基于λ核酸外切酶輔助的級(jí)聯(lián)型銅離子熒光檢測(cè)體系的構(gòu)建

劉 陳,劉金權(quán),酈瑜杰,廖力夫,肖錫林*

(1.南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,湖南 衡陽(yáng)421001;2.南華大學(xué) 衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 典型環(huán)境污染與健康危害湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 衡陽(yáng)421001;3.南華大學(xué) 資源環(huán)境與安全工程學(xué)院,湖南 衡陽(yáng)421001)

0 引 言

銅作為人體必需的過(guò)渡重金屬之一，在人體的多種涉及金屬酶的基本生理過(guò)程中起著非常重要的作用[1-3]。但是，高濃度的銅離子(Cu2+)會(huì)對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟造成嚴(yán)重?fù)p傷[4-6]。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)便、靈敏的Cu2+監(jiān)測(cè)方法對(duì)人類(lèi)健康具有重要意義[7-9]。到目前為止，原子吸收光譜(atomic absorption spectroscopy,AAS)[10]、表面增強(qiáng)拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)[11]、電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[12]等傳統(tǒng)分析策略已成為高靈敏檢測(cè)Cu2+的最常用方法，但這些方法通常需要精密的儀器、繁瑣的樣品前處理和嚴(yán)格的操作環(huán)境等，這大大限制了他們的應(yīng)用范圍。因此，開(kāi)發(fā)一種靈敏、高選擇性且簡(jiǎn)便的用來(lái)檢測(cè)環(huán)境和生物樣品中Cu2+的高效方法顯得至關(guān)重要。

脫氧核酶(deoxyribozymes，DNAzymes)是一種通過(guò)體外篩選技術(shù)篩選出來(lái)的雙鏈功能核酸，且在某些作為輔助因子的金屬離子的存在下，具有高效的催化性能和結(jié)構(gòu)鑒定功能[13-15]。由于Breaker分離出的依賴(lài)于Cu2+的DNAzyme(Cu2+-DNAzyme)制備方法簡(jiǎn)單[16]，且在惡劣條件下具有良好的穩(wěn)定性，因此該Cu2+-DNAzyme被認(rèn)為是識(shí)別Cu2+的理想平臺(tái)[17-19]。此外，將其與熒光法[20-21]，電化學(xué)法[22-23]，比色法[24-25]等技術(shù)相結(jié)合，可以制備多種DNAzymes生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了對(duì)銅離子的高效檢測(cè)。其中，熒光DNAzymes生物傳感器因其操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)效果明顯且效果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)已得到廣泛應(yīng)用[26]。為了檢測(cè)更低濃度的Cu2+，高靈敏的熒光DNAzymes生物傳感器通常需要將作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增[27]。

等溫?cái)U(kuò)增策略是一種簡(jiǎn)單、高效的核酸序列擴(kuò)增技術(shù)[28-30]，它可以在恒溫條件下有效地?cái)U(kuò)增特定序列，并在DNAzymes生物傳感器中有效實(shí)現(xiàn)了信號(hào)擴(kuò)增[31-33]。目前，已有大量的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)被開(kāi)發(fā)，如基于核酸酶的信號(hào)擴(kuò)增[34-36]、滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)[37-39]和催化發(fā)夾自組裝(catalytic hairpin self-assembly,CHA)[40-42]等。其中，基于核酸酶的信號(hào)擴(kuò)增在DNAzymes生物傳感器中已得到了廣泛應(yīng)用[43-45]。作為常用核酸酶之一的λ核酸外切酶(λ exonuclease,λ-exo)，能夠催化雙鏈DNA分子從磷酸標(biāo)記的5′端至3′端方向逐步水解，將雙鏈DNA水解成單鏈DNA[46-48]。因此，λ-exo為靶循環(huán)擴(kuò)增提供了一個(gè)通用的檢測(cè)平臺(tái)[49-51]。此外，作為一種無(wú)酶等溫信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)，CHA能在觸發(fā)鏈DNA鏈的存在下，實(shí)現(xiàn)高特異性的靶標(biāo)循環(huán)擴(kuò)增[52-54]。

為實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度Cu2+的高效檢測(cè)，首次將上訴兩種信號(hào)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)用于級(jí)聯(lián)信號(hào)放大，設(shè)計(jì)了一種基于Cu2+-DNAzyme和級(jí)聯(lián)型雙循環(huán)信號(hào)放大策略的Cu2+熒光檢測(cè)體系。通過(guò)這種級(jí)聯(lián)信號(hào)放大策略且在某一低濃度Cu2+的范圍內(nèi)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與Cu2+的濃度成正比，在高靈敏、高選擇性的Cu2+檢測(cè)過(guò)程中體現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：Hitachi F-7000熒光光譜儀(日本日立公司)，PHS-3E型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，水浴鍋(江蘇常州金壇區(qū)西城新瑞儀器廠)，旋渦混合器XW-80A。

