葶藶子蛋白質電泳指紋圖譜的測定

★ 馬梅芳 侯惺 李凡 趙林濤 李芳（.棗莊市食品藥品檢驗檢測中心 山東 棗莊 770；.棗莊市立醫(yī)院 山東 棗莊 7700；.陜西省中醫(yī)藥研究院 西安 70068）

蛋白質分子是體現(xiàn)生命活動的特征性物質，在不同的生物種屬間存在差異，受遺傳基因的控制，具有遺傳的穩(wěn)定性［1］。日本學者研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質的譜帶序列具有生物種的特征，并在生物的分類學研究中，成功地應用了蛋白質的電泳技術［2］。蛋白質分子分為同工酶和貯藏蛋白兩大類，不同蛋白質分子的分子量大小、電荷數(shù)目、電荷極性以及空間結構都具有差異，是進行電泳分離的基礎。中藥體內的同工酶、貯藏蛋白等大分子物質攜帶有各種遺傳性信息，中藥品種的遺傳特性，可以直接或間接通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測結果反映出來，利用這種生物學方面的差異，可將蛋白質電泳技術用于中藥物種的鑒定。

自上世紀80年代初，石俊英教授等率先將電泳技術引入到中藥的鑒別研究中，與現(xiàn)代生物技術的結合與運用，為傳統(tǒng)中藥學科的發(fā)展注入新的活力，中藥的質量評價手段和技術也從手摸、眼看、鼻聞、口嘗等傳統(tǒng)的性狀控制逐漸發(fā)展到顯微鑒別、組織形態(tài)分析、細胞培養(yǎng)以及蛋白質分子水平。在蛋白質電泳原理的指導下，經(jīng)過研究人員大量的實驗探索，建立了“中藥電泳鑒別法”這項新技術，并將之廣泛應用于各類中藥的鑒別研究中［3-11］。近年來，“指紋圖譜”概念的提出，為中藥的研究指出新的方向，將蛋白質電泳技術與“指紋圖譜”思路相結合，提出的“中藥電泳指紋圖譜”新理念，將中藥鑒別研究再一次提高到生物指紋圖譜水平，擺脫了蛋白質之外的其它因素的干擾和制約，實現(xiàn)了中藥鑒定手段的跨越。本實驗采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對南葶藶子、北葶藶子及其偽品的蛋白質、同工酶進行分析測試，繪制葶藶子的蛋白質電泳指紋圖譜，豐富和完善葶藶子的質量控制研究內容。

1 儀器與試藥

電子天平(BS-224S型，德國賽多利斯公司)；穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀及電泳儀槽（DYY-Ⅲ型，DYY-Ⅲ28型，北京六一儀器廠）；高速冷凍離心機（LGR16-W型，北京醫(yī)用離心機廠）；凝膠成像紫外分析儀（EDAS-290型，北京市新技術應用研究所）；真空泵（AVP-7120型，梅瑞泰克科技）；真空干燥器（DZF6050型，上海精宏實驗設備有限公司）；超聲提取器（JBT-QX500F型，濟寧金白特電子有限責任公司）；一次性注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）；微量進樣器（上海安亭微量進樣器廠）。

四甲基乙二胺（TEMED）（天津大茂化學試劑有限公司）；過硫酸銨（天津博迪化工股份有限公司）；瓊脂（上海精細化工有限公司）；蔗糖（上海精細化工有限公司）；考馬斯亮藍（上海國藥集團化學試劑有限公司）； 分離膠貯液、濃縮膠貯液、分離膠緩沖液（pH8.9）、濃縮膠緩沖液（pH6.7）、電泳緩沖液（pH8.3），按照《中國藥典》2015年版四部規(guī)定的方法新鮮配制。

山東威海9個2019年的葶藶子樣品，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學石俊英教授鑒定為十字花科植物獨行菜Lepidium apetalumWilld.的種子（北葶藶子，編號1~8）和十字花科植物播娘蒿Descurainiasophia（L.）Webb ex Prantl.的種子（南葶藶子，編號9）；山東威海3個2019年的葶藶子偽品，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學石俊英教授鑒定為十字花科植物薺 菜Capsella bursa-pastoris（L.）Medic.的 種 子（編號10）；十字花科植物喜山葶藶Draba oreadesL.的種子（編號11）；十字花科植物北美獨行菜Lepidium virginicumL. 的種子（編號12）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

