結(jié)直腸癌組織中鋅指蛋白139（ZNF139）的表達及臨床意義研究

鄭光明，孫建華，宋秋月

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北恩施 445000）

隨著近年來人類生活方式、飲食習慣的改變，各類惡性腫瘤疾病患病人數(shù)明顯增加且呈逐年增長趨勢，結(jié)直腸癌就是其中最具代表性的一種[1]。流行病學調(diào)查顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在全國范圍內(nèi)均較高，在我國的發(fā)病率居第三位，患者五年生存率為32%左右，該疾病的具體起病機制目前尚在研究中，分析原因可能與遺傳、環(huán)境、飲食及老齡化社會進程加快有關(guān)[2]。鋅指蛋白（zinc finger protein ，ZNF）近年來被認為參與各種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，且多項研究證實ZNF 能通過調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達介導腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[3]。ZNF 139 作為鋅指蛋白家族中的一員，近年來據(jù)相關(guān)研究顯示其在膀胱癌、骨肉瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，但查閱相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)，關(guān)于ZNF139 在結(jié)直腸癌中作用的研究較少[4]?；诖?，本文選取收治的67 例結(jié)直腸癌患者開展研究，術(shù)中取所有患者腫瘤病灶及正常癌旁組織，測定ZNF139 在不同組織中的表達情況，分析ZNF139 與結(jié)直腸癌患者臨床病理的關(guān)系，以供后續(xù)研究參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2012年5月～2014年6月于恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院收治的67 例行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者臨床資料進行研究，其中男性36 例，年齡55 ～83(68.60±7.50)歲，體質(zhì)量指數(shù)21.30±1.20 kg/m2；女性31 例，年齡55 ～82(69.05±7.16)歲，體質(zhì)量指數(shù)21.05±1.44 kg/m2；腫瘤直徑：＜5 cm 47 例，≥5 cm 20 例；分化程度：低/未分化42 例，中/高度分化25 例；浸潤程度：T1/T2 38 例，T3/T4 29 例；TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37 例。本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬均知情并簽署知情同意書。

1.2 儀器和試劑 SP 免疫組織化學染色試劑盒及相關(guān)配套試劑（北京中杉金橋生物有限公司），VERITI 型PCR 儀（美國ABI 公司），Leica 光學顯微鏡（德國Leica 公司），枸櫞酸鈉抗原修復液（上海基因公司），DAB 顯色試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）等。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)中切除腫瘤病灶，取新鮮結(jié)直腸癌組織、距腫瘤病灶邊緣3cm 處癌旁組織、遠離癌腫病灶區(qū)域的正常結(jié)直腸黏膜組織，大小1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，每項樣本各取兩份，一份采集后即刻使用10g/dl 中性甲醛固定，以備后續(xù)免疫組織化學染色；另一份低溫下保存，供RNA 提取使用。

1.3.2 SP 免疫組織化學染色檢測結(jié)直腸癌組織中ZNF139 蛋白表達：結(jié)直腸癌組織標本經(jīng)10g/dl 甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片4 μm，脫蠟，梯度乙醇脫水，加入3g/dl H2O2室溫孵育清除內(nèi)源性過氧化物酶活性，置入枸櫞酸鈉修復液進行抗原修復至冷卻，后以正常山羊血清工作液封閉，滴加一抗4℃孵育過夜（PBS 緩沖液代替一抗做陰性對照），再滴加二抗孵育，后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液孵育；DAB 溶液顯色，蒸餾水沖洗終止反應，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片；顯微鏡下觀察目標蛋白表達情況。

結(jié)果判讀：鏡下進行細胞計數(shù)，顯示細胞胞漿、膜內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆?；蚣毎顺首攸S色即為陽性顯色，隨機觀察5 個視野，采用二次計分法：①染色強度：棕褐色（3 分），棕黃色（2 分），淡黃色（1 分），無色（0 分）；②陽性細胞率：陽性細胞率＞75%（4分），51%～75%（3 分），10%～50%（2 分），＜10%（1 分）。計算兩者乘積，0 分為陰性記為“-”，1 ～3分為弱陽性記為“+”，4～8分為中等陽性記為“++”，9 ～12 分為強陽性記為“+++”。

1.3.3 RT-PCR 法檢測結(jié)直腸癌組織中ZNF139 mRNA 表達：采用Trizol 法經(jīng)吹打、裂解、離心等提取細胞總RNA，測定A260nm/A280nm值及RNA 濃度；于無RNA 酶的PCR 反應管加入反應體系及試劑進行變性反應處理，后加入逆轉(zhuǎn)錄酶并按照說明書進行孵育反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20℃低溫中保存?zhèn)溆?；采用RT-PCR 試劑盒，經(jīng)變性、退火、延伸、循環(huán)反應條件進行PCR 擴增，后行產(chǎn)物實時定量PCR 分析，檢測反應產(chǎn)物的特異性及基因表達情況；并以GAPDH 為參照，計算目標基因在各組織中的mRNA 相對表達量。