試劑：所有DNA片段均由通用生物(安徽)股份有限公司提供(序列見(jiàn)表1)，λ-exo(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)，硝酸銅(Cu(NO3)2,廣州化學(xué)試劑廠)、抗壞血酸(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、鹽酸(衡陽(yáng)開(kāi)心化學(xué)試劑有限公司)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，廣東汕頭新寧化工廠)、氯化鈉(NaCl，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、無(wú)水氯化鎂(MgCl2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)等均為分析純級(jí)別，實(shí)驗(yàn)用水為18.2 MΩ·cm的超純水。

表1 本研究用到的DNA序列

1.2 級(jí)聯(lián)型銅離子熒光檢測(cè)體系的構(gòu)建

1)試劑的準(zhǔn)備

Cu2+-DNAzyme溶液的制備:根據(jù)文獻(xiàn)[55]，將酶鏈DNA(E-DNA)和底物鏈DNA(S-DNA)分別溶于緩沖液A(50 mmol/L Na2HPO4,pH=7.4)中以制備各自的儲(chǔ)備液(10 μmol/L);然后，將等量的E-DNA溶液和S-DNA溶液混合，并在95 ℃下加熱10 min，隨后緩慢冷卻至室溫以形成穩(wěn)定的Cu2+-DNAzyme。

TQ-DNA溶液的制備：首先，將TDNA和QDNA分別溶于緩沖液B(25 mmol/L Tris-HCl,0.1 mol/L NaCl,15 mmol/L MgCl2，pH=7.4)中以制備各自的儲(chǔ)備液(10 μmol/L)；然后，將等量的TDNA溶液和QDNA溶液混合，并在95 ℃下加熱10 min，隨后緩慢冷卻至室溫以形成穩(wěn)定的TQ-DNA。

發(fā)夾DNA(H1/H2)溶液的制備：將發(fā)夾DNA(H1/H2)溶于緩沖液C(50 mmol/L Na2HPO4,0.5 mol/L NaCl,pH=7.4)中，然后在95 ℃下加熱10 min，隨后緩慢冷卻至室溫形成穩(wěn)定的發(fā)夾DNA。

2)銅離子的檢測(cè)

首先，取7.5 μL不同濃度的銅離子、2.5 μL抗壞血酸(5 mmol/L)和3 μL DNAzyme(5 μmol/L)與37 μL緩沖液A混合，并在室溫下反應(yīng)30 min；然后，取20 μL上述反應(yīng)液與6 μL TQ-DNA溶液混合，且在室溫下反應(yīng)30 min；此時(shí)，在該反應(yīng)液中加入3 μL λ-exo和46 μL λ-exo緩沖液，并且在37 ℃下反應(yīng)1 h；隨后，在上述酶切反應(yīng)液中加入3 μL H1、3 μL H2和219 μL緩沖液D(50 mmol/L Na2HPO4,1 mmol/L EDTA,pH=7.4)，且在37 ℃下反應(yīng)1 h。最后在室溫下立即測(cè)量樣品的熒光光譜圖。

1.3 熒光測(cè)定

熒光測(cè)量均使用光程為1 cm的比色皿。電壓設(shè)置為700 V，狹縫寬度設(shè)為5 nm×5 nm，掃描速度為1 200 nm/min。測(cè)定樣品溶液在485 nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度ΔF。每個(gè)樣品均平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理圖如圖1所示，實(shí)驗(yàn)體系包括5個(gè)部分：不加待測(cè)物Cu2+的檢測(cè)反應(yīng)、完整的檢測(cè)反應(yīng)、不加H2的檢測(cè)反應(yīng)、不加λ-exo的檢測(cè)反應(yīng)以及單獨(dú)的CHA部分。就完整的檢測(cè)反應(yīng)而言，首先，在待測(cè)物銅離子的存在下，Cu2+-DNAzyme被特異性切割，釋放出短的DNA片段tDNA。隨后，釋放出的tDNA與TQ-DNA在室溫下雜交，形成穩(wěn)定的可被λ-exo識(shí)別并切割的雙鏈DNA。由于λ-exo可作用于5′磷酸化的雙鏈TQ-DNA，并沿5′-3′方向漸進(jìn)性催化去除5′單核苷酸、破壞TQ-DNA結(jié)構(gòu)，同時(shí)釋放出tDNA和TDNA。游離的tDNA可被回收用于新一輪的DNA分子雜交反應(yīng)。此外，游離的TDNA作為輔助鏈觸發(fā)后續(xù)的催化發(fā)夾自組裝(CHA)反應(yīng)，生成H1/H2雙鏈產(chǎn)物并伴隨有強(qiáng)熒光信號(hào)，同時(shí)，TDNA被置換下來(lái)作為新一輪CHA的輔助鏈。上述基于雙循環(huán)的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大策略，能有效實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的放大，并且產(chǎn)生的熒光信號(hào)與Cu2+的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，可有效實(shí)現(xiàn)銅離子的定量分析檢測(cè)。

