用于卵巢癌化療-光熱聯(lián)合治療的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子

劉樹威，晉 皓，尹萬忠，張 皓

（1.吉林大學第一醫(yī)院光功能診療醫(yī)學化學聯(lián)合實驗室,長春 130021；2.吉林大學白求恩第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,長春 130021）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一［1］. 其中，上皮性卵巢癌的死亡率占據(jù)各類婦科腫瘤的首位［2］. 卵巢癌早期無明顯臨床癥狀，難以發(fā)現(xiàn)，并且容易浸潤和轉移，對女性生命健康造成了嚴重威脅［3］. 目前的臨床治療中，手術輔以術后化療是上皮性卵巢癌的標準治療方案［4］.

化療是化學藥物治療的簡稱，是利用化學藥物阻止癌細胞的增殖、浸潤及轉移，并殺滅癌細胞的一種治療方式，是當前癌癥治療的重要手段［5，6］. 以對卵巢癌有較好療效的嘧啶類抗腫瘤藥物吉西他濱為例，其作用機制主要包括兩方面：一是作用于細胞的有絲分裂，阻止G1期向S期的進展；二是抑制核苷酸還原酶，導致細胞內脫氧核苷三磷酸酯減少，降低細胞內代謝產(chǎn)物的降解，進而達到抗腫瘤的目的［7］. 但化療也存在明顯的缺點，在對晚期腫瘤和已擴散腫瘤的全身化療中，吉西他濱的副作用十分明顯，主要是骨髓抑制、血小板減少、白細胞下降，也可引起便秘、腹瀉、口腔炎等消化系統(tǒng)的反應，還可以引起發(fā)燒、頭痛、乏力及厭食，甚至會導致肝腎等主要器官的損傷［8］. 此外，長期化療誘發(fā)的多藥耐藥會嚴重降低化療效果. 通過調整化療藥物種類、提高給藥劑量和給藥頻率等來克服多藥耐藥的方法不僅不能保證療效，還極容易加劇對正常組織的毒性［9，10］. 因此，提高化療藥物的生物利用率、降低對正常組織的毒副作用具有重要的研究意義.

納米材料能夠通過高滲透長滯留（EPR）效應向腫瘤中富集，使用納米載體對化療藥物進行負載，就能實現(xiàn)化療藥物的高效遞送；再利用納米載體在腫瘤微環(huán)境過表達的某些物質或外界刺激下的形貌或結構變化，實現(xiàn)化療藥物的可控釋放，是解決上述問題的新思路［11，12］. 理想的納米載體需要具備以下幾個條件：無毒或低毒、高藥物負載率、較高的穩(wěn)定性和藥物的可控釋放等［13］. 這對納米載體的設計提出了更高的要求，尤其是需要載體本身兼具某些診療功能. 例如，以聚苯胺、聚多巴胺、聚吡咯等為主體的聚合物納米載體具有優(yōu)良的光熱轉化性能，能夠將所吸收的近紅外光轉化為熱能，起到腫瘤光熱治療的作用［14～16］. 此外，光熱效應還能夠促進化療藥物的釋放、激發(fā)機體免疫等，為發(fā)展光熱介導下的腫瘤治療新方法提供了機會［17～19］.

基于上述背景，本文設計了一種負載化療藥物吉西他濱的聚吡咯納米粒子，該納米粒子具有化療/光熱聯(lián)合治療上皮性卵巢癌的功效. 通過鐵離子誘發(fā)的氧化聚合，吡咯單體聚合生成聚吡咯納米粒子，其生物毒性極低［20，21］. 聚吡咯納米粒子對吉西他濱具有較強的負載能力，載藥率為13.7%，包封率為15.9%，藥物負載前后納米粒子均具有良好的膠體穩(wěn)定性，不會出現(xiàn)聚沉等現(xiàn)象. 在波長808 nm的近紅外激光照射下，吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子溶液快速升溫. 因癌細胞的熱耐受性差，當體系溫度升至42 ℃以上時，就產(chǎn)生了光熱治療的作用. 同時，熱刺激導致吉西他濱在腫瘤組織中快速釋放，產(chǎn)生光熱介導的化療作用，避免了全身毒性. 在卵巢癌動物模型治療實驗中，吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子展現(xiàn)了良好的聯(lián)合治療潛力.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

