彌漫性大B細胞淋巴瘤組織中miR-448和KDM2B的水平表達及臨床意義

陳思言，張伶莉，楊麗華

(達州市中心醫(yī)院血液內(nèi)科，四川達州 635000)

彌漫性大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是常見的惡性淋巴瘤之一，為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)的一個亞型，DLBCL 臨床表現(xiàn)多樣、復雜，具有高異質(zhì)性，目前對DLBCL 的治愈率有很大提高，但仍有30%～40%的患者出現(xiàn)耐藥和復發(fā)，因此，尋找有效標志物對DLBCL 的診斷、治療和預后評估具有重要價值[1-2]。微小核糖核酸（miroRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性小分子，參與惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲等多種生物學行為，研究表明，miRNA 在DLBCL 等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤的生物標志物[3-4]。如歧紅陽等[5]研究表明，在結(jié)腸癌細胞SW480中，過表達hsa-miR-448 通過下調(diào)缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α) 可減弱細胞的侵襲、遷移能力及抑制SW480 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。賴氨酸特異性脫甲基酶 2B[lysine(K)-specific demethylase 2B，KDM2B]是一種去甲基化酶，主要通過調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化狀態(tài)發(fā)揮生物學作用，在細胞增殖、分化、腫瘤的發(fā)生中起重要作用[6]。研究表明，胃癌患者胃癌組織中KDM2B 表達水平明顯升高，且與患者組織分型、淋巴結(jié)狀態(tài)、TNM 分期和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HeR 2）及患者預后相關(guān)[7]。miR-448, KDM2B在DLBCL 中的表達尚未見報道。本研究檢測miR-448, KDM2B mRNA 及蛋白在DLBCL 組織中表達情況，分析其與患者臨床特征之間的關(guān)聯(lián)，探討miR-448, KDM2B 在DLBCL 發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年7月～2018年3月在達州市中心醫(yī)院收治的DLBCL 患者97 例，其中男性59 例，女性38 例，患者年齡41～78（59.80±9.50）歲。納入標準：①符合DLBCL 的診斷標準[8]；②經(jīng)活檢組織病理學確診；③臨床病理資料及隨訪資料完整。排除標準: ①并發(fā)其他器官或系統(tǒng)惡性腫瘤患者；②臨床資料不全者。應用 Hans 法則對DLBCL 患者進行分型，其中GCB（germinal center B cell）型55 例，non-GCB 型42 例。Ann Arbor 分期:Ⅰ～Ⅱ期45 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。國際預后指數(shù)(International prognostic index，IPI) 評分:0 ～2分50 例，3 ～4 分47 例；東部腫瘤協(xié)作組（Eastern cooperative oncology group, ECOG）評分＜2 分43例，≥2 分54 例。有B 癥狀46 例，無B 癥狀51 例。血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）正常60 例，升高37 例。

選取同期50 例淋巴結(jié)反應性增生組織(reactive hyperplasia of lymph node，RHL)患者為對照組，其中男性28 例，女性22 例，年齡 38 ～79 (59.40±9.70)歲。兩組觀察對象之間年齡、性別等資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

研究樣本采集均經(jīng)過本院倫理委員會批準，患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Trizol 試劑（美國Invitrogen Life Technologies 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，real-time PCR 試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；兔抗人KDM2B 多克隆抗體（美國Elabscience）；免疫組化試劑盒，羊抗兔二抗（上海碧云天生物科技有限公司）；miR-448, KDM2B 和內(nèi)參基因引物均由上海生工生物公司設(shè)計與合成。羅氏480 定量PCR 系統(tǒng)（德國Roche 公司）。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測miR-448, KDM2B mRNA 的表達：分別取DLBCL 組織與RHL 組織，研缽研碎后，Trizol 試劑提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR 檢測miR-448, KDM2B mRNA 水平。miR-448, KDM2B 和內(nèi)參基因U6, β-action 基因序列設(shè)計引物，由上海生物工程公司合成，引物序列見表1，反應結(jié)束后，miR-448, KDM2B 相對表達水平采用2-ΔΔCt分析法計算。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.3.2 免疫組織化學染色檢測KDM2B 蛋白：Envision 兩步法對石蠟切片進行染色。將包埋DLBCL 組織及RHL 組織的石蠟標本切成3μm 的切片后，經(jīng)過脫蠟、修復后，加10g/dl 山羊血清封閉，兔抗人KDM2B 多克隆抗體（稀釋倍數(shù)1 ∶100），室溫孵育1h，PBS 洗滌后，加羊抗兔二抗（稀釋濃度1 ∶500），孵育后顯色。染色結(jié)果判斷：隨機取5 個高倍視野，對細胞進行計數(shù)。①根據(jù)陽性細胞數(shù)：陽性細胞≤5%，0 分；6%～25%，1 分；26%～50% 2 分；51%～75%，3 分；＞75%，4 分。②根據(jù)細胞染色強度評分：無染色為0 分，淡黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分。將兩項評分相乘作為評判標準：得分0 ～1 分為KDM2B 陰性表達，2 分以上為KDM2B 陽性。

