香豬CHD3基因3′-側(cè)翼區(qū)264 bp結(jié)構(gòu)變異的研究

黃月麗，冉雪琴，牛 熙，李 升，黃世會(huì)，王嘉福

(1.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽550025)

香豬屬于原始的地方豬種，主要生長于中國西南部分山區(qū)，因其雙月斷奶的仔豬宰食無乳腥味、開膛后腹腔不臭，故被稱為香豬[1]。香豬的體型矮小、短圓，在其面部形成“川”字或者菱形的褶皺紋路，普通香豬個(gè)體軀干皮膚平整，沒有褶皺，在長期養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)少量香豬軀干和四肢皮膚呈現(xiàn)明顯且密布的褶皺，通過皺皮表型個(gè)體交配繁殖的仔豬中，仍然存在部分皺皮個(gè)體，說明該褶皺表型可以遺傳[2]。皮膚是動(dòng)物體的第一道屏障，具有保護(hù)、體溫調(diào)節(jié)、免疫、代謝等多種生物學(xué)功能[3]，所以正常健康的皮膚顯得尤為重要。結(jié)構(gòu)變異是指在基因組中存在>50 bp核苷酸序列的突變，包括缺失、易位、串聯(lián)重復(fù)、插入和倒置[4]。在生物體中大部分結(jié)構(gòu)變異會(huì)導(dǎo)致疾病的形成。沙皮犬全身呈現(xiàn)非常明顯的皮膚褶皺，并且還會(huì)伴隨周期性發(fā)熱、透明質(zhì)酸沉積等癥狀，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在透明質(zhì)酸合成酶2(hyaluronan synthase 2，HAS2)基因的上游存在一段核苷酸序列不穩(wěn)定重復(fù)，該位點(diǎn)突變是導(dǎo)致沙皮犬出現(xiàn)上述現(xiàn)象的主要原因[5]。皺皮香豬皮膚上有大量凹凸起伏的褶皺，表皮層異常不均勻增生，皮膚中的膠原纖維和彈性纖維減少、斷裂、排列雜亂，皮膚彈性降低，并且被毛稀疏，與人類皮膚老化現(xiàn)象相似；皺皮香豬皮膚排泄功能受阻，凹陷處皮膚容易被寄生蟲和真菌感染，引起皮膚炎癥，同時(shí)皺皮香豬皮下脂肪層變薄，個(gè)體生長緩慢，在屠宰時(shí)被毛除不盡[6-7]。

染色質(zhì)調(diào)節(jié)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白3(chromodomain-helicase-DNA-binding protein 3，CHD3)屬于ATP依賴性染色質(zhì)調(diào)節(jié)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白(CHD)家族之一，該家族包括9個(gè)成員，分為3個(gè)亞家族，CHD3、CHD4、CHD5屬于第二亞家族(CHDII)[8]。CHD3也被稱為Mi-2α，在皮肌炎患者中作為自身抗原被發(fā)現(xiàn)，隨著皮肌炎的惡化，往往也會(huì)有其他并發(fā)癥出現(xiàn)，主要是增加典型皮疹伴壞死性肌炎和惡行腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。已有研究表明，CHD3是核小體重塑與去乙?；?nucleosome remodeling and deacetylation，NuRD)復(fù)合物的核心酶亞基[11]，該復(fù)合物利用CHD蛋白ATP水解產(chǎn)生的能量行使功能，廣泛參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、細(xì)胞發(fā)育等重要的生物學(xué)過程[12-13]。在生物體生長發(fā)育過程中，CHD3基因具有重要的作用，Snijders等[14]報(bào)道CHD3基因突變與智力殘疾、大頭畸形、語言障礙等綜合征相關(guān)；CHD3基因的突變也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常、關(guān)節(jié)松弛、面部粗糙等疾病[15]；CHD3通過C-端與ETs相關(guān)分子(ETs related molecular, ERM)相互作用，調(diào)控早老素蛋白1(presenilin 1)的表達(dá)[16]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在具有全身性皺皮的香豬CHD3基因中，3′-側(cè)翼區(qū)存在一段264 bp核苷酸插入/缺失結(jié)構(gòu)變異[6]，為了探究CHD3基因3′-側(cè)翼區(qū)264 bp結(jié)構(gòu)變異對基因表達(dá)的影響，本試驗(yàn)以普通香豬、皺皮香豬和大白豬為研究對象，采用生物信息學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting等方法探究該結(jié)構(gòu)變異的結(jié)構(gòu)特征、遺傳多樣性以及對表達(dá)的影響，解析與香豬皺皮性狀的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品