稱取樣品1.0 g，置冰浴研缽中，控制低溫研磨粉碎，加入pH8.9濃縮膠緩沖液（用前稀釋4倍）1 mL，超聲提取30 min（冰浴控制提取溫度），冷凍離心2 min（0 ℃，8 000 r/min），取上清液，與相同體積的蔗糖溶液（濃度40%）混勻，置4℃冰箱內，備用。

2.2 電泳槽的安裝

為降低氧對聚丙烯酰胺聚合反應的抑制作用，實驗選擇垂直板電泳槽，電泳槽雙平板為封閉環(huán)境，灌膠后，除頂層部分凝膠外其他均與空氣隔絕，減少與氧的接觸。垂直板電泳槽樣式繁多，目前流行的是有機玻璃材質的，呈方形或長方形，由兩個半槽組成，在硅酮橡膠的夾套內裝入兩塊玻璃即構成凝膠模子，凝膠模子設計在兩個半槽之間，用來裝電極緩沖液的正負兩個槽在模子的兩側。

實驗前玻璃板按照洗液或去污劑浸泡清洗、水沖洗、蒸餾水沖洗的順序處理干凈，直立干燥，注意已經(jīng)潔凈的玻璃板面不要被手接觸污染。安裝時，用雙手控制玻璃板的兩側邊緣部分，先把玻璃板裝入夾套，再整體放入兩個半槽之間（注意保持角度的垂直），先固定長螺桿，再按照順序，擰緊各個螺絲（注意用力要均勻）。

安裝好電泳槽后，將瓊脂加熱熔化，緩緩倒入電泳儀底槽內，凝結成約5 mm厚的瓊脂層封底。

2.3 凝膠的制備

按表1的比例配制3%濃縮膠液4 mL、7%分離膠液16 mL。將配好的2種膠液置真空干燥器內抽真空處理10 min，以降低氧對聚合反應的抑制作用。分離膠液，緩緩注入已安裝好的凝膠模子中，待膠液稍凝后，在表層覆蓋約1 mm厚的分離膠緩沖液，靜置1 h以上，液面分層后，用濾紙條吸凈水層。插上上樣槽模具，將濃縮膠注入凝膠模子中，靜置，待濃縮膠變?yōu)槿榘咨珪r，取出上樣槽模具。立即向電泳槽內加入電泳緩沖液。

表1 電泳凝膠的配制

2.4 上樣與電泳

濃縮膠凝固后應上樣，上樣量20 μL，在負極槽電極緩沖液中加入一滴溴酚藍指示劑用來示蹤，電泳開始時電流保持15 mA，待樣品進入分離膠后，調整電流至25 mA。待示蹤指示劑行至距瓊脂層約1 cm時，關閉電源，停止電泳。

2.5 染色與脫色

2.5.1 蛋白質染色與保存 電泳結束后，取出膠板，標記前沿。將凝膠板浸于考馬斯亮蘭染色液內，在37 ℃染色1~2 h，至譜帶清晰。用蒸餾水洗去凝膠表面附著的染料，再浸于脫色液中脫色，直至譜帶背景清晰。保存于7%醋酸溶液中。

2.5.2 同工酶染色與保存 電泳結束后，取出膠板，標記前沿。將膠板浸于醋酸聯(lián)苯胺染色液中，加30%雙氧水2~3滴，常溫下染色，很快出現(xiàn)藍色譜帶，不久譜帶變?yōu)樽丶t色，棄去染色液，凝膠板用蒸餾水沖洗后保存于7%的醋酸溶液中。

3 結果

3.1 蛋白質及同工酶電泳結果

樣品蛋白質電泳結果見圖1，樣品同工酶電泳結果圖2。

圖1 樣品蛋白質電泳圖譜

圖2 樣品同工酶電泳圖譜

3.2 電泳圖譜分析

通過“凝膠成像系統(tǒng)” （Image Analysis）將脫去底色的凝膠板掃描成PAGE圖譜，然后經(jīng)“Advanced American Biotechnology” (AAB)系統(tǒng)分析后即得到以各譜帶的光密度值（OD）為縱坐標、譜帶泳動距離（Pos）為橫坐標的電泳圖譜，結果見圖3、圖4。

