節(jié)律基因Bmal1對結直腸癌細胞放療敏感性的影響及其機制*

張博汝，魏 柏，石曉雅，謝夢麗

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院腫瘤科，武漢 430077)

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球發(fā)病率和病死率分別位于惡性腫瘤的第三和第二，對人類的健康造成威脅[1]。放療是結直腸癌治療的重要手段之一，因此，提高結直腸癌對放療的敏感性對降低患者的病死率和改善預后至關重要。腦和肌肉芳香烴受體核轉運樣蛋白1(Bmal1)基因是調(diào)節(jié)哺乳動物晝夜節(jié)律的重要轉錄因子，在腫瘤細胞中，Bmal1基因可以參與調(diào)節(jié)細胞增殖、衰老、內(nèi)質網(wǎng)介導的應激恢復、逃避凋亡等，作為一種可能的致癌基因,通過DNA損傷修復途徑、細胞遷移、缺氧、全身免疫應答，促進化療耐藥性或轉移[2-4]。然而關于節(jié)律基因Bmal1能否影響結直腸癌細胞對放療的敏感性尚少見報道，本文通過體外細胞生物學和分子生物學實驗，旨在觀察Bmal1基因對結直腸癌細胞放療敏感性的影響及其可能作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞：小鼠結直腸癌細胞由華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心饋贈。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司(批號：8120473)，胎牛血清購自以色列BI公司(批號：2120140)，胰蛋白酶(批號：70080500)、青霉素鏈霉素溶液(批號：88100500)購自Biosharp公司，Bmal1 siRNA和陰性對照negative control siRNA由武漢奇景生物科技有限公司合成，HiPerFect轉染試劑購自Qiagen公司，CCK-8試劑盒購自賽文創(chuàng)新生物科技有限公司(批號：20210102)，RNA提取試劑TRIzol購自北京天根生化科技有限公司，Bmal1、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、GAPDH引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司，RIPA裂解液購自上海碧云天生物公司，兔抗小鼠GAPDH多克隆抗體(批號：161802)、兔抗小鼠HIF-1α多克隆抗體(批號：AC2103033E)、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(批號：CR2104081)購自武漢塞維爾生物科技有限公司，兔抗小鼠Bmal1多克隆抗體(批號：00011253)、兔抗小鼠VEGF多克隆抗體(批號：4000003012)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉染

結直腸癌細胞用含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基接種于T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)在含5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，選擇處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，待細胞生長至匯合度為60%～70% 時進行轉染，轉染操作步驟按照HiPerFect Transfection Reagent 轉染試劑說明書進行，將轉染Bmal1 siRNA細胞記為敲除組，將轉染陰性對照 negative control siRNA的細胞記為對照組。siRNA Bmal1序列，上游引物：5′-CCG AGG GAA GAU ACU CUU UTT- 3′；下游引物：5′-AAA GAG UAU CUU CCC UCG GTC-3′。

1.2.2細胞X射線照射實驗

將轉染后的結直腸癌細胞接種于6孔板中，進行放射處理。用直線加速器，照射源至細胞培養(yǎng)板的距離為100 cm，照射野的面積為10 cm×10 cm。根據(jù)實驗需要給予合適的射線劑量，6MV X射線，總劑量6 Gy照射處理。把細胞分為對照組、Bmal1基因敲除組(敲除組)、放療組、Bmal1基因敲除聯(lián)合放療組(聯(lián)合組)。

1.2.3CCK-8檢測各組細胞增殖能力

各組細胞經(jīng)過照射后，吸去6孔板中舊培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍，收集細胞懸液轉移至10 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用1 mL完全培養(yǎng)液重懸，反復輕輕吹打細胞，取10 μL進行細胞計數(shù)，每孔吸取1×104個細胞接種到96孔板，每組設3個復孔，以細胞貼壁為0 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀在450 nm處測每孔細胞光密度(OD)值，依次在24、48 h時測每組細胞的OD值。