150頭普通香豬(XP)和30頭皺皮香豬(XPZ)皮膚組織均采自貴州大山地生態(tài)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司豬場，147頭大白豬(LW)的皮膚組織采自貴州畢節(jié)市順豐養(yǎng)殖場。

1.2 主要試劑及儀器

血液/組織基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司；pGEM-T Easy Vector購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；皮膚組織總蛋白提取試劑盒(SA-01-SK)購自萊恩生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)、極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(P0018FS)、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(P0012AC)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Anti-CHD3抗體(ab134125)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab205718)均購自Abcam公司；內(nèi)參Anti-GAPDH抗體(AF7021)購自Affinity Biosciences公司；電泳儀(DYY-6C)購自北京六一生物科技有限公司；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiScope 6000)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀(T100)、定量PCR儀(CFX96)均購自Bio-Rad公司。

1.3 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異片段生物信息學(xué)分析

運(yùn)用miRBase在線軟件下載豬對應(yīng)的miRNA數(shù)據(jù)庫，用miRanda軟件預(yù)測CHD3基因結(jié)構(gòu)變異片段所能結(jié)合的miRNA，設(shè)置結(jié)合的臨界分?jǐn)?shù)(Score≥120)和自由能(Energy≤―20 kJ/mol)，分?jǐn)?shù)越大，自由能越小，miRNA與mRNA結(jié)合能力越強(qiáng)；通過在線數(shù)據(jù)庫RBPsuite對結(jié)構(gòu)變異區(qū)域的RNA結(jié)合蛋白(RBP)進(jìn)行分析，分?jǐn)?shù)范圍0～1，當(dāng)分?jǐn)?shù)>0.5時(shí)表示結(jié)合能力較強(qiáng)；利用UCSC Genome Browser Gateway軟件分析重復(fù)元件(TEs)。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中豬CHD3基因序列(登錄號(hào)：NC_010454.4)，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)的特異性引物和檢測mRNA表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物信息見表1。引物均由英濰捷(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 PCR擴(kuò)增及基因分型

按照DNA提取試劑盒說明書提取所采集的普通香豬、皺皮香豬、大白豬皮膚組織的基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組的完整性，檢測合格的DNA分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以皺皮香豬和普通香豬基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增體系20 μL：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，基因組DNA 1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 8.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取適量PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收后由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

1.6 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異群體分布頻率檢測

以3個(gè)豬群的基因組DNA為模板，采用PCR方法對每一個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增，然后使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并記錄CHD3基因結(jié)構(gòu)變異在3個(gè)豬群體中的存在情況；用Excel 2019計(jì)算CHD3基因結(jié)構(gòu)變異基因型頻率和等位基因頻率，用SPSS 22.0軟件中的χ2檢驗(yàn)分析CHD3基因結(jié)構(gòu)變異是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CHD3基因表達(dá)量

根據(jù)Trizol法分別提取香豬3種基因型皮膚總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以18S rRNA為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CHD3基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系10 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，2×SYBR Green Supper Mix 5 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。熔解曲線：從65 ℃升高到95 ℃，以0.5 ℃/5 s速率上升。采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

1.8 CHD3蛋白表達(dá)量檢測

根據(jù)蛋白提取試劑盒說明分別提取香豬3種基因型皮膚總蛋白，按BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明測定蛋白濃度；進(jìn)行SDS-PAGE，將蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉1 h，與Anti-CHD3(1∶4 000)、Anti-GAPDH(1∶4 000)在4 ℃孵育過夜，然后與HRP標(biāo)記的山羊抗免IgG(1∶4 000)在常溫孵育2 h，使用極超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測并拍照保存。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用ImageJ 1.8.0軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，用GraphPad Prism 8.0對實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Tukey法進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2．1 生物信息學(xué)分析

2．1．1CHD3基因結(jié)構(gòu)變異區(qū)域miRNA結(jié)合位點(diǎn)分析 利用miRBase和miRanda軟件預(yù)測miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示在CHD3基因結(jié)構(gòu)變異片段上，分?jǐn)?shù)≥120，且自由能≤-20 kJ/mol的miRNA，共35個(gè)(表2)。

表2 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異區(qū)域miRNA結(jié)合位點(diǎn)