圖3 樣品蛋白質電泳圖譜分析

圖4 樣品同工酶電泳圖譜分析

3.3 相似度分析

樣品蛋白質電泳相似度分析結果見圖5，樣品同工酶電泳相似度分析結果見圖6。

圖5 樣品蛋白質電泳相似度分析圖

圖6 樣品同工酶電泳相似度分析圖

3.4 聚類分析

樣品蛋白質電泳聚類分析結果見圖7，樣品同工酶電泳聚類分析結果見圖8。

圖7 樣品蛋白質電泳聚類分析圖

圖8 樣品同工酶電泳聚類分析圖

4 討論

（1）由葶藶子的蛋白質電泳圖譜可知：相同產地、不同生長環(huán)境的8個獨行菜種子樣品的蛋白質電泳圖譜條帶無差異，說明8個獨行菜種子樣品中存在相同種類的蛋白質；獨行菜種子與播娘蒿種子、薺菜種子、喜山葶藶種子、北美獨行菜種子相比，則差異較大。由蛋白質電泳指紋圖譜相似度與聚類分析的結果可以看出：相同產地、不同生長環(huán)境的獨行菜種子中含有的蛋白質種類相同，含量近似。生長環(huán)境對獨行菜種子中蛋白質種類無影響，對蛋白質含量影響不大。獨行菜種子與播娘蒿種子、薺菜種子、喜山葶藶種子、北美獨行菜種子相比，蛋白質種類與數(shù)量均有較大差異。

（2）由葶藶子的同工酶電泳圖譜可知：相同產地、不同生長環(huán)境的8個獨行菜種子樣品的同工酶電泳譜帶位置相同，說明8個獨行菜種子樣品中含有的相同種類的同工酶。由同工酶電泳指紋圖譜相似度與聚類分析的結果可以看出：相同產地、不同生長環(huán)境的獨行菜種子中含有的同工酶種類相同，含量極為近似。獨行菜種子與北美獨行菜種子相比，同工酶種類與數(shù)量具有一定的相似性；獨行菜種子與播娘蒿種子、薺菜種子、喜山葶藶種子相比，同工酶種類與數(shù)量均有顯著性差異。

（3）蛋白質分子普遍存在于植物細胞內，是基因表達的產物，受遺傳基因的控制而不受地理位置、生長環(huán)境、種植采收等眾多外界因素的影響，具有種的特異性和穩(wěn)定性。因此，不同的植物品種、雜交種會表現(xiàn)出不同的電泳譜帶模式，可以區(qū)分。獨行菜、北美獨行菜均來源于十字花科獨行菜屬，播娘蒿來源于十字花科播娘蒿屬，喜山葶藶來源于十字花科葶藶屬，薺菜來源于十字花科薺菜屬，其蛋白質電泳指紋圖譜的差異表明：蛋白質電泳指紋圖譜不僅可以用于不同科屬間正品、偽品的鑒別，而且可以解決同科同屬不同種間正品、偽品不易區(qū)分的難題。而同工酶指紋圖譜在品種的鑒定上更加準確、穩(wěn)定，因為同工酶的結構差異主要來源于基因差異，利用它可以鑒別諸多基因變異，如生物的類別、品種的地理分布、演化關系等［12］。8個獨行菜種子樣品的同工酶電泳譜帶位置相同，表明不同的生長環(huán)境沒有引起獨行菜的品種退化。12個樣品同工酶電泳指紋圖譜相似度與聚類分析的結果提示：與播娘蒿、薺菜、喜山葶藶相比，北美獨行菜與獨行菜的親緣關系更近一些，此結果與植物分類學的研究一致。

（4）本實驗建立了葶藶子的蛋白質、同工酶電泳指紋圖譜，把聚丙烯酰胺凝膠電泳結果中各譜帶的位置、寬度及每條譜帶中蛋白質、同工酶含量的大小都進行了量化，進一步增加了中藥電泳的準確度。聚丙烯酰胺凝膠電泳具有分析靈敏度高、實驗材料用量少、結果重現(xiàn)性好，分析過程受環(huán)境因素影響小，對樣品形態(tài)、來源適應性強等諸多優(yōu)點。針對目前葶藶子品種來源復雜多樣、內在質量難以評價、鑒定困難等難題，電泳技術的靈敏、準確、分析效率高、速度快等優(yōu)點表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。葶藶子蛋白質、同工酶電泳指紋圖譜的建立，再次證明了以蛋白質分子為標示，從分子水平上進行中藥的鑒定與質量評價，是完全可行的。