1.2.4RT-qPCR檢測各組細胞Bmal1、HIF-1α、VEGF mRNA的表達水平

采用TRIzol法提取各組細胞的總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，采用qPCR試劑盒檢測各組細胞中Bmal1、HIF-1α、VEGF 的mRNA表達水平，按照說明書加試劑進行PCR反應，引物序列見表1。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.5Western blot檢測各組細胞Bmal1、HIF-1α、VEGF蛋白的表達水平

向6孔板細胞中加入細胞裂解液，提取各組細胞總蛋白。用蛋白質定量試劑盒(BCA法)檢測蛋白水平，分別取各個蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，切膠后轉膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，在5% 脫脂奶粉中封閉1 h。用Tris-HCl鹽加吐溫緩沖液(TBST)洗膜3次，10 min /次，加入一抗(1∶1 000稀釋)雜交，4 ℃過夜孵育。加入二抗(1∶3 000稀釋)雜交，室溫孵育1 h。曝光、顯影。用Image J軟件分析每組各個蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組細胞Bmal1 mRNA和蛋白表達水平比較

RT-qPCR和Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，敲除組細胞Bmal1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)；與放療組比較，聯(lián)合組細胞Bmal1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

1:對照組;2:敲除組;3:放療組;4:聯(lián)合組；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與放療組比較。

2.2 各組細胞增殖能力比較

CCK-8檢測各組細胞OD值結果顯示，0 h各組細胞OD值比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。24 h后4組細胞增殖能力大小依次為：對照組細胞最強，其次為敲除組、放療組，增殖能力最低的為聯(lián)合組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.3 各組細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達水平比較

RT-qPCR檢測結果顯示，HIF-1α、VEGF mRNA的表達水平均在聯(lián)合組細胞最低，分別是對照組細胞的0.40、0.38倍，其次是放療組、敲除組，對照組細胞表達水平均最高，各組細胞HIF-1α、VEGF mRNA比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，b:P<0.01，與對照組比較；c：P<0.05，與敲除組比較；d：P<0.05，與放療組比較。

2.4 各組細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達水平比較

Western blot結果顯示，HIF-1α、VEGF蛋白的表達水平均在對照組最高，而在聯(lián)合組表達水平最低，分別是對照組細胞的0.45、0.35倍，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時放療組和敲除組HIF-1α和VEGF蛋白的表達水平均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

1:對照組;2:敲除組;3:放療組;4:聯(lián)合組；a：P<0.05，b:P<0.01,與對照組比較；c：P<0.05，與敲除組比較；d：P<0.05，與放療組比較。

3 討 論

隨著放射技術和設備的發(fā)展，放療作為結直腸癌重要的治療手段，在一定程度上提高了患者的生存率，但是放射抵抗的出現(xiàn)，會使部分患者發(fā)生復發(fā)與轉移，是導致治療失敗的原因之一。由此，本課題組猜測是否存在一種對正常組織細胞損害相對最小，而殺傷腫瘤效果最好的影響放療誘導的腫瘤細胞凋亡的機制。尋找對腫瘤細胞產(chǎn)生最大毒性的同時盡量避免放療抵抗的方法，可以突破放療的局限性，對增加放療敏感性具有重大意義。

2017年3位科學家因揭示了生物鐘基因調(diào)控生物體晝夜節(jié)律性的奧秘而獲得了諾貝爾醫(yī)學獎。節(jié)律基因Bmal1作為晝夜節(jié)律的核心元件之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系錯綜復雜，可作為抑癌基因或促癌基因，一項關于乳腺癌的研究表明，早晨放療有更多的毒副作用，這與節(jié)律基因Per3突變有關[5]。但是關于Bmal1基因是否對結直腸癌放療的敏感性產(chǎn)生影響還少見報道，本研究通過RNA轉染技術敲除Bmal1基因，旨在探索Bmal1是否可以通過HIF-1α/VEGF信號通路調(diào)節(jié)結直腸癌細胞的放療敏感性。