吡咯，99%，國藥集團化學試劑有限公司；六水合三氯化鐵，98%，阿拉丁試劑（上海）有限公司；透析袋，截留分子量5000，湖南翊博生物科技有限公司；碳支持膜銅網(wǎng)（T11023型，300目），北京新興百瑞技術有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（高糖），美國Gibco 公司；結晶紫染色液和磷酸鹽（PBS）緩沖液（pH值為7.2～7.4），上海碧云天生物技術有限公司；胎牛血清（特級），美國Gemini 公司；鹽酸吉西他濱（標準品）、CCK-8 試劑盒和胰蛋白酶消化液（質量分數(shù)0.25%），北京索萊寶科技有限公司；裸鼠Balb/c-nu，北京維通利華實驗動物技術有限公司.

H-800 型透射電子顯微鏡（TEM），日本Hitachi 公司；Empyrean 型X 射線衍射儀（XRD），荷蘭PANalytical 公司；ESCALAB 250 型X 射線光電子能譜儀（XPS），美國Thermo 公司；Zetasizer NanoZS 型納米粒度儀，英國Malvern 公司；UV-2600 型紫外-可見-近紅外（UV-Vis-NIR）分光光度計，日本Shimadzu公司；LEO-808型光纖激光器，深圳理歐光電科技有限公司；PYXE-80IR型孵箱，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；RT-6000型酶標儀，深圳雷杜生命科學股份有限公司；EOS M50型數(shù)碼相機，日本Canon公司；Ti27型紅外熱像儀，美國Fluke公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 聚吡咯納米粒子的制備與表征 預先配制濃度為1 mmol/L的吡咯水溶液和濃度為100 mmol/L的六水合三氯化鐵水溶液. 將100 mL 吡咯水溶液轉移至錐形瓶并置于冰水浴中，在磁力攪拌下（400 r/min）加入1 mL 六水合三氯化鐵水溶液；在冰水浴中繼續(xù)攪拌12 h，得到聚吡咯納米粒子；將該納米粒子溶液置于透析袋內，并浸于去離子水中透析24 h，每4 h換一次水，除去未反應的吡咯單體和六水合三氯化鐵，透析袋內的產(chǎn)物即為提純后的聚吡咯納米粒子.

將聚吡咯納米粒子水溶液滴在碳支持膜銅網(wǎng)上，通過透射電子顯微鏡觀察產(chǎn)物的形貌. 測定聚吡咯納米粒子水溶液的濃度. 通過凍干得到聚吡咯納米粒子粉末，進行XRD和XPS測試. 配制聚吡咯納米粒子稀溶液，進行Zeta電勢測試.

1.2.2 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的制備與表征 預先配制濃度為2 mg/mL的聚吡咯納米粒子水溶液和濃度為2 mg/mL 的鹽酸吉西他濱水溶液. 將5 mL聚吡咯納米粒子水溶液與5 mL鹽酸吉西他濱水溶液混合，在室溫下攪拌24 h；離心后收集沉淀，得到吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子. 測定不同濃度（2.5，5，7.5，10，15和20 μg/mL）的鹽酸吉西他濱水溶液的UV吸收光譜，繪制紫外吸收值對吉西他濱濃度的標準曲線，根據(jù)離心后上清液的紫外吸收值，計算吉西他濱的載藥率和包封率.

將吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子水溶液滴在碳支持膜銅網(wǎng)上，通過透射電子顯微鏡觀察產(chǎn)物的形貌. 利用分光光度計測定產(chǎn)物在近紅外光區(qū)的吸收. 測定吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子水溶液的濃度.

1.2.3 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的光熱性能 配制6 mL濃度為100 μg/mL的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子水溶液，并平均分為3 組，施加15 min 功率密度分別為1，2 和3 W/cm2的808 nm 近紅外激光，通過熱電偶溫度計監(jiān)測復合納米粒子水溶液的溫度變化. 配制6 mL濃度為200 μg/mL的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子水溶液，以相同的實驗方法，通過熱電偶溫度計監(jiān)測復合納米粒子水溶液的溫度變化. 配制2 mL濃度為100 μg/mL的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子水溶液，施加功率密度為3 W/cm2的808 nm近紅外激光，當溶液溫度不再升高后停止激光照射，通過熱電偶溫度計監(jiān)測復合納米粒子水溶液升溫和降溫過程中的溫度變化，計算光熱轉化效率.