圖1 級(jí)聯(lián)型銅離子熒光檢測(cè)體系示意圖

2.2 可行性研究

不同條件下的熒光光譜表明，在無(wú)目標(biāo)物和有目標(biāo)物時(shí)，兩者的熒光強(qiáng)度具有明顯的變化(見(jiàn)圖2)。

圖2 不同反應(yīng)階段的熒光光譜

2.3 測(cè)定條件的優(yōu)化

2.3.1 CHA中錯(cuò)配堿基個(gè)數(shù)的優(yōu)化

在本實(shí)驗(yàn)中，作為熒光信號(hào)響應(yīng)的CHA部分決定了熒光信號(hào)輸出的靈敏度。故首先對(duì)CHA進(jìn)行了優(yōu)化。在CHA中，為了減少兩個(gè)發(fā)夾DNA因非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景信號(hào)，往往需要對(duì)其中一個(gè)發(fā)夾DNA的部分堿基進(jìn)行錯(cuò)配。本實(shí)驗(yàn)對(duì)參加CHA反應(yīng)的發(fā)夾DNA H2的部分堿基進(jìn)行了錯(cuò)配，并對(duì)其錯(cuò)配堿基數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化(如圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2的錯(cuò)配堿基數(shù)從0逐漸增加到3時(shí)，熒光輸出的信噪比呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，且在堿基錯(cuò)配數(shù)為1時(shí)達(dá)到最大值。故最終選擇堿基錯(cuò)配數(shù)為1的H2來(lái)降低CHA的背景信號(hào)。

圖3 H2堿基錯(cuò)配的數(shù)目對(duì)反應(yīng)催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)信噪比的影響

2.3.2 CHA反應(yīng)溫度的優(yōu)化

由于CHA反應(yīng)的溫度能影響其反應(yīng)中的背景信號(hào)大小，進(jìn)而影響級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系的靈敏度，因此本實(shí)驗(yàn)考察了CHA反應(yīng)溫度對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響(如圖4)。結(jié)果表明，隨著CHA反應(yīng)溫度的增加，CHA的信噪比逐漸增大，且在溫度為37 ℃時(shí)信噪比達(dá)到最大。故選擇37 ℃作為CHA反應(yīng)的最佳溫度。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)信噪比的影響

2.3.3 TQ-DNA退火緩沖液中鎂離子濃度的優(yōu)化

為了使酶切體系的背景信號(hào)盡可能小，通常需要使經(jīng)5′磷酸標(biāo)記的TQ-DNA雙鏈盡可能穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用含有不同濃度鎂離子的退火緩沖液對(duì)TQ-DNA雙鏈進(jìn)行退火處理，獲得了性能更穩(wěn)定的雙鏈DNA(見(jiàn)圖5)。結(jié)果表明，隨著退火緩沖液中鎂離子濃度的增加，酶切體系的信噪比逐漸增大，且當(dāng)退火緩沖液中的鎂離子濃度為15 mmol/L時(shí)，酶切體系的信噪比達(dá)到最大。

圖5 TQ-DNA退火緩沖液中鎂離子濃度對(duì)反應(yīng)信噪比的影響

2.3.4 λ-exo反應(yīng)溫度的優(yōu)化

溫度對(duì)酶切反應(yīng)背景信號(hào)的大小同樣起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)探究在不同溫度下酶切反應(yīng)的切割效果，確定了最佳的酶切反應(yīng)溫度。如圖6所示，隨著酶切反應(yīng)溫度的增加，反應(yīng)體系的信噪比逐漸增大，且在37 ℃時(shí)，酶切反應(yīng)的信噪比達(dá)到最大，此時(shí)的檢測(cè)性能最佳。故選擇37 ℃作為酶切反應(yīng)的最佳反應(yīng)溫度。

圖6 λ核酸外切酶的反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)信噪比的影響

3 結(jié) 論

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了一種用于超靈敏檢測(cè)Cu2+的級(jí)聯(lián)型熒光檢測(cè)體系。用熒光光譜法對(duì)該體系不同反應(yīng)階段進(jìn)行了表征?；讦?exo和CHA的級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系能有效地降低檢測(cè)體系的背景信號(hào)。此外，基于λ-exo與CHA的雙重靶循環(huán)信號(hào)擴(kuò)增能有效增加輸出的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可大大提高檢測(cè)體系的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該級(jí)聯(lián)型銅離子熒光檢測(cè)體系的構(gòu)建和性能已達(dá)到預(yù)期效果。其實(shí)際應(yīng)用還有待進(jìn)一步的研究。