續(xù)表

2.1.2CHD3基因結(jié)構(gòu)變異區(qū)域RBP結(jié)合位點(diǎn)分析 利用RBPsuite軟件對RNA結(jié)合蛋白(RBP)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，當(dāng)分?jǐn)?shù)≥0.5，共有10個(gè)RBPs能結(jié)合到CHD3基因結(jié)構(gòu)變異片段上，且鋅指RNA結(jié)合域蛋白2(ZRANB2)和肉瘤融合蛋白(FUS)這2個(gè)RBPs在結(jié)構(gòu)變異片段上分別有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(表3)。

表3 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異區(qū)域RBP結(jié)合位點(diǎn)

續(xù)表

2.1.3CHD3基因結(jié)構(gòu)變異片段的重復(fù)元件分析 利用UCSC Genome Browser Gateway軟件對CHD3基因序列進(jìn)行重復(fù)元件分析，結(jié)果顯示，在CHD3基因結(jié)構(gòu)變異區(qū)間存在1個(gè)254 bp的短散在元件(short interspersed element, SINE)，屬于tRNA家族，位于Chr12：53 115 742-53 115 995。

2.1.4CHD3基因結(jié)構(gòu)變異分析 根據(jù)CHD3基因結(jié)構(gòu)變異上的SINE元件位置和miRNA、RBP結(jié)合的位置，對其做了一個(gè)示意圖(圖1)，從圖1中可以清晰地看出擴(kuò)增CHD3基因結(jié)構(gòu)變異的上、下游引物位置、結(jié)構(gòu)變異序列、SINE元件位置，同時(shí)還分別列舉了3個(gè)miRNA和3個(gè)RBP在結(jié)構(gòu)變異序列上的結(jié)合位置，miRNA依次是miR-7137-5p、miR-676-5p、miR-9806-5p，RBP依次是RBFOX2、FXR2、IGF2BP1；箭頭所指是CHD3基因結(jié)構(gòu)變異序列插入/缺失的位點(diǎn)(圖1)。

①波浪下劃線標(biāo)出的是引物序列，灰色背景標(biāo)出的是CHD3基因結(jié)構(gòu)變異序列(染色體位置Chr12:53 115 726-53 115 989)，直線加粗下劃線標(biāo)出的是SINE元件(染色體位置Chr12:53 115 742-53 115 995)；直角矩形框內(nèi)是列舉的3個(gè)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)，圓角矩形框內(nèi)是列舉的3個(gè)RBPs結(jié)合位點(diǎn)。②箭頭所指為CHD3基因結(jié)構(gòu)變異序列插入/缺失位點(diǎn)①Wavy underline is primer sequence, gray background is CHD3 gene structural variation sequence (chromosome position Chr12: 53 115 726-53 115 989), bold line underline is SINE element (chromosome position Chr12: 53 115 742-53 115 995); Three miRNA binding sites are listed in the rectangular box, and three RBP binding sites are listed in the rounded rectangular box. ②The arrow indicates the insertion/deletion site of structural variation sequence of CHD3 gene圖1 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of structural variation analysis of CHD3 gene

2.2 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異片段的檢測

為了驗(yàn)證CHD3基因結(jié)構(gòu)變異是否真實(shí)存在，以普通香豬和皺皮香豬基因組DNA為PCR擴(kuò)增的模板，擴(kuò)增出177和441 bp 2條條帶(圖2)，將2條帶分別膠回收并進(jìn)行測序，測序結(jié)果與預(yù)期大小一致；將2個(gè)條帶的DNA序列比對到豬的參考基因組(Scrofa11.1)，結(jié)果顯示與參考基因組序列相似性為99.5%。將大片段(441 bp)定義為I等位基因(插入型)，將發(fā)生缺失結(jié)構(gòu)變異的片段(177 bp)定義為D等位基因(缺失型)。

①1～5，皺皮香豬；6～9，普通香豬。②M，DL2000 DNA Marker；1，DD型；4，ID型；2、3、5～9，II型①1-5, Xiang pigs with wrinkle skin; 6-9, Ordinary Xiang pigs. ②M，DL2000 DNA Marker；1，DD genotype；4，ID genotype；2, 3, 5-9，II genotype圖2 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)的PCR檢測Fig.2 PCR detection of CHD3 gene structural variation sites

2．3 CHD3基因結(jié)構(gòu)變異群體分布頻率檢測

利用PCR的方法檢測CHD3基因的分布情況，在3個(gè)豬群體中都檢測到了3種基因型(DD型、ID型、II型)；皺皮香豬、普通香豬、大白豬的D等位基因頻率分別是30.0%、6.7%、4.8%，皺皮香豬D等位基因頻率極顯著高于普通香豬、大白豬(P<0.01)，普通香豬D等位基因頻率顯著高于大白豬(P<0.05)(表4)。

Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CHD3基因結(jié)構(gòu)變異在皺皮香豬和普通香豬中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，在大白豬中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P<0.05)(表4)。

表4 豬群中CHD3基因結(jié)構(gòu)變異的頻率分布

2．4 CHD3基因的表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測香豬皮膚中CHD3基因mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示DD基因型和ID基因型均極顯著高于II基因型(P<0.01)，DD基因型的mRNA表達(dá)量高于ID基因型，但是差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

**，差異極顯著(P<0.01);無*，差異不顯著(P>0.05)。下同**，Extremely significant difference (P<0.01);No *,No significant difference (P>0.05). The same as below圖3 不同基因型香豬CHD3基因相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of CHD3 gene in Xiang pigs of different genotypes

Western blotting檢測香豬皮膚中CHD3蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示DD基因型和ID基因型蛋白表達(dá)量均極顯著高于II基因型(P<0.01)，DD基因型蛋白表達(dá)量高于ID基因型，差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

1～3，香豬II基因型；4、5，香豬ID基因型；6～8，香豬DD基因型1-3, Genotypes II of Xiang pigs; 4 and 5, Genotypes ID of Xiang pigs; 6-8, Genotypes DD of Xiang pigs圖4 不同基因型香豬CHD3蛋白表達(dá)水平Fig.4 Expression of CHD3 protein in Xiang pigs of different genotypes

3 討 論

CHD3蛋白是皮肌炎患者中的自身抗原，皮肌炎主要表現(xiàn)為皮膚損傷和肌肉無力。有研究證明，在皮肌炎患者中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)被大量降解[17]，細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分包括膠原蛋白和彈性蛋白，它們的主要作用是維持皮膚、器官、組織的形狀，使其不易變形，皮膚中ECM的減少是皺紋形成的重要原因[18]。研究發(fā)現(xiàn)，CHD4通過調(diào)控纖溶酶的活性，對ECM的水解產(chǎn)生影響[19]，CHD3和CHD4的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列高度相似[20]，推測具有相似的調(diào)控功能。核小體重塑和脫乙酰酶(NuRD)復(fù)合物是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的主要染色質(zhì)重塑復(fù)合物之一，它在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、基因組完整性和細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要作用，通過其對這些基本細(xì)胞過程的影響，越來越多的證據(jù)表明，這種大分子復(fù)合物活性的改變可導(dǎo)致發(fā)育缺陷、癌癥和加速衰老[21-23]。NuRD含有多種組分，包括CHD3(或CHD4)以及HDAC1/2、MTA2/3和MBD2/3等多種阻遏因子，CHD3、CHD4是NuRD復(fù)合體的活性亞單位(核小體重塑和脫乙酰酶活性)，這些蛋白質(zhì)形成不同的CHD3和CHD4-NuRD復(fù)合物，它們不僅能抑制特定靶基因的基因轉(zhuǎn)錄，還可以激活特定靶基因的基因轉(zhuǎn)錄[20]。之前的研究表明，在香豬中CHD3基因的3′-側(cè)翼區(qū)具有一段264 bp核苷酸插入/缺失結(jié)構(gòu)變異[6]。為了證實(shí)豬群體中存在的這一結(jié)構(gòu)變異，檢測了2個(gè)豬品種3個(gè)群體中264 bp結(jié)構(gòu)變異的基因型，包括普通香豬、皺皮香豬和大白豬。結(jié)果表明，CHD3基因的264 bp結(jié)構(gòu)變異多態(tài)性在香豬和大白豬中普遍存在，并且在皺皮香豬、普通香豬、大白豬中的基因型頻率不同。I等位基因頻率為大白豬>普通香豬>皺皮香豬，而D等位基因頻率是皺皮香豬>普通香豬>大白豬。CHD3基因3′-端264 bp結(jié)構(gòu)變異在皺皮香豬和普通香豬中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在大白豬中處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)，表明這一結(jié)構(gòu)變異在香豬群體中是隨機(jī)變異，而大白豬中不是隨機(jī)的，而是高度人工選擇的結(jié)果。