1.3.4 隨訪：術(shù)后通過電話及門診復查等方式對入組結(jié)直腸癌患者進行為期5年的隨訪，隨訪截止時間為2019年6月，以患者死亡或隨訪結(jié)束為終止時間。

1.4 統(tǒng)計學分析 使用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0 處理數(shù)據(jù)，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間行獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用n（%）表示，ZNF139 表達與臨床病理間的相關(guān)性采用χ2檢驗；采用K-M 生存曲線繪制ZNF139 陽性及陰性患者預后5年總生存率，采用Log-rank 法檢驗；COX 回歸模型進行預后生存單、多因素分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF139 mRNA 及蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達 免疫組織化學染色顯示，ZNF139 蛋白主要定位于細胞核和細胞質(zhì)中，呈黃至棕褐色顆粒；結(jié)直腸癌組織中ZNF139 蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織及正常組織[35（52.24%）vs 19（28.36%），13（19.40%）]，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.941，15.711，均P＜0.001）。癌旁組織與正常組織中ZNF 13P 蛋白陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（χ2=1.478，P=0.224）。

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中ZNF139 mRNA 水平明顯高于癌旁組織及正常組織（0.651± 0.130 vs 0.217±0.070，0.201±0.052），差異有統(tǒng)計學意義（t=24.060，24.947，均P＜0.001）。癌旁組織和正常組織中ZNF139miRNA 表達水平差異無統(tǒng)計學意義（t=1.502,P=0.136）。

2.2 ZNF139 mRNA 及蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年齡、性別和腫瘤直徑對結(jié)直腸癌組織中ZNF139 mRNA 表達無影響（均P＞0.05）；腫瘤病灶浸潤程度、TNM分期與ZNF139 mRNA 表達呈正相關(guān)，即浸潤程度和TNM 分期越高的結(jié)直腸癌組織中ZNF139 mRNA 表達水平越高（均P＜0.05）；腫瘤分化程度與ZNF139 mRNA 表達呈負相關(guān)，低/未分化組織中ZNF139 mRNA 表達水平明顯高于中/高度分化組織（P＜0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病灶組織中ZNF139 mRNA 表達水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織（P＜0.05）。ZNF139 蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系分析，年齡、性別和腫瘤直徑對結(jié)直腸癌組織中ZNF139 蛋白陽性表達均無明顯相關(guān)（均P＞0.05），腫瘤病灶浸潤程度、TNM 分期與ZNF139 蛋白陽性表達呈正相關(guān)，即浸潤程度和TNM 分期越高的結(jié)直腸癌組織中ZNF139 蛋白陽性表達率越高（P＜0.05）；腫瘤分化程度與ZNF139 蛋白陽性表達呈負相關(guān)，低/未分化組織中ZNF139 蛋白陽性表達率明顯高于中/高度分化組織（P＜0.05）；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病灶組織中ZNF139 蛋白陽性表達率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織（P＜0.05）。

表1 ZNF139 mRNA 和蛋白表達與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 ZNF139表達與結(jié)直腸癌預后的關(guān)系 見圖1。對67 例結(jié)直腸癌患者進行隨訪，均獲得完整隨訪資料，時間截止到患者死亡或2019年6月。根據(jù)ZNF139 表達情況，將入組患者分為ZNF139 陽性組（n=35）和ZNF139 陰性組（n=32），采用Kaplan-Meier 生存曲線分析ZNF139 表達與結(jié)直腸癌患者預后生存的關(guān)系，結(jié)果顯示ZNF139 陽性組患者5年總生存率為51.43%（18/35），ZNF139 陰性組患者5年總生存率為75.0%（24/32），Log-rank 檢驗ZNF139 陰性組患者總體生存率大于陽性組患者，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=3.391，P=0.047）。

圖1 ZNF139 陽性和陰性結(jié)直腸癌患者預后5年生存率

2.4 結(jié)直腸癌患者預后相關(guān)因子COX 回歸分析見表2, 表3。COX 回歸單因素分析顯示，ZNF139表達、臨床TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤程度與結(jié)直腸癌患者總體預后顯著相關(guān)（均P＜0.05），是影響其總體預后的危險因素。后將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的變量進行COX 多因素分析，結(jié)果顯示ZNF139 表達（HR：2.249，95%CI：1.359 ～3.712，P=0.003）、臨床TNM 分期（HR：2.016，95%CI：1.230～3.327，P=0.006）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR：2.125，95%CI：1.302～3.469，P=0.002）是影響結(jié)直腸癌患者總體預后的獨立因素。