放療對于腫瘤患者治療的有效性取決于其破壞腫瘤細胞DNA的能力，放療抵抗性的出現(xiàn)部分原因是腫瘤細胞高效和多余的DNA修復能力[6],而DNA修復基因在mRNA和蛋白表達上有周期性的表達模式[7-8]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)節(jié)律基因Per1可以減輕膠質瘤細胞的DNA損傷，使腫瘤細胞更不容易受到放療導致的凋亡和其他損傷效應的影響[9]。本研究通過CCK-8細胞增殖實驗，結果發(fā)現(xiàn)敲除組、放療組與對照組細胞相比，OD值均降低，提示敲除Bmal1和放療都可以抑制結直腸癌細胞的增殖能力；聯(lián)合組細胞比其他3組細胞的增殖能力都低，提示Bmal1基因可以參與放療敏感性的調(diào)控。這些結果表明，敲除Bmal1基因可以通過抑制結直腸癌細胞的增殖能力從而增加對放療的敏感性。也有研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因過表達可以增強鼻咽癌的放療敏感性[10]，可能與P53、P21蛋白上調(diào)有關，與本研究的結果不同可能是由于腫瘤細胞的種類和調(diào)控的分子機制不同導致。

一項大規(guī)模的癌癥生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤缺氧的標志物HIF和VEGF，與晝夜節(jié)律失調(diào)之間存在關聯(lián)，包括晝夜節(jié)律抑癌因子的缺失或晝夜節(jié)律促癌因子的激活，HIF可以改變晝夜節(jié)律[11-12]。晝夜節(jié)律也會影響HIF-1α的缺氧反應，此外，在HIF-1α基因的啟動子上有一個E-box，表明Clock/Bmal1可以誘導HIF-1α的表達[13]。也有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)節(jié)律基因Cry1可以直接與HIF-1α蛋白結合，從而抑制靶基因HIF-1α的表達[14]。基于以上學者的研究，本研究RT-qPCR和Western blot檢測結果顯示，無論是否經(jīng)過放療處理，與對照組比較，Bmal1基因敲除后HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白的相對表達水平均降低，提示節(jié)律基因Bmal1可以調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路。MA等[15]學者研究發(fā)現(xiàn)，敲除Bmal1基因可以降低HIF-1α和VEGF的表達，從而影響軟骨細胞的發(fā)育[15]。

本研究通過RT-qPCR和Western blot檢測技術，結果顯示，無論有無敲除Bmal1基因，放療組比對照組的HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P<0.05)，提示HIF-1α和VEGF的表達水平與放療敏感性相關，表明HIF-1α/VEGF通路可以參與調(diào)節(jié)結直腸癌放療敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌在放療過程中，HIF-1α和VEGF可以預測宮頸癌患者放療效果及患者預后[16]；在宮頸鱗癌中放療緩解患者組織中HIF-1α和VEGF的表達陽性率明顯低于放療未緩解患者[17]。彭明堯等[18]證實了食管鱗癌患者腫瘤組織中HIF-1α、VEGF的陽性表達與近期放療效果密切相關。

本研究結果顯示，Bmal1基因敲除聯(lián)合放療細胞的HIF-1α和VEGF表達水平比單純放療和Bmal1基因敲除細胞均降低(P<0.05)，且與對照組比較明顯降低(P<0.01)，說明敲除Bmal1基因可以通過調(diào)控HIF-1α/VEGF信號通路來增加對結直腸癌細胞放療的敏感性。

綜上所述，本研究從細胞和分子水平上，來觀察Bmal1基因對結直腸癌細胞放療敏感性的影響，本研究結果顯示，節(jié)律基因Bmal1為改善結直腸癌放療效果提供了一定的理論基礎，但參與結直腸癌放療敏感性調(diào)節(jié)的其他可能的分子機制還有待進一步探索。