生物信息學(xué)分析顯示，CHD3基因264 bp插入/缺失結(jié)構(gòu)變異位于該基因的3′-側(cè)翼區(qū)(mRNA的3′-UTR)，屬于tRNA家族的SINE元件，該元件序列含有35個(gè)miRNAs結(jié)合位點(diǎn)、10個(gè)RBPs結(jié)合位點(diǎn)。SINE是由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的真核非自主逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[24]，并可逆轉(zhuǎn)錄成DNA插入基因組中的新位點(diǎn)，約占哺乳動(dòng)物基因組的10%，因此，它們在基因組的結(jié)構(gòu)組織、生物過程的協(xié)調(diào)乃至物種的多樣性和進(jìn)化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[25]。SINE可以影響mRNA從細(xì)胞核的輸出、mRNA翻譯以及mRNA的衰變[26]；當(dāng)SINE在3′-UTR中存在時(shí)，它可以通過Staufen蛋白介導(dǎo)mRNA衰變，從而使mRNA降解[27]，Staufen蛋白屬于雙鏈RNA結(jié)合蛋白家族，有2個(gè)同源蛋白，即Staufen1和Staufen2，Staufen2可以與mRNA的3′-UTR區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)mRNA降解[28]。miRNA是基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的重要分子，通常與mRNA的3′-UTR區(qū)結(jié)合來抑制mRNA翻譯或者促使mRNA降解[29]。本研究結(jié)果顯示，CHD3基因中D等位基因的存在導(dǎo)致該基因表達(dá)增強(qiáng)，蛋白豐度增加，I等位基因的表達(dá)低于D等位基因，推測I等位基因由于SINE元件的存在，通過RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)CHD3基因的mRNA穩(wěn)定性，誘導(dǎo)mRNA降解，而miRNA進(jìn)一步抑制CHD3基因的mRNA翻譯，從而導(dǎo)致含有SINE元件的CHD3基因的mRNA和蛋白表達(dá)均低于缺失SINE元件的CHD3基因。由于D等位基因缺失SINE元件，miRNA和RBP失去了對基因表達(dá)調(diào)控的功能，使CHD3基因表達(dá)上調(diào)。

在ATM介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)研究中發(fā)現(xiàn)，CHD3蛋白的一個(gè)亞型CHD3.1通過其C-端與KAP-1相互作用維持染色質(zhì)壓縮狀態(tài)[30-31]，阻礙DNA損傷修復(fù)，通過ATM依賴性KAP-1磷酸化后(pS824-KAP-1)，消除了CHD3和KAP-1的相互作用，CHD3蛋白從染色質(zhì)上釋放，異染色質(zhì)逐漸松弛，損傷修復(fù)才得以進(jìn)行[32]。同時(shí)，在ATM-KAP-1信號(hào)通路介導(dǎo)的染色質(zhì)修復(fù)過程中CHD3具有一定的阻礙作用[33]。在小鼠早衰模型研究中，當(dāng)ATM-KAP-1信號(hào)通路異常，會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的衰老，加速小鼠的早衰[34-35]。由以上推測CHD3基因的異常表達(dá)可能會(huì)間接導(dǎo)致動(dòng)物衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，香豬皮膚組織中，CHD3基因和蛋白的表達(dá)量均為DD基因型>ID基因型>II基因型，表明該結(jié)構(gòu)變異促使CHD3基因表達(dá)量上調(diào)，該基因的表達(dá)上調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致NuRD功能或者ATM-KAP-1信號(hào)通路的異常，影響相關(guān)靶基因的乙?；剑璧K損傷位點(diǎn)修復(fù)和染色質(zhì)重塑，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞的衰老。同時(shí)等位基因頻率結(jié)果顯示，皺皮香豬中CHD3基因結(jié)構(gòu)變異D等位基因頻率極顯著高于普通香豬和大白豬。由以上論述推測CHD3基因結(jié)構(gòu)變異可能與香豬皺皮形成有關(guān)。

4 結(jié) 論

豬CHD3基因的3′-側(cè)翼區(qū)264 bp插入/缺失結(jié)構(gòu)變異在香豬和大白豬中呈現(xiàn)多態(tài)性，皺皮香豬的D等位基因頻率大于普通香豬和大白豬，該結(jié)構(gòu)變異屬于tRNA家族的SINE元件，含35個(gè)miRNAs和10個(gè)RBPs結(jié)合位點(diǎn)，參與CHD3基因的表達(dá)調(diào)控，皺皮香豬CHD3基因中該元件的缺失，導(dǎo)致CHD3基因的異常表達(dá)和積累，可能是香豬皺皮形成的重要因素之一。