表2 結(jié)直腸癌患者總體預后COX 單因素回歸分析

表3 結(jié)直腸癌患者總體預后COX 多因素回歸分析

3 討論

結(jié)直腸癌主要起源于結(jié)腸或直腸上皮黏膜組織，是一種臨床常見的惡性腫瘤疾病，在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率[6]。結(jié)直腸癌患者早期無特征性癥狀表現(xiàn)，便血癥狀與痔瘡類似，難以鑒別，診斷檢出率較低，容易延誤最佳治療時機，當出現(xiàn)典型癥狀時病情往往已進展至中后期，治療難度加大，患者預后欠佳，五年生存率較低。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展受細胞侵襲、遷移、細胞外基質(zhì)降解及腫瘤血管形成等病理改變的調(diào)控[7]。因此，提高結(jié)直腸癌早期診斷檢出率是臨床研究的重點，進一步探究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，找尋更加靈敏的生物標志物及新的治療靶點，對提高結(jié)直腸癌早期診斷效率具有積極意義。

近年鋅指蛋白家族在結(jié)直腸癌分子調(diào)控過程中嶄露頭角，鋅指蛋白因結(jié)構(gòu)形似“手指”命名，其由多個半胱氨酸或組氨酸組成，能夠結(jié)合Zn2+，可通過自主折疊形成穩(wěn)定的四面體結(jié)構(gòu)[8]。大量研究表明[9]，鋅指蛋白特殊的指狀結(jié)構(gòu)能夠識別結(jié)合DNA，RNA 序列，干預基因的轉(zhuǎn)錄表達，其作為重要的人體轉(zhuǎn)錄因子參與分化、增殖、代謝、信號轉(zhuǎn)導等生物學過程，且發(fā)現(xiàn)人類基因組中約有1%序列編碼是含有鋅指的蛋白質(zhì)。并證實鋅指蛋白在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，是腫瘤診斷及預后預測的重要標志[10]。鋅指蛋白139（ZNF139）是Krüppel 家族成員，其基因位于染色體7q21.3-q22.1，是一種轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白[11]。實驗表明[12]，Krüppel 家族鋅指蛋白能夠調(diào)控細胞多種生理過程及相關(guān)基因的表達和轉(zhuǎn)錄，介導腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤耐藥。發(fā)現(xiàn)人先天性裂手/足畸形及血液系統(tǒng)惡性腫瘤基因重排與ZNF139 基因缺失密切相關(guān)，因此將ZNF139 基因列為評估疾病發(fā)展、惡化的參考指標之一[13]。近年在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的研究表明，ZNF139 參與調(diào)控靶基因區(qū)域或靶蛋白的活性[10]。據(jù)報道，肺癌患者病灶組織中ZNF139 水平高表達，且隨著肺癌治療化療藥物用量增加，ZNF139 表達水平逐漸升高，提示ZNF139基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥情況密切相關(guān)[14]。骨肉瘤組織中ZNF139 表達明顯高于正常組織，猜測ZNF139 可能參與骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展[15]。胃癌組織中ZNF139 高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，提示ZNF139 基因可能參與胃癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移過程[16]。此外還發(fā)現(xiàn)，ZNF139 通過上調(diào)多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）的表達可介導胃癌耐藥的發(fā)生，沉默ZNF139 能夠抑制腫瘤細胞的生物學功能[17]。ZNF139 通過激活PI3K/AKT 通路促進了膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲[4]。提示ZNF139 與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，故進一步研究其在腫瘤中的表達作用有助于探尋新的結(jié)直腸癌治療靶點。本研究基于臨床病理及預后探究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌病灶組織中ZNF139 mRNA 及蛋白陽性表達率明顯高于癌旁組織和正常組織；ZNF139 表達與臨床分期、浸潤程度、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示ZNF139 高（陽性）表達患者浸潤程度越深，臨床分期越高，分化越低，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明ZNF139 基因與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展和惡性程度密切相關(guān)；通過分析預后顯示ZNF139 陰性表達患者具有良好的5年總生存率，ZNF139 表達是影響預后的獨立危險因素之一，提示ZNF139 基因可能以某種機制參與調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，可作為結(jié)直腸癌臨床診斷及評估預后的參考指標。故可將ZNF139 基因表達參與調(diào)控結(jié)直腸癌惡性進展的作用及其相關(guān)分子機制作為后期研究的方向。

綜上所述，ZNF139 在結(jié)直腸癌組織中高（陽性）表達與結(jié)直腸癌的分化、浸潤、TNM 分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與演變；同時ZNF139 表達是影響其患者預后的獨立危險因素，可作為臨床診斷及評估預后的參考指標，值得在臨床中進一步研究。