1.2.4 升溫導致的藥物釋放 配制濃度為100 μg/mL的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子水溶液，并平均分為兩組；一組在45 min和105 min時分別施加15 min功率密度為3 W/cm2的808 nm近紅外激光，另一組不施加近紅外激光；在1 h和2 h后分別測定兩組溶液中吉西他濱的釋放率.

1.2.5 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子對卵巢癌細胞的治療效果 以人腸系膜下腔動脈血管內皮細胞（Ealy926）作為正常細胞研究對象，以人上皮性卵巢癌細胞（A2780）作為卵巢癌細胞研究對象. 將Ealy926 細胞以5×103cell/孔的密度接種在96 孔板中，置于孵箱中培養(yǎng)［37 ℃，5%（體積分數(shù)）CO2］.24 h后，與濃度分別為0，25，50，100，150和200 μg/mL的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子共培養(yǎng). 24 h后，向每孔中分別加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h后，使用酶標儀測試450 nm處的光密度值，進而計算Ealy926細胞的相對存活率，考察吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子對正常細胞的毒性. 以相同的實驗方法考察吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子對人卵巢癌細胞（A2780）的毒性.

將A2780 細胞以5×103cell/孔的密度接種在96 孔板中，置于孵箱中培養(yǎng)［37 ℃，5%（體積分數(shù)）CO2］. 24 h后，與濃度為100 μg/mL的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子共培養(yǎng). 2 h后，施加15 min功率密度分別為0，1，2和3 W/cm2的808 nm近紅外激光. 24 h后，以CCK-8染色法測試并計算A2780細胞的相對存活率，考察吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的治療效果.

將A2780 細胞以2×105cell/孔的密度接種在6 孔板中，置于孵箱中培養(yǎng)［37 ℃，5%（體積分數(shù)）CO2］. 24 h 后，與濃度分別為0，50，100 和200 μg/mL 的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子共培養(yǎng). 2 h后，施加15 min功率密度為3 W/cm2的808 nm近紅外激光. 孵育2 h后，將各組中的細胞消化計數(shù)，再以500 cell/孔的密度接種在新的6孔板中，置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)［37 ℃，5%（體積分數(shù)）CO2］. 待孔板中出現(xiàn)含有50個以上細胞的細胞集落時，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液. 用PBS洗滌2次，向每孔中加入1 mL質量分數(shù)為4%的多聚甲醛，于4 ℃冰箱中固定細胞1 h，用PBS洗滌一次，再向每孔中加入1 mL結晶紫染液，用去離子水洗滌3次，晾干后使用數(shù)碼相機進行拍照，并在顯微鏡下統(tǒng)計細胞集落的相對數(shù)目，考察吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的治療效果.

1.2.6 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子在動物腫瘤模型中的升溫能力 本文所涉及動物實驗方案通過了吉林大學第一醫(yī)院動物倫理委員會的審查，所有實驗均嚴格按照操作規(guī)范進行. 將1×106個A2780細胞分散在無血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中獲得細胞懸液，皮下注射至裸鼠右后臀部，待腫瘤體積生長至200 mm3左右時，將200 μg吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子分散于40 μL生理鹽水中，經(jīng)尾靜脈注射至裸鼠體內. 24 h后，向腫瘤部位施加功率密度為1 W/cm2的近紅外激光，通過紅外熱像儀監(jiān)測腫瘤溫度隨時間的變化.

2 結果與討論

2.1 聚吡咯納米粒子的制備和表征

圖1（A）為聚吡咯納米粒子的TEM 照片. 聚吡咯納米粒子展現(xiàn)了尺寸均一的球形形貌，平均直徑約為59.6 nm. 圖1（B）為聚吡咯納米粒子的XRD譜圖. 聚吡咯納米粒子的結晶性很差，譜圖中沒有高強度的特征峰，在32°和37°左右的低強度特征峰來自納米粒子中摻雜的少量鐵復合物. 圖1（C）為聚吡咯納米粒子的XPS譜圖. 根據(jù)譜圖中特征峰所在位置對應的結合能數(shù)值可知，納米粒子中存在鐵和氮的配位，所以鐵復合物的存在形式為鐵離子摻雜的聚吡咯. 鐵離子的摻雜通常會引起納米粒子Zeta電勢的升高，然而，圖1（D）中的Zeta電勢測試結果顯示聚吡咯納米粒子表面電勢為1.64 mV，僅帶少量的正電，這說明鐵離子的摻雜量較低，對Zeta電勢的影響較小.

