq(MF787-01)均購自Mei5bio公司。

1.2 顆粒細(xì)胞的收集、培養(yǎng)與生物學(xué)特性鑒定

1.2.1 顆粒細(xì)胞的收集、培養(yǎng) 給小鼠注射孕馬血清促性腺激素(PMSG，10 IU/只)，48 h后以頸椎脫臼法處死，收集卵巢。將卵巢在預(yù)熱的PBS中清洗2次，轉(zhuǎn)移到預(yù)熱的DMEM/F12培養(yǎng)基中(含1%的青-鏈霉素)，使用1 mL注射器針頭刺破卵泡，在培養(yǎng)箱中靜置3 min。使用300目一次性過濾篩進(jìn)行過濾，1 200 r/min離心5 min，棄上清后加入培養(yǎng)基吹打懸浮，再次進(jìn)行離心，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基吹打懸浮，接種在培養(yǎng)瓶中，隔天換液。

1.2.2 顆粒細(xì)胞的形態(tài)鑒定 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的顆粒細(xì)胞傳代到24孔板中，培養(yǎng)48 h后使用PBS清洗(3次，5 min/次)；使用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，用PBS清洗；蘇木精染色15 min，1%鹽酸分化液中作用30 s，流水沖洗干凈；HE染色1 min，使用95%乙醇進(jìn)行調(diào)色；梯度酒精脫水：95%乙醇5 s→95%乙醇5 s→100%乙醇1 min；用中性樹脂將細(xì)胞爬片固定在載玻片上(細(xì)胞面朝上)，放入燒杯中使用二甲苯透明2次，每次1 min，立式光學(xué)顯微鏡(SZX16，OLYMPUS)下觀察并拍照。

1.2.3 顆粒細(xì)胞的生長曲線繪制 采用CCK-8檢測細(xì)胞的增殖。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞(3×104/mL)接種到96孔板中(100 μL/孔)培養(yǎng)，每天取一排孔滴加CCK-8(10 μL/孔),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀檢測D450 nm值，重復(fù)此操作7 d，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.2.4 顆粒細(xì)胞FSHR表達(dá)鑒定 將顆粒細(xì)胞接種到共聚焦小皿上，當(dāng)匯合度達(dá)50%時，使用PBS清洗；使用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定20 min，用PBS洗3次，5 min/次；使用0.3% Triton X-100室溫通透20 min，用PBS洗3次；5% BSA室溫封閉30 min，加入一抗Anti-FSHR(1∶200)，4 ℃濕盒中孵育過夜；用PBS洗3次，加熒光二抗(1∶200)，避光，濕盒中37 ℃孵育1 h，用PBS洗3次，加抗熒光衰減劑，封片后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 不同濃度DHT對小鼠顆粒細(xì)胞增殖的影響

將第2代顆粒細(xì)胞接種到6孔板中(3×104/孔)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓處理12 h，然后在培養(yǎng)基中添加不同濃度DHT(0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)培養(yǎng)48 h，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)每組細(xì)胞，檢測顆粒細(xì)胞增殖情況。

1.4 不同濃度DHT對小鼠顆粒細(xì)胞中AMH mRNA及蛋白含量的影響

1.4.1 實(shí)時熒光定量PCR檢測AMH mRNA的表達(dá) 按照1.3中的處理方法，在培養(yǎng)基中添加0、10-7、10-5mol/L DHT，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中小鼠AMH基因序列(登錄號：11705)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，具體信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL：Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，Primer Mix 1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s；57 ℃退火15 s；72 ℃延伸，60 s，共35個循環(huán)。

表1 引物信息

1.4.2 ELISA法檢測AMH蛋白的含量 收集1.4.1各組顆粒細(xì)胞，按照ELISA試劑盒說明書檢測AMH蛋白的含量。

1.5 DHT與AR調(diào)節(jié)劑聯(lián)合處理對小鼠顆粒細(xì)胞增殖及AMH蛋白含量的影響

將第2代顆粒細(xì)胞接種到6孔板中(3×104/孔)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時用無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓處理12 h。然后在培養(yǎng)基分別添加10-6mol/L Flutamide、10-7mol/L DHT、10-7mol/L DHT+10-6mol/L Flutamide、10-5mol/L DH、10-5mol/L DHT+10-8mol/L 11-ketodihydrotestosterone，分別記為F、D7、DF、D5、DK組，以不添加藥物為對照組。培養(yǎng)48 h后，按1.3的方法檢測顆粒細(xì)胞增殖情況；按1.4.2方法檢測各組顆粒細(xì)胞AMH蛋白含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Post Hoc檢驗(yàn)組間差異，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