1.3.3 隨訪：對所有DLBCL 患者進行電話或門診隨訪，每3 個月隨訪一次，共隨訪36 個月，末次隨訪時間為2020年3月31日，記錄患者生存情況，計算三年總生存率。

1.4 統(tǒng)計學分析 利用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學分析，采用t檢驗分析對照組和DLBCL 組miR-448，KDM2B mRNA 表達水平的差異，用卡方檢驗和獨立樣本t檢驗分析不同DLBC 患者miR-448,KDM2B 表達與臨床病理特征關(guān)系，Kaplan-Meier生存分析miR-448, KDM2B 表達與DLBCL 患者生存率的關(guān)系，Pearson 分析miR-448, KDM2B 表達水平相關(guān)性，COX 回歸模型分析影響DLBCL 患者預后的影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組研究對象DLBCL 患者組織中miR-448，KDM2B 表達水平比較 DLBCL 患者組織中miR-448 表達水平顯著低于對照組（0.65±0.08 vs 1.04±0.19），而KDM2B mRNA 表達水平顯著高

于對照組(2.89±0.54 vs 0.98±0.21)，差異均有統(tǒng)計學意義（t=17.473, 24.058, 均P＜0.001）。

2.2 兩組研究對象DLBCL 組織中KDM2B 蛋白表達水平比較 見圖1。免疫組織化學染色結(jié)果顯示，KDM2B 表達主要定位于細胞核，對照組陽性表達11例（22.00%），DLBCL組陽性表達70例（72.16%），DLBCL 組KDM2B 蛋白陽性表達率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=33.561，P＜0.001）。

圖1 KDM2B 蛋白在DLBCL 組織中陽性表達（×400）

2.3 miR-448，KDM2B 表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。以DLBCL 組織中miR-448,KDM2B 蛋白陽性表達情況，將DLBCL 患者分為miR-448 高表達組（ ≥0.65）, miR-448 低表達組（＜0.65）和KDM2B 陽性表達組, KDM2B陰性表達組。分析發(fā)現(xiàn)miR-448，KDM2B 表達與Ann Arbor 分期、IPI 評分、Hans 分型有關(guān)（χ2=4.227 ～12.960，均P＜0.05）；與年齡、性別、LDH 水平、ECOG 評分、有無B 癥狀無關(guān)（χ2=0.072 ～3.726，均P＞0.05）。

2.4 DLBCL 患者組織中miR-448 與KDM2B 表達水平的相關(guān)性 見圖2。DLBCL 患者組織中miR-448 與KDM2B 表達水平呈負相關(guān)（r=-0.602，P＜0.01）。

表2 miR-448，KDM2B 表達水平與DLBCL 臨床病理特征的關(guān)系

圖2 DLBCL 患者組織中miR-448 與KDM2B表達水平相關(guān)性

2.5 miR-448, KDM2B 表達與DLBCL 患者生存率的關(guān)系 見圖3。通過Kaplan-Meier 生存分析可知，miR-448 高表達組DLBCL 患者三年累積生存率顯著高于miR-448 低表達組患者（55.53% vs 31.38%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.434，P=0.006）。KDM2B陽性表達組DLBCL 患者三年累積生存率顯著低于陰性表達組患者（31.73% vs 56.67%），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.877，P=0.006）。

2.6 DLBCL 患者預后影響因素分析 見表3。單因素分析結(jié)果顯示，Ann Arbor 分期、IPI 評分、Hans 法分型、miR-448，KDM2B 是影響DLBCL患者不良預后的危險因素。多因素分析結(jié)果顯示，Ann Arbor 分期（95%CI=1.567～4.012，P=0.005）,miR-448（95%CI=2.213～4.478，P=0.001）, KDM2B（95%CI=1.506～4.554，P=0.003）是影響DLBCL 患者不良預后的獨立危險因素。