Fig.1 TEM image(A),XRD pattern(B),XPS Fe2p spectrum(C)and zeta potential(D)of polypyrrole NPs

2.2 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的制備和表征

在制備的聚吡咯納米粒子中進一步負載化療藥物吉西他濱，能夠得到吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子. 圖2（A）給出了吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的TEM照片，其形貌和尺寸與藥物負載前基本保持一致，說明吉西他濱的負載并不會對復合納米粒子的形貌和尺寸產(chǎn)生影響. 圖2（B）給出了吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的可見-近紅外吸收光譜，其在808 nm處具有較強的吸收，表明復合納米粒子具有吸收近紅外光的能力，具有應用于光熱治療和光熱促進藥物釋放的潛力.

Fig.2 TEM image(A)and Vis?NIR absorption spectrum(B)of gemcitabine/polypyrrole composite NPs

圖3 （A）給出了不同濃度的鹽酸吉西他濱水溶液的紫外吸收光譜. 選取268.5 nm 處的吸光度值，繪制出的鹽酸吉西他濱吸光度值對濃度的標準曲線如圖3（B）所示. 通過測試載藥后上清液的吸光度值，計算得到上清液中鹽酸吉西他濱的濃度為0.841 mg/mL，進而計算得到吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子中吉西他濱的載藥率為13.7%，包封率為15.9%. 可見，聚吡咯納米粒子對吉西他濱具有較強的負載能力.

Fig.3 UV absorption spectra of gemcitabine hydrochloride at the concentrations of 2.5, 5, 7.5, 10, 15 and 20 μg/mL(A)and the standard absorption curve of gemcitabine versus concentration(B)

2.3 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的光熱性能

Fig.4 Temperature increment of gemcitabine/polypyrrole composite NPs solutions by altering the laser power density at 100 μg/mL(A)and 200 μg/mL(B)

因為吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子在近紅外光區(qū)具有較強吸收，本文進一步研究了其在808 nm激光照射下的光熱性能. 圖4（A）和（B）給出了復合納米粒子溶液的溫度隨照射時間變化的曲線. 隨著光照時間的延長，溶液溫度逐漸升高. 當固定濃度不變時，復合納米粒子溶液的溫度隨著激光功率的增加而升高，光熱轉化性能良好.

圖5給出3 W/cm2的激光功率密度下，濃度為100 μg/mL的復合納米粒子溶液的升溫-降溫曲線. 由圖5可以看出，在近紅外激光照射下，溶液的升溫能力很強. 以圖5中降溫過程的前20個點為研究對象，以時間為縱坐標，溫度增量與最大溫度增量比值的負對數(shù)（-lnθ）為橫坐標，得到圖6. 由擬合得到直線的斜率確定時間常數(shù)為344.3 s，進而計算得到吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的光熱轉化效率為35.3%. 上述結果表明該復合納米粒子是一種良好的光熱試劑，能夠發(fā)揮光熱治療的作用.

Fig.5 Real?time temperature of a heating?cooling cycle of gemcitabine/polypyrrole composite NPs solutionConcentration of composite NPs: 100 μg/mL; laser power density:3 W/cm2.

Fig.6 Time vs. -lnθ fitting plot of the cooling process of Fig.5

2.4 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的藥物釋放

考察了吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子中負載的吉西他濱的釋放. 在不同實驗處理后的不同時間點將復合納米粒子溶液離心，測試上清液在268.5 nm處的吸光度值，利用圖3（B）中給出的標準曲線計算得到藥物的釋放率. 在不施加808 nm激光的條件下，1 h后吉西他濱的釋放率為6.0%，2 h后增加到了9.3%. 近紅外激光能夠明顯加速吉西他濱的釋放，1 h后的釋放率就已經(jīng)高達24.2%，2 h后增加到52.7%. 這表明808 nm的激光照射能夠極大促進吉西他濱釋放，從而發(fā)揮更好的化療作用.

2.5 吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子協(xié)同治療卵巢癌

由圖7（A）可見，吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子對正常細胞Ealy926的毒性很低. 一方面，這說明吉西他濱在聚吡咯納米粒子中的負載比較穩(wěn)定，不易脫落，對降低化療藥物的毒副作用、提高利用率具有重要意義；另一方面，這也說明復合納米粒子本身具有較好的生物安全性. 圖7（B）示出了吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子對卵巢癌細胞A2780的毒性，細胞存活率受到的影響較小，說明復合納米粒子本身并不具有殺傷癌細胞的能力.