HE染色結(jié)果顯示，顆粒細(xì)胞貼壁后呈梭形或鋪路石狀(圖1A)；細(xì)胞生長曲線呈S型(圖1B)，表明細(xì)胞傳代后仍能保持原有的生長活力。細(xì)胞免熒光結(jié)果顯示，小鼠顆粒細(xì)胞普遍表達(dá)FSHR(圖2)。表明分離的顆粒細(xì)胞純度較高，可用于后續(xù)研究。

2.2 不同濃度DHT對小鼠顆粒細(xì)胞增殖的影響

由圖3可知，在10-9～10-7mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著DHT濃度升高，細(xì)胞數(shù)量逐漸上升；在10-7～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)，隨著DHT濃度升高，細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。與0 mol/L DHT組相比，10-8mol/L DHT組細(xì)胞增殖顯著增加(P<0.05)，10-7mol/L DHT組細(xì)胞增殖極顯著增加(P<0.01)，10-5mol/L DHT組細(xì)胞增殖顯著降低(P<0.05)。后續(xù)試驗(yàn)用10-7和10-5mol/L DHT處理顆粒細(xì)胞。

圖1 顆粒細(xì)胞形態(tài)觀察(A，100×)和生長曲線(B)Fig.1 Morphology observation (A,100 ×) and growth curve (B) of granulosa cells

圖2 顆粒細(xì)胞免疫熒光結(jié)果(100×)Fig.2 Immunofluorescence results of granulosa cells (100×)

與0 mol/L DHT組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。圖4同Compared with the treatment group of 0 mol/L DHT,*,Significant difference(P<0.05);*,Extremely significant difference (P<0.01)；No *,No significant difference(P<0.05).The same as table 4圖3 不同濃度DHT對小鼠顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of different concentrations of DHT on the proliferation of mouse granulosa cells

2.3 不同濃度DHT對小鼠顆粒細(xì)胞中AMH mRNA和蛋白含量的影響

由圖4可知，與0 mol/L DHT組相比，10-7mol/L DHT組AMH mRNA與蛋白含量均極顯著增加(P<0.01)，10-5mol/L DHT組AMH mRNA與蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。

圖4 不同濃度DHT對小鼠顆粒細(xì)胞中AMH mRNA(A)和蛋白含量(B)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of DHT on AMH mRNA (A) and protein content (B) in mouse granulosa cells

2.4 DHT與AR調(diào)節(jié)劑聯(lián)合處理對小鼠顆粒細(xì)胞增殖的影響

由圖5可知，對照組與F組顆粒細(xì)胞數(shù)量無顯著差異(P>0.05)；與D7組相比，DF組顆粒細(xì)胞的數(shù)量極顯著下降(P<0.01)；與D5組相比，DK組顆粒細(xì)胞數(shù)量極顯著升高(P<0.01)。

①C，對照組；F，10-6 mol/L Flutamide組；D7，10-7 mol/L DHT組；DF，10-7 mol/L DHT+10-6 mol/L Flutamide組；D5，10-5 mol/L DHT組；DK，10-5 mol/L DHT+10-8 mol/L11-ketodihydrotestosterone組。②**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)。圖6同①C,Control group;F,10-6 mol/L flutamide group;D7,10-7 mol/L DHT group;DF,10-7 mol/L DHT and 10-6 mol/L flutamide combined treatment group;D5,10-5 mol/L DHT group;DK,10-5 mol/L DHT and 10-8 mol/L 11 ketodihydroprosterone combined treatment group.②**，Extremely significant difference (P<0.01)；ns,No significant difference (P>0.05).The same as fig.6圖5 不同濃度DHT與AR調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合處理對于小鼠顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of combined treatment of different concentrations of DHT and AR regulator on the proliferation of mouse granulosa cells

2.5 DHT與AR調(diào)節(jié)劑的聯(lián)合處理對于小鼠顆粒細(xì)胞中AMH蛋白含量的影響

由圖6可知，對照組與F組中顆粒細(xì)胞的AMH蛋白含量差異不顯著(P>0.05)；與D7組相比，DF組中顆粒細(xì)胞的AMH蛋白含量極顯著降低(P<0.01)；與D5組相比，DK組AMH蛋白含量極顯著增加(P<0.01)。

圖6 不同濃度DHT與AR調(diào)節(jié)劑聯(lián)合處理對小鼠顆粒細(xì)胞中AMH蛋白含量的影響Fig.6 Effects of combined treatment of different concentrations of DHT and AR regulator on the content of AMH protein in mouse granulosa cells