圖3 miR-448, KDM2B 表達與DLBCL 患者生存率的Kaplan-Meier 生存分析

表3 影響DLBCL 患者不良預后的危險因素分析結(jié)果

3 討論

miR-448 在多種腫瘤組織或細胞中低表達，發(fā)揮抑癌基因的作用，miR-448 與細胞免疫應答、細胞增殖、凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和腫瘤細胞耐藥密切相關(guān)[9]。多項研究表明，miR-448 在結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌和口腔鱗狀細胞癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[10-11]。研究表明，miR-448 在乳腺癌組織和細胞中表達下調(diào)，通過靶向E 盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1/2 抑制乳腺癌細胞遷移、侵襲和EMT[12]。另有研究[11]顯示，與正常組織相比，非小細胞肺癌（NSCLC）組織中miR-448 水平降低，過表達miR-448 可降低細胞的生長和遷移能力，抑制EMT，影響EMT 相關(guān)分子波形蛋白和E-cadherin的表達，miR-448 有希望成為NSCLC 患者的治療靶點。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，DLBCL組織中miR-448 表達水平降低，且其表達水平與DLBCL的Ann Arbor分期、IPI評分、Hans分型有關(guān)，推測miR-448 在DLBCL 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。SHAN 等[13]研究表明，miR-448 在肺鱗狀細胞癌組織和細胞系中的表達降低，miR-448 的表達與肺鱗癌的分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期及預后相關(guān)，本研究結(jié)果與此類似。JIN等[14]人研究表明，胰腺癌組織和細胞系中miR-448表達水平降低，過表達miR-448 導致G0/G1 細胞周期停滯，顯著降低癌細胞增殖并促進癌細胞的凋亡，表明miR-448 發(fā)揮抑癌基因的作用，低表達可促進腫瘤生長，本研究中miR-448 在DLBCL 中低表達，推測miR-448 也是發(fā)揮抑癌基因的作用。

KDM2B 在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化、遷移及炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等多方面發(fā)揮重要作用[15]。多項研究結(jié)果表明，KDM2B 在乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞中高表達，其被認為是一種致癌基因[16]。有研究表明，胰腺導管腺癌（PDAC）中KDM2B 高表達，可促進胰腺癌的進展，沉默KDM2B 表達使PDAC 細胞喪失上皮分化能力，敲除KDM2B 的表達可抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞自噬[17-18]。本研究結(jié)果顯示，DLBCL 組織中KDM2B mRNA 及蛋白陽性表達率顯著高于對照組，且其表達水平與DLBCL 患者的Ann Arbor 分期、IPI 評分、Hans 分型有關(guān)，提示KDM2B 與DLBCL 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。易葉葉等[19]研究表明，卵巢惡性腫瘤組織中KDM2B 蛋白表達水平升高，與卵巢癌低分化、國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO) 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，此研究結(jié)果與本研究在DLBCL 結(jié)果類似，表明KDM2B 參與了DLBCL 的進展過程，促進DLBCL 的發(fā)生發(fā)展。

另外，本研究結(jié)果顯示，DLBCL 組織中miR-448 與KDM2B 表達水平呈負相關(guān)，提示兩者在DLBCL的發(fā)生發(fā)展過程中可能具有負向調(diào)控作用。研究表明，miR-448 通過下調(diào)KDM2B 的表達，刺激糖酵解并促進胃癌細胞的增殖[20]。本研究也通過查詢targetscan 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，miR-448 與KDM2B存在靶向關(guān)系，因此本研究推測，miR-448 可能通過下調(diào)KDM2B 的表達，參與DLBCL 的發(fā)生發(fā)展。有研究顯示，miR-448 與口腔鱗狀細胞癌患者的預后相關(guān)，KDM2B 與膠質(zhì)瘤患者預后有關(guān)[21-22]，本研究分析結(jié)果顯示，miR-448 高表達組DLBCL患者三年累積生存率顯著高于miR-448 低表達組患者，KDM2B 陽性表達組DLBCL 患者三年累積生存率顯著低于陰性表達組患者，提示miR-448,KDM2B 表達水平可能通過調(diào)控腫瘤發(fā)展影響患者預后情況。COX 回歸分析結(jié)果顯示，miR-448,KDM2B 是影響DLBCL 患者不良預后的獨立危險因素，提示miR-448, KDM2B 可作為評估DLBCL患者不良預后的標志物。

綜上所述，在DLBCL 患者組織中miR-448 低表達、KDM2B 高表達，二者與DLBCL 臨床病理特征和患者預后有關(guān)，可作為DLBCL 患者潛在的預后標志物。但二者在DLBCL 中具體作用機制需要從細胞和分子層面做進一步研究。