Fig.7 Relative cell viability of Ealy926 cells(A) and A2780 cells(B) after 24 h incubation with different concentrations of gemcitabine/polypyrrole composite NPs

圖8 示出了808 nm 激光照射下吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子對A2780 細胞的聯(lián)合治療效果. 可見，光熱治療和熱刺激的化療藥物釋放可以大幅度殺傷卵巢癌細胞，隨著激光功率密度的增加，A2780細胞的存活率逐漸降低.

圖9 為克隆形成實驗結果. 結晶紫染色照片及定量統(tǒng)計結果顯示，單純的808 nm激光照射不能引起溶液的明顯升溫，對A2780 細胞的增殖能力影響極低. 而吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子在近紅外光下的聯(lián)合治療作用能夠對細胞的增殖能力產(chǎn)生影響. 隨著復合納米粒子濃度的升高，A2780 細胞的增殖能力逐漸降低. 與濃度為200 μg/mL 的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子共培養(yǎng)，又經(jīng)過15 min功率密度為3 W/cm2的808 nm激光照射后，A2780細胞的增殖能力受到了極大的破壞，光熱治療/化療的聯(lián)合治療效果顯著.

Fig.8 Relative cell viability of A2780 cells after the treatment with 100 μg/mL gemcitabine/poly?pyrrole composite NPs and 808 nm laser of different power density**P＜0.01，***P＜0.001.

Fig.9 Crystal violet stained A2780 cells after the treatment with gemcitabine/polypyrrole composite NPs of different concentrations and 808 nm laser of 3 W/cm2(A—D) and the relative number of cell colony obtained by statistics(E)Concentration of composite NPs/(μg·mL-1):(A)0;(B)50;(C)100;(D)200.

Fig.10 Infrared thermal images of the mice treated with saline(A)and gemcitabine/polypyrrole composite NPs(B)under the irradiation of 808 nm laser at the power density of 1 W/cm2 after 0,2,4,8 and 16 min

進一步評估了吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子在動物體內的聯(lián)合治療潛力. 由圖10（A）可見，作為對照組，尾靜脈注射了生理鹽水的荷瘤裸鼠的腫瘤部位升溫速率很慢，并不足以實現(xiàn)光熱治療并誘發(fā)化療藥物的大量釋放，因此對腫瘤生長的影響十分有限. 由圖10（B）可見，尾靜脈注射了吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的荷瘤裸鼠的腫瘤部位升溫速率顯著提高，能夠在8 min左右就達到42 ℃. 在此基礎上持續(xù)施加光照，腫瘤溫度可以超過42 ℃并長時間保持，進而實現(xiàn)對卵巢癌模型的光熱治療；同時，熱刺激下吉西他濱的大量釋放還能夠發(fā)揮化療的作用. 因此，在動物體內，吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子仍然可以通過光熱治療/化療聯(lián)合治療卵巢癌.

3 結論

設計了一種具有化療/光熱聯(lián)合治療上皮性卵巢癌功效的吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子. 聚吡咯納米粒子通過鐵離子誘發(fā)吡咯單體氧化聚合的方法制備，對吉西他濱具有較強的負載能力，能夠極大降低吉西他濱的毒副作用、提升藥物利用率. 該復合納米粒子在近紅外光區(qū)具有較強的吸收，是一種良好的光熱試劑，其光熱轉化效率為35.3%. 因此，吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子可以用于光熱治療，利用癌細胞熱耐受性差的特點，發(fā)揮抗腫瘤作用. 另一方面，光熱升溫能夠刺激復合納米粒子釋放負載的吉西他濱，并通過化療抗腫瘤. 細胞實驗中，吉西他濱/聚吡咯復合納米粒子的光熱治療/化療聯(lián)合治療能夠有效殺傷卵巢癌A2780細胞，并抑制A2780細胞的增殖. 動物實驗中，復合納米粒子在808 nm激光下升溫效果顯著，展現(xiàn)出治療卵巢癌的潛力.

感謝吉林大學第一醫(yī)院腫瘤婦科趙本正博士、張夢文碩士提供A2780細胞.感謝吉林大學第一醫(yī)院實驗動物中心在動物實驗中提供的支持.