3 討 論

雌性動物性成熟后，卵巢卵泡發(fā)育即啟動，進(jìn)入一個周而復(fù)始且較為復(fù)雜的生長周期。研究顯示，卵巢內(nèi)源性雄激素的合成與分泌對卵泡募集與選擇具有關(guān)鍵作用[6]。因此，探討雄激素對卵泡顆粒細(xì)胞增殖的影響機(jī)制，可為深入理解卵泡發(fā)育或閉鎖發(fā)生機(jī)制提供重要依據(jù)。卵泡顆粒細(xì)胞增殖以及卵泡腔大小的增加是排卵前卵泡由小變大的必要條件[18-20]。本研究采用機(jī)械法收集小鼠卵泡顆粒細(xì)胞，鑒定結(jié)果顯示，分離的小鼠顆粒細(xì)胞表達(dá)顆粒細(xì)胞特異性標(biāo)記FSHR，且經(jīng)體外傳代培養(yǎng)后仍具有較高的純度與良好的增殖能力。

在卵泡發(fā)育過程中，DHT主要是由睪酮在5α-還原酶的作用下轉(zhuǎn)化而來。研究表明，5α-還原酶和DHT在早期卵泡發(fā)育階段都處于較高水平[9,12]，說明DHT對早期卵泡生長發(fā)育具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，10-7mol/L DHT能夠極顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和AMH蛋白分泌，而10-5mol/L DHT則顯著降低顆粒細(xì)胞增殖，且不同濃度DHT處理下，細(xì)胞增殖變化和AMH基因與蛋白含量變化趨勢基本一致。研究報道，10-7mol/L DHT能夠顯著促進(jìn)大鼠顆粒細(xì)胞的增殖[21]，10-8mol/L DHT能夠顯著促進(jìn)人顆粒細(xì)胞AMH的表達(dá)[22]，而10-5mol/L DHT顯著抑制大鼠顆粒細(xì)胞的增殖[21,23]，10-5mol/L DHT雖造成人顆粒細(xì)胞中AMH的表達(dá)下降，但差異不顯著[22]。這些研究結(jié)果說明卵泡內(nèi)DHT含量變化可能是AMH表達(dá)與顆粒細(xì)胞增殖改變的一個前提條件。從腔前卵泡到有腔卵泡的發(fā)育過程中，卵泡內(nèi)源激素DHT和AMH的表達(dá)隨著發(fā)育逐漸下降，且對體外培養(yǎng)的人顆粒細(xì)胞研究表明AMH能夠抑制顆粒細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)[17]。本研究結(jié)果表明，10-7mol/L DHT對顆粒細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用可能與AMH的抗凋亡作用有關(guān)；10-5mol/L DHT所造成的顆粒細(xì)胞增殖減弱可能與AMH表達(dá)下降有關(guān)。但是DHT通過何種途徑參與小鼠顆粒細(xì)胞AMH表達(dá)調(diào)節(jié)需進(jìn)一步研究。

DHT是卵泡發(fā)育過程中一種主要的雄激素形式。在綿羊顆粒細(xì)胞上的研究發(fā)現(xiàn)，在DHT生理濃度范圍內(nèi)，隨著DHT濃度逐漸升高，AR表達(dá)也逐漸增強(qiáng)[12]；基于小鼠多囊卵巢綜合征(PCOS)模型的研究也表明，經(jīng)由DHT誘導(dǎo)的PCOS模型小鼠卵泡發(fā)育受損[7]。本研究結(jié)果表明，10-7mol/L DHT+ 10-6mol/L Flutamide聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞的數(shù)量和AMH蛋白含量均顯著低于10-7mol/L DHT組，10-5mol/L DHT+10-8mol/L 11-ketodihydrotestosterone聯(lián)合處理組顆粒細(xì)胞數(shù)量和AMH蛋白含量均顯著高于10-5mol/L DHT組，說明AR抑制劑能夠抑制10-7mol/L DHT對顆粒細(xì)胞增殖和AMH表達(dá)的促進(jìn)作用，AR激動劑能夠抵消10-5mol/L DHT對顆粒細(xì)胞增殖和AMH表達(dá)的抑制作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，10-7mol/L DHT促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠卵泡顆粒細(xì)胞的增殖及AMH的表達(dá)，10-5mol/L DHT抑制細(xì)胞增殖及AMH的表達(dá)；AR抑制劑可抑制10-7mol/L DHT的促進(jìn)作用，AR激動劑可抵消10-5mol/L DHT的抑制作用。說明AR介導(dǎo)了DHT調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖和AMH的表達(dá)。